Fermentazioni industriali

Biotecnologia

Biotecnologia è una scienza che si compone di due parti:

• Lo studio degli esseri viventi e delle leggi che li governano (bio)
• L'applicazione e uso di tecniche applicabili per la soluzione di problemi pratici e per l'ottimizzazione di procedure (tecnologia).

Nella biotecnologia microbica, queste tecnologie sono applicate ai microorganismi ma anche ai parametri di processo per ottenere colture, prodotti scelti e selezionati e trasformarli. Si intendono tutti i sistemi biologici, dalle singole cellule alle loro componenti, per ottenere beni e servizi (depurazione degli effluenti, lieviti da pane).

Tipi di biotecnologia

In funzione delle applicazioni, si distinguono diversi tipi di biotecnologia:

• Rossa: Ambito farmaceutico biomedico, per esempio con screening di microorganismi con attività di produzione di molecole farmacologiche (come le statine, per abbassare i livelli di colesterolo nel sangue), o per editing genetico (con sostituzione di geni mutati coinvolti in specifiche patologie).
• Bianca: Si riferisce alla messa a punto e ricerca di microrganismi in grado di produrre molecole che abbiano ricadute a livello industriale, come enzimi per la decolorazione di tessuti o pectinasi che riducono la viscosità dei succhi di frutta. Il fatturato annuo di questa risulta il più elevato, in quanto gli enzimi prodotti hanno moltissimi ambiti di applicazione.
• Verde: Applicazione in produzione primaria, agricoltura, ambiente e produzione di bio-fertilizzati e fitofarmaci che contribuiscono a limitare l'impatto sull'ambiente dei fertilizzanti tradizionali ottenuti per sintesi chimica. Tra queste novità si ha il mais BT (tossina B. thuringiensis, che agisce contro l'esoscheletro di alcuni parassiti della pianta e funge da fitofarmaco autoprodotta dalla pianta).
• Blu: Sfruttamento di microrganismi che normalmente risiedono nelle acque, di lago, di fiume, di mare ecc. I microrganismi che abitano in questi habitat hanno caratteristiche particolari, per esempio nelle zone delle solfatare avranno maggior resistenza a sostanze e calore.

Biotecnologie tradizionali e innovative

Le biotecnologie sono normalmente divise in tradizionali e innovative, dove le tradizionali sono quelle utilizzate in agricoltura e zootecnia, o nelle attività fermentative, mentre le innovative prevedono manipolazione del materiale genetico con ingegneria genetica e applicazione in settori industriali.

Rischi e benefici delle biotecnologie

Le biotecnologie possono essere un rischio se applicate senza regole, in quanto tutte le azioni svolte devono essere effettuate tutelando i diritti individuale, l'ambiente e la biodiversità, l'economia e il sociale. L'economia circolare è alla base di questa tutela e si basa sull'utilizzo di materie e energie rinnovabili con la biotecnologia (microrganismi che riducono la cellulosa o monomeri per sostituire plastiche) che consentono di sfruttare al massimo materiali riducendone impatto sull'ambiente e sulle spese nelle nuove produzioni.

La sintesi chimica è ancora conveniente per la produzione di molecole semplici e piccole che possono essere funzionali come monomeri per fibre tessili e plastiche, in più non vi sono molti microrganismi in grado di fornire questi prodotti. Invece la biotecnologia produce molecole complesse sia funzionalmente che strutturalmente (antibiotici, proteine, enzimi). Si ha una zona di competizione a livello di molecole semplici a livello strutturale, come l'acido lattico che può essere prodotto da entrambe le vie.

Per l'ottenimento e recupero di un bioprodotto bisogna effettuare una vera e propria purificazione in funzione del grado di purezza desiderato, deve essere isolato in forma stabile e deve essere minimamente rischioso per personale e impianto, con recupero dei costi per il processo effettuato (con profitto dunque).

Metaboliti primari e secondari e rapporti con lo sviluppo microbico

Supponendo un inoculo, nel corso del processo il microorganismo cresce e accumula componenti. Queste componenti possono essere classificate come metaboliti primari e secondari.

Il metabolita primario è prodotto in fase di crescita del microorganismo, quindi mentre produce altre cellule, mentre il secondario quando finisce di crescere, in fase stazionaria. I metaboliti secondari hanno struttura più complessa dei primari: più il metabolismo del microorganismo è evoluto più cresce la complessità del prodotto secondario creato.

