Enzimi e cinetica enzimatica

Proprietà degli enzimi e affinità per il substrato

La concentrazione massima di substrato (S) è rappresentata sull'asse delle ascisse. Diminuendo la concentrazione di enzima (E), la velocità di reazione (V) diminuisce proporzionalmente.

Quando la concentrazione di substrato è molto inferiore alla costante di Michaelis (K), la reazione è di primo ordine.

Quando la concentrazione di substrato è molto superiore alla costante di Michaelis (K), la velocità della reazione è uguale a V (reazione di ordine zero).

L'affinità di due enzimi diversi per lo stesso substrato può essere determinata attraverso la costante di Michaelis (K). L'enzima 1 ha una maggiore affinità per il substrato rispetto all'enzima 2. In altre parole, maggiore è la quantità di substrato necessaria per raggiungere la metà della velocità massima, minore è l'affinità dell'enzima per il substrato. Il primo enzima riconosce meglio quel determinato substrato poiché lo riconosce a concentrazioni più basse, mentre il secondo enzima è meno affine.

Servirà quindi una quantità maggiore di substrato per far andare la reazione alla stessa velocità. Schematizzando:

• La Km è indirettamente proporzionale all'affinità per il substrato.
• V è direttamente proporzionale alla [E]. Variando E varia V ma non l'affinità tra enzima e substrato (Km).
• K è indipendente dalla [E], cambia se uso enzimi differenti o substrati diversi ma non cambia per lo stesso enzima a concentrazioni diverse. K è una caratteristica insita di un enzima per un determinato substrato.

Unità enzimatica. Molte volte non si conosce con precisione la concentrazione di enzima, in quanto esso può essere disperso in un determinato compartimento cellulare, tuttavia la sua quantità può essere espressa in termini di attività osservata mediante l'unità enzimatica, ovvero la quantità di enzima che catalizza la formazione di 1 micromole di

prodotto in 1 minuto. La quantità di enzima è così misurata in base alla sua efficienza catalitica e non in base alla concentrazione. Numero di turnover o costante catalitica. Il numero di turnover (K) è il numero di molecole di substrato convertite in prodotto per molecola di enzima nell'unità di tempo (per secondo), quando l'enzima è saturato da substrato (altrimenti non è possibile applicare l'equazione di Michaelis-Menten, quando è saturato, l'enzima lavora al massimo della sua potenzialità). Normalmente il numero di turnover corrisponde alla costante di velocità della tappa limitante, ovvero della tappa più lenta del processo (che generalmente è K, la costante di velocità del processo di scissione del complesso ES in E + P). La K si esprime in sec^-1. Il numero di turnover è diverso da enzima ad enzima. Costante di specificità. Nei calcoli eseguiti in

precedenza sulla K vi è una limitazione: non viene tenuta in considerazione la velocità di diffusione della molecola nel solvente. Tenendo conto di questa limitazione è stata calcolata una seconda costante, detta costante di specificità, che è data dal rapporto tra K e K.cat. Questa costante descrive l'efficienza catalitica di un enzima, ovvero la velocità di conversione di ES in E + P, ma tiene conto sia della velocità della catalisi (K.cat) sia dell'affinità tra enzima e substrato (K). È misurata in M sec^-1. Il valore massimo per K/K.cat non può superare quello della diffusione, ovvero la velocità di spostamento di E e di S in soluzione. In soluzione acquosa la velocità di diffusione è circa 10⁹ M sec^-1, gli enzimi perfetti, quelli più efficienti, sono in grado di lavorare a una costante di specificità che si avvicina a questo valore.

dell'attività enzimatica in dipendenza della temperatura. La maggior parte delle reazioni enzimatiche raddoppiano la loro velocità ad ogni aumento di temperatura pari a 10°C finché l'enzima è stabile e pienamente attivo. A temperature maggiori di 50-60°C gli enzimi mostrano un calo di attività; a temperature ancora superiori si ha la denaturazione dell'enzima con conseguente perdita dell'attività catalitica (tranne alcune eccezioni come ad esempio gli enzimi degli organi termofili). Variazione dell'attività enzimatica in dipendenza del pH. Il pH è molto importante per la funzionalità dell'enzima in quanto alcuni residui amminoacidici devono essere in uno stato di ionizzazione specifico per permettere all'enzima di funzionare. Anche valori estremi di pH possono causare la denaturazione della proteina. Gli enzimi hanno un pH ottimale (optimum di pH), o un ambito di pH ottimale, in cui

La loro attività diventa massima; a valori di pH più bassi o più alti la loro attività tende a diminuire. Vi sono enzimi capaci di catalizzare reazioni anche a valori di pH particolarmente acidi o basici: ad esempio la pepsina lavora ad un pH di 1,5 mentre l'arginasi ad un pH di 9,7.

