Domande Fermentazioni

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La coltura batch: aspetti cinetici ed equazione di Monod

Un aspetto fondamentale per gestire una coltura batch è il tempo di generazione di una coltura, ovvero il tempo di duplicazione e quindi il tempo necessario alla biomassa per raddoppiare la sua popolazione. Questo viene calcolato in fase esponenziale quando il microrganismo non ha limitazioni. Ponendo in un grafico sull’asse delle x il tempo e su quello delle y i valori della duplicazione, si ottiene una curva che è diversa in base al tipo di microrganismo, del terreno colturale e delle condizioni di contorno che, se sono ottimali, corrispondono a un tempo breve. I batteri in genere hanno un tempo di duplicazione inferiore a 1 h, mentre i lieviti hanno una maggiore complessità della struttura cellulare e quindi necessitano di più tempo.

In generale, si fa riferimento a un fattore moltiplicatore pari a 2 in quanto da una cellula madre si ottengono due cellule figlie. In fase esponenziale, il tempo di duplicazione è costante ed è detto t_D. In questo modo si può calcolare la biomassa a un determinato tempo, dove t/t_D = n, ovvero il numero di generazioni. Se ad esempio t = 3t_D, allora n = 3 e quindi X_t = 8 X₀.

Un altro parametro fondamentale è la velocità di sviluppo μ che in fase esponenziale è lineare e costante ed è riferita all’unità di massa; in particolare, la variazione di biomassa nel tempo è costante ed è legata alla biomassa di cellule X e alla velocità specifica di crescita μ: μX = dX/dt espressa in g/L o come numero di cellule ed è valida anche per microrganismi filamentosi.

La velocità specifica di crescita μ è riferita all’unità di massa, quindi è legata al tipo di microrganismo e all’ambiente e alla velocità volumetrica in quanto μ = v vol/m, dove la velocità volumetrica è espressa in g/L h, quindi esprime le cellule prodotte ogni L h. Da questo si ricava che la velocità di sviluppo si misura in un t^-1 ed è una proprietà intrinseca che descrive lo stato istantaneo della coltura.

La velocità di sviluppo e la velocità volumetrica hanno variazioni diverse durante lo sviluppo e spesso i loro massimi non coincidono; la velocità specifica è 0 nella fase di latenza in quanto non si ha sviluppo, poi nella fase di accelerazione aumenta fino al massimo dove rimane per tutta la fase esponenziale. Con la fase di decelerazione diminuisce a causa del substrato limitante e nella fase stazionaria è pari 0 fino alla successiva diminuzione nella fase di morte. La velocità di sviluppo può essere misurata con lettori di torbidità per microrganismi unicellulari che sono fatti da multi-piastre che misurano la densità della coltura nel tempo, quindi le variazioni di OD. Si ottengono così delle curve e analizzando la parte lineare si può calcolare il coefficiente angolare che corrisponde alla velocità di sviluppo massima.

La μ max può essere determinata per via grafica Log cell/ml facendo la conta totale di un microrganismo calcolando il numero di cellule/mL a tempi previsti: i dati vengono trasformati in log e successivamente si crea un grafico a dispersione con il tempo sull’asse delle x e sull’asse delle y il log delle cellule/mL. La velocità di sviluppo massimo si va a determinare come il coefficiente angolare della parte lineare della curva che corrisponde alla velocità massima.

Infine, un altro parametro importante è la resa di conversione che è data dal rapporto tra prodotto e substrato o tra la biomassa ottenuta e il substrato utilizzato Y = X/S e quindi X = Y (S – S₀). La resa va quindi ad esprimere l’efficienza delle cellule nella conversione del substrato. Y è un numero puro e in genere per le biomasse è pari a 0,5, tuttavia parte del substrato viene utilizzato per regolare il pH, per la mobilità e quindi non viene convertito tutto in ATP.

Monod ha poi quantificato il rapporto tra substrato e velocità di crescita con un’equazione:

μ S = μ_max S / (K_s + S)

dove K_s è la costante di saturazione per il substrato limitante, ovvero la concentrazione di substrato a cui il microrganismo si sviluppa a ½ μ_max.