Il metabolismo microbico si compone di due fasi: catabolica e successivamente anabolica. Il microorganismo viene inoculato, e la prima cosa che fa è degradare i costituenti del terreno colturale per produrre energia e intermedi interessanti. Solo dopo ha inizio la fase anabolica detta anche di biosintesi di nuovi componenti e quindi di nuove cellule. Sono processi finemente regolati, perché il microorganismo non spreca energia.

Il metabolismo anaerobico, tipico dei lattici, avviene in assenza di ossigeno, e permette di accumulare spontaneamente alcuni prodotti, come l'acido lattico. I microrganismi che lo compiono possiedono un metabolismo molto semplice: dal substrato sono prodotti degli intermedi, energia e potere riducente (NADH), e poco ATP. Il substrato in questo caso viene utilizzato soprattutto in fase catabolica, poiché producendo poca energia non ne hanno a sufficienza per produrre metaboliti in eccesso, quindi vengono accumulati in maniera spontanea metaboliti finali. Questo avviene perché per avere più ATP possibile devono fare molto lavoro, e rigenerare potere riducente a NAD, con trasferimento di elettroni e idrogeno non all'ossigeno.

Gli aerobi hanno un metabolismo più complesso, e permette di ottenere accumuli di intermedi metabolici che serviranno per reazioni utili al microorganismo. In questa fase il glucosio diviene acido piruvico e passa per il ciclo di Krebs trasformandosi fino alla catena di trasporto degli elettroni. Consentono di produrre molta più ATP, con produzione di moltissimi intermedi e anabolismo molto maggiore rispetto al catabolismo. L'energia prodotta è molto superiore rispetto all'anaerobio, con 38 ATP per ogni molecola di glucosio, rispetto ai 2 ATP dell'anaerobio. Il NADH si rigenera a NAD trasferendo elettroni all'ossigeno, con formazione di acqua, e non acidi. Il ciclo di Krebs è detto anfibolico, in quanto i prodotti generati sono necessari per la produzione di composti importanti, come amminoacidi, acido citrico, acido succinico.

Gli anaerobi producono metaboliti finali, generalmente primari, spontaneamente accumulati in quantità significative, con poca produzione di cellule e ATP. Invece i microorganismi aerobi producono molta biomassa, quindi cellule, acqua e anidride carbonica, senza accumuli significativi di intermedi metabolici (finemente regolato). Questi ultimi si trovano appena sotto la superficie, dove trovano più ossigeno, mentre gli anaerobi sul fondo della provetta.

È più opportuno utilizzare gli anaerobi per la produzione di metaboliti spontaneamente accumulabili, mentre se sono necessari dei prodotti da aerobi bisogna regolarne il metabolismo con l'utilizzo di un terreno sbilanciato e accumulo non spontaneo. Per accumulare composti bisogna regolare la sintesi e l'attività degli enzimi coinvolti, in quanto biocatalizzatori necessari per la produzione di metaboliti.

Sintesi degli enzimi

È importante definire quali tipi di enzimi sono coinvolti nella produzione di questi metaboliti. Si classificano come:

• Enzimi costitutivi: Sono sempre formati, presenti nella reazione.
• Enzimi inducibili: Sintetizzati solo in presenza di un induttore (elemento del terreno colturale) che può essere aggiunto o prodotto in fasi successive del metabolismo.

Attività degli enzimi

La concentrazione di metaboliti è funzione dei sistemi di controllo dell'attività enzimatica:

• Inibizione: Fenomeno che avviene sull'attività enzimatica.
• Repressione: Agisce sulla sintesi dell'enzima.

Per produrre le amilasi bisogna aggiungere amido nel terreno, essendo queste inducibili. Quindi ad esempio Aspergillus riesce a crescere normalmente senza amilasi in presenza di glucosio, ma con aggiunta di amido deve essere in grado di degradarlo e sintetizza amilasi, idrolizzando quindi l'amido.

Vie metaboliche

Lineare

Si tratta di meccanismi di controllo semplici che funzionano basandosi su due processi che agiscono in sinergia:

1. Inibizione: Esplicata dal prodotto finale sull'attività del primo enzima della via metabolica, detta anche inibizione da feedback: quando P si accumula in quantità consistenti, si inibisce l'attività del primo enzima dell'attività metabolica, bloccando la produzione. Quindi quando P si accumula, blocca l'attività di E1 e la produzione di B, e quindi a catena di tutto il resto. Ciò avviene in un metabolismo fisiologico.
2. Repressione: Esplicata dal prodotto sulla sintesi di uno o più enzimi della via metabolica, quindi si blocca o reprime la sintesi dei vari enzimi della via metabolica, non solo il primo, quindi si può bloccare la produzione di E1, E2 o E3 a seconda di ciò che si vuole produrre e ottenere.