Lo studio della cinetica enzimatica è importante per vari motivi:

• Aiuta a comprendere come lavorano gli enzimi.
• Aiuta a comprendere come lavorano in vivo: le costanti cinetiche K e v sono di estrema importanza per capire come gli enzimi si coordinano tra loro a livello metabolico.
• Permette confronti tra organi e tra specie.
• Può essere usata a scopo clinico-diagnostico.

Linearizzazione dell'equazione di Michaelis-Menten. L'equazione matematica sviluppata da Michaelis e Menten presenta dei limiti; non permette di determinare esattamente il valore di V e di K (=V/2)max poiché questi sono determinati

dall'estrapolazione dell'asintoto a cui tende V per [S] molto elevate. Attraverso la linearizzazione dell'equazione di M.-M. è stato elaborato un secondo grafico detto grafico dei doppi reciproci di Lineweaver-Burk, il cui vantaggio principale è quello di poter determinare con esattezza il valore di V. L'equazione elaborata da Lineweaver-Burk non è altro che l'equazione di una retta dove:

1. S è la variabile indipendente;
2. 1/v è la variabile dipendente;
3. 1/V è l'intercetta con l'asse y;
4. K/V è il coefficiente angolare (pendenza).

Inibitori Gli inibitori enzimatici sono molecole che interferiscono con la catalisi, rallentando o bloccando le reazioni enzimatiche. Lo studio degli inibitori enzimatici ha fornito anche molte informazioni sui meccanismi di azione degli enzimi ed ha contribuito a individuare alcune vie metaboliche. Spesso lo studio degli inibitori ha permesso di capire quale

Il residuo amminoacidico dell'enzima è coinvolto nel meccanismo catalitico; ciò è studiato attualmente attraverso un meccanismo più complesso di biologia molecolare; si utilizzano mutazioni sito-specifiche, si sostituisce l'amminoacido coinvolto con un amminoacido differente, si sovraesprime la proteina mutata all'interno di un sistema modello e si studia il funzionamento della reazione. Molti inibitori sono modulatori fisiologici dello svolgersi delle reazioni.

Esistono due tipi di inibizione enzimatica:

• Inibizione reversibile: legame non covalente dell'inibitore all'enzima.
• Inibizione irreversibile: legame covalente dell'inibitore all'enzima.

Se vi è l'inibitore presente nella soluzione in cui vi è una certa quantità di enzima e aggiungiamo una certa quantità di substrato, la velocità di reazione che osserviamo, nonché la produzione di prodotto, non sarà

lastessa che avremo in assenza di inibitore. L'affinità dell'enzima per il substrato verrà diminuita.

Inibizione reversibile. L'interazione di un inibitore reversibile con l'enzima o il complesso enzima-substrato non è un'interazione permanente. Vi sono 3 tipi di inibitori reversibili:

• Competitivi: competono con il substrato per lo stesso sito di legame dell'enzima. Dal punto di vista chimico sono estremamente simili al substrato stesso poiché entrambi riconoscono la stessa regione dell'enzima.
• Non competitivi: si legano a siti diversi dal substrato, sia a E libero che al complesso ES.
• Incompetitivi: si legano a siti distinti da quelli del substrato, ma solo al complesso ES.

Inibizione competitiva. In soluzione saranno disciolti l'enzima, il substrato e l'inibitore; l'enzima può andare incontro a legame con il substrato o con l'inibitore. Il legame dell'inibitore

All'enzima determina la formazione del complesso enzima-inibitore reversibile; in questo caso l'inibitore presenta una forma che si inserisce bene all'interno del sito attivo. La formazione di questo complesso è caratterizzata da una costante di dissociazione, costante di inibizione (K_i). La formazione del complesso ES e del complesso EII sono due processi mutualmente esclusivi (è impossibile che si formi il complesso EIS).

Poiché l'inibitore si lega reversibilmente all'enzima, la competizione può essere superata semplicemente aumentando la concentrazione di substrato. Quando il valore di [S] è maggiore di [I], la probabilità che una molecola di inibitore si leghi all'enzima diminuisce sensibilmente. Tuttavia l'aggiunta di S causa l'aumento della K_m; la Km deve aumentare di un valore alfa che tiene conto della concentrazione dell'inibitore. Quindi, in presenza di inibitore la quantità di...

substrato che determina ½ V (K ) deve essere maggiore rispettoMAX malla quantità necessaria in assenza di inibitore.

AlfaK corrisponde alla K osservata in presenza dell’inibitore ed è spesso chiamata K apparente (affinitàm m mdell’enzima al substrato in presenza dell’inibitore). Alfa è un fattore moltiplicativo di K e sta almdenominatore, per questo la velocità diminuisce all’aumentare di alfa, cioè all’aumentare dellaconcentrazione di inibitore.

La quantità di substrato da aumentare per allontanare l’inibitore dipende:

1. Dalla quantità di inibitore.
2. Dall’affinità dell’inibitore per il substrato, cioè dalla forza dell’inibitore al tenersi legato al substrato.

In presenza di un inibitore competitivo: aumenta K , V non cambia. Ciò che cambia è la quantità dim MAXsubstrato che servirà per raggiungere la metà.