Coltura batch: definizione di Ks e relazione con μ

Monod ha poi quantificato il rapporto tra substrato e velocità di crescita con un’equazione:

μ S = μ_max S / (K_s + S)

dove K_s è la costante di saturazione per il substrato limitante, ovvero la concentrazione di substrato a cui il microrganismo si sviluppa a ½ μ_max.

Per la determinazione di K_s è necessario fare una serie di prove con lo stesso terreno e variando un componente del substrato per diverse concentrazioni, come ad esempio il glucosio. Per ogni concentrazione si calcola la velocità di sviluppo massima e si crea un grafico con la concentrazione di substrato S sull’asse x e sull’asse delle y la velocità di sviluppo μ. Fino a quando il S è in eccesso, la velocità di sviluppo massima rimane costante, ovvero in fase esponenziale; quando il substrato diventa limitante si ha una diminuzione dello sviluppo e la curva piega verso l’origine degli assi. Dal grafico è così possibile determinare K_s, ovvero la concentrazione di S a ½ μ_max; in questo modo K_s viene determinata sperimentalmente.

Tuttavia, quando si fanno prove a basse concentrazioni di S, si possono fare degli errori nella determinazione di K_s e quindi si linearizza l’equazione di Monod facendo i reciproci:

1/μ = (K_s/μ_max) * (1/S) + 1/μ_max

Ottenendo:

1/μ = 1/μ_max + (K_s/μ_max) * (1/S)

che corrisponde a un’equazione di una retta come Y = mx + q. Si costruisce quindi la retta su un piano cartesiano con 1/S sull’asse delle x e 1/μ sull’asse delle y; l’intercetta sull’asse delle y è data da 1/μ_max e quindi è così possibile calcolare μ_max, mentre il coefficiente angolare è pari a K_s/μ_max, quindi è possibile così calcolare K_s. K_s indica l’affinità del microrganismo per il substrato e si trova al denominatore dell’equazione di Monod, quindi si ha una relazione inversa rispetto a μ; questo implica che a un alto valore di K_s, si ha una bassa affinità per il substrato, mentre a un valore basso di K_s, si ha un’alta affinità.

In base alla tipologia di substrato, le curve possono essere diverse in quanto si può avere una repentina diminuzione con una fase logaritmica pronunciata e quindi si ottiene un K_s basso e un’alta affinità; oppure si può avere una decelerazione lunga perché il substrato diventa limitante anche ad elevate concentrazioni e quindi si ottiene una K_s alta. In un processo batch, la K_s deve essere bassa e in questo modo diventa trascurabile nell’equazione, ottenendo quindi μ = μ_max; questo è possibile utilizzando un substrato idoneo allo sviluppo che si verifica per molto tempo a μ_max. Il processo è ottimizzato e si ottengono alte rese in un tempo minore e quindi con costi minori.

Coltura continua: parametri coinvolti e bilanci di biomassa e di substrato

La coltura continua è un prolungamento della coltura batch e quindi consente una riduzione dei tempi morti; è un sistema aperto con un flusso in ingresso di terreno colturale e un flusso in uscita di coltura, substrato residuo, cellule e metaboliti, quindi il volume è costante. Quando si imposta una coltura continua i tempi di produzione sono molto maggiori rispetto a quelli di carico e di scarico: dal tempo zero si ha la crescita del microrganismo fino a quando la curva di sviluppo non diventa parallela all’asse del tempo; questo succede in quanto la quantità di cellule che crescono è uguale a quella che viene dilavata ottenendo una curva della biomassa costante per molto tempo.

I parametri fondamentali della coltura continua sono il volume V del reattore che rimane costante durante il processo e viene espresso in L o m³, i flussi in ingresso e in uscita che sono costanti ed espressi in L/h o m³/h, S₀ è il substrato in ingresso, S è il substrato residuo che è sempre presente in uscita, X è la concentrazione di biomassa nel flusso in uscita; si ha poi D che è la velocità di diluizione ed è data dal rapporto tra il flusso e il volume: D = F/V, dove V è costante e F in ingresso è uguale a F in uscita e quindi D si misura in 1/h. Il reciproco di D è il tempo di residenza che si misura in h ed è il tempo medio di stazionamento delle cellule prima di essere dilavate, detto anche holding time 1/D.