Ramificate

Sono meccanismi di controllo complessi. I metaboliti prodotti non sono generalmente necessari in livelli analoghi e quindi sono sintetizzati in diversa concentrazione. Sia P1 che P2 danno inibizione da feedback sul primo enzima ma possono agire anche come repressori o con entrambe le funzioni contemporaneamente.

Facendo così bloccano però E1, causando un rischio e un possibile blocco nella produzione di entrambi i prodotti, anche di quello interessato. L'inibizione dei singoli prodotti sul primo enzima causa una inibizione della rispettiva via metabolica dopo la ramificazione (E2-E3). Il gioco sta nel capire come inibire una ramificazione e l'altra no, quindi inibendo solo E2 o E3. È un meccanismo che permette l'accumulo di uno dei due prodotti in funzione delle esigenze della cellula.

Se voglio che il prodotto finale si accumuli senza modificare l'attività o la sintesi del primo enzima, è possibile allontanare il prodotto finale tramite modificazione della permeabilità cellulare. Si favorisce quindi la fuoriuscita di un metabolita sintetizzato (e accumulato) nella cellula, facendo sì che la quantità di P sia scarsa e non scatti di conseguenza l'inibizione dell'enzima. Un esempio di questi metaboliti allontanati è l'acido glutammico, intracellulare, che si accumula con scatto della inibizione e repressione. Il microorganismo viene alterato quindi a livello di permeabilità della membrana, quindi P esce e faccio intendere alla cellula che P sia sempre basso, in quanto fuoriesce, in questo modo continua a produrlo.

Blocco metabolico

Se interessa un prodotto che in realtà è un intermedio, si va a bloccare l'attività e la sintesi dell'enzima che trasforma l'intermedio di interesse nel prodotto successivo (quello che trasforma D in E), senza però ridurre la produzione di P. Se P non si produce più, si blocca anche l'inibizione dell'enzima iniziante, con conseguente accumulo. Il blocco di un enzima “a valle” ha un certo successo. Si accumula D ma bisogna capire se ha un certo effetto sugli enzimi a monte. Il blocco metabolico fa sì che il microorganismo diventi incapace di sintetizzare il prodotto finale, i cui livelli controllano l'attività di un enzima con ruolo chiave sulla via metabolica.

Accumulo di un metabolita non associato allo sviluppo

Se il metabolita è un prodotto finale è necessario controllare che non inibisca o reprima gli enzimi che si trovano coinvolti all'inizio della reazione, se invece il metabolita di interesse è un intermedio è possibile bloccare il primo enzima a valle, controllando che la via metabolica fino all'accumulo di interesse continui. Per quanto riguarda i metaboliti, è necessario verificare quando vengono prodotti dal metabolismo.

Seguendo la curva di sviluppo microbico, si può vedere come la quantità di un determinato microrganismo incrementi nel tempo fino ad una fase stazionaria in cui il microorganismo non cresce più. Nell'accumulo di un metabolita si riscontrano due fasi:

• Trofofase: È la fase di sviluppo del microorganismo e finisce quando la curva di sviluppo inizia a rallentare.
• Idiofase: Segue la trofofase ed è la fase di biosintesi, dove inizia la stazionaria.

Bisogna capire in quale delle due fasi è prodotto il metabolita e quindi se esso è classificabile come primario o secondario. Se primario, quando diminuisce l'accelerazione del microorganismo, è terminato il processo industriale. Se si vuole un secondario, il processo deve continuare fino a dopo la fase stazionaria, nel quale viene prodotto il composto di interesse.

I prodotti del metabolismo secondario sono detti dell'idiofase, una fase molto specifica per ogni gruppo microbico. I batteri hanno poco metabolismo nell'idiofase, altri come le muffe hanno un metabolismo secondario molto più pronunciato, tant'è che i composti con attività antibiotica sono prodotti per la maggior parte da matrici fungine. Nell'idiofase sono attivi degli enzimi che nella trofofase non lo erano o sono stati repressi, detti anche inducibili. Gli enzimi non sono attivi finché l'accumulo di un certo componente, sintetizzato alla fine dello sviluppo microbico, funge da switch per attivare questo sviluppo metabolico. Questi metaboliti vengono prodotti dopo diversi giorni di coltura, e si accumulano. Sopra una certa soglia possono essere tossici per la cellula stessa, che inizia a limitarne la produzione. L'utilizzo quindi dei ceppi meno sensibili a questa inibizione consentirà alte produzioni del metabolita di interesse, senza rallentamenti.

