Biochimica - enzimi

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abbassare l’energia di attivazione ΔG . In sintesi gli enzimi riescono ad aumentare la velocità di reazione

tramite il rilascio di energia durante la formazione di altri legami.

Il sito attivo si un enzima è una piccola porzione dell’enzima stesso che di solito è in corrispondenza con

una tasca o una fessura ed è una regione di circa 20 amminoacidi, è tridimensionale e lega il substrato

tramite interazioni deboli.

Le interazioni tra enzima e substrato sono ancora fonte di studio ma si è arrivati a due tipi di modelli:

• modello chiave-serratura

• modello di adattamento indotto

Con il modello chiave-serratura si era ipotizzato in primis che il sito attivo era perfettamente

complementare al substrato, se così fosse però l’enzima sarebbe inutile in quanto invece che accelerare la

reazione semplicemente stabilizzerebbe il substrato. Nel modello a chiave-serratura quindi si ipotizza una

perfetta complementarietà tra il sito attivo e la fase di transizione del substrato.

Con il modello di adattamento indotto viene tenuto conto la capacità delle proteine di cambiare

conformazione e quindi si ipotizza che il cambiamento conformazionale dell’enzima avviene solo dopo

il legame del substrato al sito attivo.

La specificità di un enzima è strettamente collegata al discorso di catalisi in quanto in un sito attivo sono

presenti gruppi funzionali disposti in maniera tale da avere un’interazione ottimale con uno specifico

substrato, in generale si può dire che anche la specificità dipende da interazioni deboli tra enzima e

specifico substrato.

L’interazione enzima-substrato porta anche alla desolvatazione del substrato in quanto molti dei legami

idrogeno che si formano tra l’enzima ed il substrato sono a spese dei legami ad idrogeno tra il substrato

stesso e l’acqua.

CATALISI

Esistono 3 tipi di catalisi enzimatiche:

• Catalisi acido-base

• Catalisi covalente

• Catalisi da ioni metallici

Catalisi acido-base

Quando si è in presenza di reazioni chimiche spesso ci si trova davanti alla formazione di intermedi di

reazione piuttosto instabili. Per stabilizzare questi intermedi bisogna che venga trasferito un protone al o dal

substrato in modo da stabilizzare l’intermedio quindi arrivare ad i prodotti di reazione più facilmente. Il

trasferimento di un protone coinvolge o i costituenti di una molecola di acqua o di altri donatori/accettori

+ -

deboli di protoni. Catalisi a cui partecipano ioni H o OH viene chiamata catalisi acido-base specifica. Nel

caso di una catalisi enzimatica questo interscambio di protoni avviene grazie ad alcune catene laterali

amminoacidiche all’interno del sito attivo.

Catalisi covalente

La catalisi covalente comporta la formazione di legami covalenti transitori tra il substrato e l’enzima. Il

legame covalente tra enzima e substrato attiva il substrato a promuovere la reazione in maniera specifica.

Catalisi da ioni metallici

In questo caso l’interazione avviene con uno ione metallico che può essere legato sia all’enzima che al

substrato stesso. Il legame tra enzima e substrato può orientare il substrato verso la formazione dei prodotti o

per stabilizzare un intermedio di reazione. I metalli possono partecipare anche mediante reazioni di ossido-

riduzione mediante variazioni reversibili dei loro stati di ossidazione.

CINETICA ENZIMATICA

La velocità di reazione di un enzima è strettamente correlata alla concentrazione del substrato ed

aumenta in maniera lineare finché tutti i siti attivi degli enzimi non saranno stati occupati dal substrato. Una

volta che i siti attivi sono stati saturati viene raggiunta la velocità massima di reazione e diventerà

indipendente dalla concentrazione di substrato con la formazione di un grafico di una iperbole rettangolare.

Come indice dell’attività catalitica si può usare il numero di turnover ossia il numero netto di molecole di

substrato convertite in prodotto da una singola molecola enzimatica nell’unità di tempo quando

l’enzima è totalmente saturo di substrato.

Cinetica di Michaelis-Menten

Il primo modello di cinetica enzimatica fu strutturato da Michaelis e Menten che ipotizzarono la

presenza di due reazioni durante la reazione catalizzata da un enzima. La prima reazione era quella

relativamente più veloce e reversibile:

⇌

E+ S ES

mentre la seconda era più lenta (quindi era la reazione limitante)

⇀

ES E+ P

In pratica secondo questa teoria la velocità di reazione complessiva deve essere proporzionale alla

concentrazione di ES.

Questa teoria sfrutta quella che è una cinetica di saturazione in quanto in una reazione enzimatica l’enzima

sarà presente sia in forma libera sia in forma associata con il substrato S, se la concentrazione di substrato è

minima la maggior parte dell’enzima si troverà in forma libera, se la concentrazione di S aumenta i siti attivi

degli enzimi verranno occupati fino al punto in cui diventa trascurabile la quantità di enzima in forma libera.

In questa condizione sarà presente la Vmax o la velocità massima di reazione. Questa condizione viene

mantenuta fin quando ci sarà abbastanza substrato da mantenere occupati i siti attivi degli enzimi in quanto

dopo la formazione del complesso ES si avrà la formazione dei prodotti P quindi l’enzima tornerà libero

pronto a catalizzare la reazione successiva.