La coltura continua può essere monostadio, ovvero con il reattore e il flusso di uscita va in un tank dove viene periodicamente accumulato e successivamente lavorato nel downstream, oppure multistadio, dove quello che esce dal primo reattore diventa il flusso di ingresso di un secondo reattore e così via, quindi si sfrutta al massimo la possibilità che il microrganismo ha di usare anche il residuo che esce dal primo fermentatore.

Quando si allestisce una coltura continua, si parte da una coltura batch fino alla fase esponenziale dove si ha l’attivazione del flusso in ingresso e in uscita e da questo punto in poi la concentrazione di biomassa è parallela al tempo, quindi si ha un equilibrio tra sviluppo e dilavato, ovvero la velocità di sviluppo equivale alla velocità di uscita delle cellule. Per avere l’equilibrio la velocità D deve essere minore di μ_max e la produzione di biomassa deve essere costante, quindi la stabilità si ha se il tempo di residenza Tr è maggiore di D; il Tr si calcola come 1/D e quando è maggiore del valore D si raggiunge lo steady state, ovvero una situazione di equilibrio. Se invece Tr è minore di D, il microrganismo viene dilavato prima di utilizzare il substrato e questo avviene con un flusso pari a D critico.

Nella coltura continua è importante valutare il rapporto tra D e X e S in quanto si possono avere diverse situazioni: se D è molto alto e maggiore a D critico, allora il microrganismo viene dilavato prima di utilizzare il substrato, quindi è una situazione molto instabile che non viene applicata. Se D è uguale a μ_max e quindi a D critico si ha la situazione ottimale in quanto si sfrutta la massima potenzialità del microrganismo ma è molto instabile in quanto se il flusso D aumenta leggermente si verifica la condizione di wash-out. La condizione migliore è lavorare a D minore di D critico e minore di μ_max, in quanto in questo modo si raggiunge lo steady state, si lavora a velocità di sviluppo minore di quella massima ma si ha un’autoregolazione; in genere si utilizzano valori di D compresi tra ½ D e ⅔ D.

Nella coltura continua bisogna considerare dei bilanci: di biomassa, la cui variazione nel tempo è data dalla differenza tra la crescita del microrganismo e lo scarico in uscita. Il raggiungimento dello steady state si ha quando non avviene una variazione di biomassa, quindi si ha una costanza della concentrazione cellulare e la velocità di sviluppo equivale quella di uscita, quindi dX/dT = 0 e μx = Dx, ovvero μ = D = F. Di conseguenza, se F è alto, lo sviluppo è elevato.

Si ha poi un bilancio di substrato, la cui variazione è data dalla differenza tra input, output, S usato per lo sviluppo e S usato per fare prodotto. Per raggiungere lo steady state, il substrato non deve variare nel tempo, quindi dS/dT = 0 e perciò S₀ – S = X/Y. Da questi bilanci si capisce che variando i flussi è possibile variare la velocità di sviluppo microbico: ponendo in un grafico sull’asse x il valore di D e sull’asse delle y la concentrazione di biomassa X o di substrato S, all’origine degli assi D = 0, quindi si è in condizioni batch dove la concentrazione biomassa è massima e il substrato viene consumato. Quando si attivano i flussi, la biomassa diminuisce e aumenta il substrato residuo fino a D critico, ovvero il punto in cui si ha un crollo repentino della biomassa in quanto la velocità dei flussi è troppo elevata e quindi il microrganismo viene subito dilavato e rimane soltanto il terreno colturale.

Anche nel caso della coltura continua, si può valutare il parametro K_s, ovvero la concentrazione di substrato per cui il microrganismo si sviluppa ½ μ_max; K_s indica l’affinità del microrganismo per il substrato e minore è la K_s, maggiore è l’affinità. In particolare, guardando sempre la curva D/S o X si nota che con un K_s basso la concentrazione di biomassa rimane per più tempo a valori elevati prima di D critico e il substrato residuo è minore; nel caso invece di K_s elevata, si ha una bassa affinità e quindi la concentrazione di biomassa inizia a diminuire prima in quanto il microrganismo soffre di più e il substrato residuo aumenta.