Questi metaboliti secondari è difficile comprendere da dove arrivino e da dove trovino lo scheletro di partenza, i primari hanno una comprensione chiara e lineare per la via metabolica. Per capire bene la via metabolica e ottimizzarla si effettuano studi di biogenesi. Si cerca di capire che cosa arrivi a cosa, scomponendo la struttura finale cercandone la genesi. Solitamente si usano dei marker, come gli isotopi, che emettono radiazioni. Fornendo queste sostanze al microorganismo, si cerca di capire in che modo sfrutti il substrato e le sue componenti in modo da produrre la sostanza di interesse. Sono alla base per la scelta del terreno colturale e per ottimizzare le condizioni di sviluppo del processo.

Processo di fermentazione industriale

In Europa esiste un ente no profit definito come EFB (Federazione Biotecnologia Europeo) che raggruppa tutte le scienze che lavorano con la biotecnologia, come la microbiologia e l'ingegneria degli impianti, al fine di ottimizzare l'utilizzo di un microorganismo, di tessuti e le loro parti. È necessario affinché ci sia l'uso controllato del materiale biologico. Se si considerano la tecnologia, la microbiologia e la biochimica, si possono ottenere biomasse, molecole sia extracellulari (che produce la molecola e riversa nella parte liquida della sua struttura) che intracellulari (trattenuta all'interno) e prodotti di biotrasformazione (per esempio trasformo glucosio in acido gluconico, con trasformazione selettiva sul C₁ trasformando l'aldeide in un acido) che poi sono disponibili per la vendita.

Da un lato dell'impianto si hanno i serbatoi e i magazzini dove si stoccano le materie prime (carbonio, azoto, minerali e acqua), ad una determinata umidità. Gli ingredienti liquidi si stoccano in silos (come il melasso). L'acqua non può essere distillata se non quella che si usa per sterilizzare un impianto, mentre per il resto si utilizza acqua di rete, eventualmente corretta nel contenuto salino. Tutti questi stoccaggi convogliano in un serbatoio per il terreno colturale, e dopodiché tutto nel fermentatore di utilizzo. Il terreno può essere sterilizzato dentro il fermentatore o nel passaggio dal serbatoio al fermentatore. Una volta che tutto è sterile, inoculo. Procede la fermentazione. Si stoppa l'impianto, il processo è concluso.

Dal fermentatore la coltura viene spostata con separazione della biomassa solida rispetto alla fase liquida. Tutte le operazioni che vanno dalla fase di preparazione del terreno fino alla fermentazione compresa prendono il nome di upstream, mentre il downstream è tutto ciò che va dallo spegnimento del fermentatore fino alla vendita del prodotto sul mercato.

Upstream

Oltre l'approvvigionamento della materia prima, che è insito nel processo, bisogna mantenere e controllare la coltura microbica. È necessario avere una piccola parte dell'impianto munita di laboratorio, cappa, e vari strumenti sterilizzati al fine di prevenire eventuale inquinamento delle colture. Queste colture sono controllate periodicamente in quanto possono essere anche selezionate a seconda di ciò che si necessita, aumentando per esempio una sezione delle colonie che risulta essere più resistente o maggiormente produttore del metabolita che mi interessa. Ciò consente di ottenere sempre un prodotto definito.

Downstream

È fondamentale mettere a punto correttamente la purificazione. Infatti, a seconda di chi lo compra e del suo utilizzo, può avere una purezza diversa (come l'etanolo fino al 96% o fino al 70%). Più un prodotto è puro, più è costoso.

Una volta ottenute le colture, è necessario controllare pH e temperatura. Generalmente il pH scende per l'aumento di acidi organici, mentre la temperatura cresce per reazioni esotermiche. Inoltre, microorganismi come i miceliari creano viscosità nel terreno, facendo sì che si crei ingombro e non funzionino correttamente i dispositivi con conseguenza in alcuni casi di blocchi, per esempio, nell'impianto e nella produzione. Bisogna mantenere inoltre la sterilità. Il tutto tenendo conto dei costi di manutenzione, pulizia e controllo. Una delle problematiche più importanti è il recupero del prodotto da questo “brodo” di coltura.