L’ipotesi di Michaelis-Menten si può sviluppare anche algebricamente. Loro ipotizzarono che la tappa

limitante di una reazione enzimatica fosse quella di demolizione del complesso ES per la formazione di

enzima libero e prodotti.

V [S ]

max

V =

0 K +[S]

m

dove Km è la costante di Michaelis.

Per arrivare a questa formula si parte dalla reazione di ipotesi di base, ossia:

k k

⇌ ⇌

E+ S ES E+ P 1 2

k

k -2

-1

dove però nei primi tempi della reazione la [P] è molto bassa quindi la k può essere ignorata:

-2

k k

⇌ ⇀

E+ S ES E+ P 1 2

k -1

La V (velocità iniziale) viene determinata dalla demolizione di ES in favore alla produzione di P

0

quindi: [ ]

V ES

=k

0 2

[ES] non è facilmente valutabile, viene quindi introdotto il parametro [E ] che rappresenta la quantità di

t

enzima totale (enzima libero + enzima legato al substrato). Tenendo conto di ciò si può ricavare

un’equazione per la V con dei parametri valutabili.

0

La velocità di formazione e demolizione del complesso ES sono regolate dalle costanti di velocità k 1

(formazione) e k +k (demolizione):

-1 2 [ ] [ ] [ ]

Velocità di formazione ES=k E ES S

( )

−

1 t

[ ] [ ]

Velocità di demolizione ES=k ES ES

+k 2

−1

dove [E ]-[ES] è la quantità di enzima libero.

t

Supponiamo ora che la velocità di formazione del complesso ES sia uguale a quella di demolizione di ES,

avremo quindi:

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

k E ES S ES k ES

( )

− =k +

1 t 2

−1

si risolve quindi l’equazione:

[ ] [ ] [ ][ ] [ ]

k E S ES S ES

−k =(k +k )

1 t 1 2

−1

si aggiunge k [ES][S] ad entrambi i membri dell’equazione che diventa:

1 [ ]

[ ][ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ]

k ES S E S ES S k ES k ES S

( )

+k −k = +k +

1 1 t 1 2 1

−1

si risolve l’equazione:

[ ] [ ] [ ] [ ]

k E S k S ES

( )

= +k +k

1 t 1 2

−1

ricaviamo quindi il parametro [ES]:

[ ]

k E [S]

1 t

[ ]

ES = [ ]

k S k

+k +

1 2

−1

dividiamo tutti i membri per k :

1

[ ]

E S

[ ]

t

[ ]

ES = k +k 2

−1

[ ]

S + k 1

k k

+ 2

−1

dove però è proprio la costante di Michaelis indicata con Km, quindi l’equazione diventa:

k 1

[ ]

E S]

[

t

[ ]

ES = [ ]

S k

+ m

andando a sostituire questo valore di [ES] nell’equazione della velocità iniziale V si avrà:

0

k E

[ ][S ]

2 t

V =

0 [ ]

S k

+ m

ma dato che k [E ] è proprio la Vmax andremo a sostituire:

2 t

V [S]

max

V =

0 [ ]

S +k m

che è proprio l’equazione della velocità di una reazione catalizzata da un enzima con un solo substrato di

Michaelis-Menten.

Tramite questa equazione se si pone V = 1/2Vmax e l’equazione precedente diventa:

0

V V [S ]

max max

=

2 [ ]

S k

+ m

dividendo tutto per Vmax diventa:

[ ]

S

1 =

2 [ ]

S k

+ m

risolviamo poi per km:

[ ]

k S

=

m

e questo avviene quando V =1/2V . Quindi k è equivalente alla concentrazione del substrato quando V è

0 max m 0

uguale a metà della V . Tutti gli enzimi possono seguire questa regola, tranne quelli regolatori.

max

La km

La km è un valore sperimentale in quanto nella realtà le reazioni enzimatiche possono non svolgersi nelle

due reazioni ipotizzate da Michaelis-Menden e può essere considerata come una misura di affinità

dell’enzima per un substrato: più alto è il valore di km minore sarà l’affinità con il substrato. La km

inoltre rappresenta la quantità di substrato necessario affinché la reazione enzimatica proceda con una

velocità pari a metà della velocità massima raggiungibile.

Nel caso che k sia molto minore di k può essere non considerata quindi km risulterebbe uguale a:

2 -1

k

−1

k =

m k 1

questo tipo di relazione è uguale a k ossia alla costante di dissociazione.

d

I doppi reciproci

Considerando l’equazione di Michaelis – Menten diventa molto complicato determinare la V in quanto

max

[ ]

V S

( )

max

V =

questa equazione descrive un’iperbole rettangolare che essendo un asintoto non

0 [ ]

K S

+

m

raggiungerà mai un valore definito ad una concentrazione finita di substrato. Si trasforma quindi questa

equazione in quella di una retta facendo i reciproci dell’equazione stessa.

[ ]

K S

+

1 m

= [ ]

V V S

0 max

Risolvendo questa equazione per ottenere l’equazione di una retta avremo che:

K

1 [S]

m

= +

V V V S]

[S ] [

⁡ ⁡

0 max max

K

1 1 1

m ∙

= +

V V V

[ ]

S

0 max max

Che è proprio l’equazione di Linewea