Approfondimenti coltura continua

Esistono due modi per fare una coltura continua: usare un reattore tradizionale agitato STR standard con una valvola per l’ingresso di substrato e una valvola con l’uscita di coltura e un sistema di agitazione meccanica ottenendo un sistema omogeno dall’inizio alla fine, dove si ha un continuo ingresso di S e una continua fuoriuscita di brodocoltura. Si ha un sistema non più chiuso ma aperto. Oppure si fa fare alla coltura un percorso lungo un reattore tubolare, quindi si ha un sistema eterogeneo perché all’inizio del reattore si hanno poche cellule e molto substrato e man mano che la coltura compie il percorso verso l’uscita i microrganismi usano il substrato, fanno prodotto e crescono, quindi si hanno più microrganismi che S.

La coltura continua può essere allestita in due modi diversi:

• Il chemostato è una delle metodiche più utilizzate; si ha una pompa che gestisce l’ingresso del terreno che deve lavorare in sincrono con la pompa che gestisce l’uscita che va in un altro serbatoio e poi al downstream; si hanno il bioreattore con due serbatoi, i filtri per sterilizzare il terreno o altri metodi sterilizzazione e il fermentatore in cui si ha volume costante. Il substrato non è mai in eccesso, non si lavora a velocità massima e la concentrazione di S influenza la velocità di crescita (limitante). Questo tipo di bioreattore ha un controllo esterno perché l’operatore aumenta o diminuisce la concentrazione di substrato e quindi influenza la velocità di sviluppo microbico.
• La seconda procedura è il turbidostato dove si hanno il fermentatore, una pompa in ingresso e la scarico della coltura ma il terreno è formulato con un eccesso di substrato, il microrganismo cresce a velocità massima e una fotocellula misura la torbidità del sistema che quando raggiunge il setpoint impostato si attiva automaticamente, si scarica una quota di coltura e si carica nuovo terreno colturale. Se si riesce a regolare il sistema tra carico e scarico e la torbidità rimane costante; il controllo è interno e il microrganismo cresce a velocità massima e poi viene scaricato. Tutti gli elementi sono in eccesso e il microrganismo cresce a μ max.

La condizione fondamentale del chemostato è che il volume della coltura deve rimanere costante e uno dei problemi più importanti è che nelle colture areate si ha una parte del terreno colturale che può essere evaporato con lo sfiato; nel fermentatore dalla parte agganciata in basso si ha uno sfiato che consente l’uscita dei gas di scarico che se sono molto umidi ciò che esce è anche una parte dell’acqua presente nella formulazione. Per evitare questo, si aggancia un condensatore ai gas in uscita che è un serpentino in cui circola acqua fredda e l’aria che esce dallo sfiato a contatto con l’ambiente freddo condensa l’umidità presente nell’aria e ricade nel fermentatore. Ci sono diversi metodi per gestire il controllo del volume:

• Il dispositivo a troppo pieno è fatto da una tubazione che consente lo scarico della coltura quando arriva al livello della tubazione agganciata al fermentatore; è un sistema semplice e la tubazione può essere interna al fermentatore o un braccio esterno in cui la coltura cade. Le problematiche possono essere ad esempio la formazione di schiuma perché vi possono essere adese le cellule, la presenza di microrganismi filamentosi e di paraffine; per risolvere questo problema si applica alla tubazione un dispositivo a T finale oppure si può avere un sistema di recupero delle cellule che vengono riciclate nel reattore.
• Esistono sistemi di livello variabile, ovvero la tubazione in uscita è agganciata nella parte bassa a una vite e il tubo può essere alzato o abbassato in funzione del volume di coltura con cui si vuole lavorare. Questo dispositivo variabile è più versatile ma bisogna fare attenzione all’usura della guarnizione.
• I dispositivi a pompa sono più costosi ma generalmente più impiegati: il punto di prelievo è sotto il livello massimo del volume del fermentatore e la portata della coltura è regolata dal movimento della pompa (di solito peristaltica); la cosa più comoda è usare pompe.