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PROTEASOMI
Sistemi più complessi che degradano le proteine intracellulari. Sono strutture a cilindro formate da una parte centrale chiamata core e due coperchi. La proteina o enzima viene captata dal proteasoma, viene svolta all'interno del core e una volta perso il folding, viene degradata in singoli amminoacidi.
Importante è la molecola dell'ubiquitina: le proteine che devono essere degradate vengono legate dall'ubiquitina. Questa è una molecola che viene riconosciuta dal proteasoma e la fa entrare nel core.
Quali fattori influenzano l'azione di un enzima?
INIBITORI
È una molecola che legandosi all'enzima ne blocca (inibisce ovvero inattiva l'enzima) o ne diminuisce l'attività.
Si legano in due modi:
REVERSIBILI
Legami non covalenti, l'inibitore può staccarsi dall'enzima.
- Competitivi: l'inibitore riconosce solo l'enzima libero. Inibitore e substrato si legano allo stesso
Inibitori "suicidi": sono gli analoghi di substrato e ingannano l'enzima. L'enzima li considera come tali. L'enzima si lega ad esso e nel momento viene trasformato dall'enzima e si crea il legame covalente. Prevede la formazione di un intermedio EI* che poi evolve nel complesso E-I. Utilizzati in ricerca: verificare la presenza di residui di cisteina nel sito attivo importanti per l'attività catalitica.
Esperimento di mutagenesi della cisteina, con un altro amminoacido. Esperimento con degli inibitori tiolici con gruppi SH che sono analoghi di substrato. Il gruppo SH si lega alla cisteina e si forma il complesso, per cui se la cisteina è fondamentale per l'attività catalitica, così la cisteina non è più disponibile. Se succede allora la cisteina è importante. Oltre che la costante di inibizione e la concentrazione dell'inibitore,
L'efficacia viene valutata anche in base al tempo. Si viene a formare il complesso Enzima-Inibitore che non si ritrasforma nei singoli perché è un processo irreversibile. E-I si forma il legame covalente. Più il tempo passa e più le molecole si legano in modo covalente.
TEMPERATURA
Ogni enzima necessita di una particolare temperatura. Normalmente le cellule lavorano a una temperatura di 37°C. Non sempre è la temperatura ottimale, esiste un range di T. Sono delle curve a campana asimmetriche. Nel range esiste una temperatura ottimale per l'enzima. A T basse al massimo l'enzima non funziona. Aumentando la temperatura l'enzima funziona e la velocità di reazione aumenta finché si raggiunge la temperatura ottimale. Gli enzimi però sono proteine. Se supero la T ottimale, l'enzima funziona zero perché si denatura, perde il suo folding.
pH
Differenze di pH sono più presenti nelle cellule, nei loro vari compartimenti.
rispetto alla temperatura. Il pH influenza il livello di protonazione delle catene laterali degli amminoacidi dell'enzima. Ottengo curve a campana simmetriche. Ho un pH ottimale. Affinché un enzima sia attivo, può essere necessario che siano presenti contemporaneamente sul sito attivo delle catene laterali sia protonate che non. Non ci sono mai situazioni in cui l'enzima ha catene completamente protonate o completamente deprotonate. Se sono nella situazione in cui l'enzima è attivo se un determinato set di amminoacidi, catene laterali, è protonato, ottengo che quando tutti gli amminoacidi sono protonati ho il 100% di attività. Questo succede con pH acidi, alta concentrazione di H+. A pH basici, alti, con pochi H+, non ho protonazione e l'enzima non funziona. Ma non esiste questa situazione e neanche quella inversa. Nella realtà, l'enzima funziona quando ha un set di amminoacidi protonati e un set...diamminoacidi non protonati. Quindi il pH ottimale è un pH di compromesso per il quale gli amminoacidi sono in parte deprotonati e in parte no nel sito attivo. CONETICA ENZIMATICA Parte della biochimica, scienza, che studia come la velocità di reazione è influenzata dalla concentrazione di S e di E. Ci sono enzimi che hanno cinetiche caratteristiche: - Cinetica di Michaelis-Menten - Cinetica degli enzimi allosterici La relazione tra velocità ed enzima è abbastanza intuitiva: segue una cinetica lineare. Infatti all'aumentare della concentrazione di enzima, la velocità aumenterà in maniera proporzionale. La relazione tra velocità e concentrazione di substrato è più complessa: in base se la reazione segue una cinetica di Michaelis-Menten e degli enzimi allosterici. 1. CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN La relazione tra velocità e concentrazione del substrato è una concentrazione iperbolica. Intuitivamenteciò vuol dire che non è lineare, al passare del tempo la velocità diminuisce fino ad arrivare ad un punto di saturazione. All'infinito la velocità non aumenterà più. L'enzima si satura. Cinetica iperbolica o di saturazione. La curva è un'iperbole. I due scienziati hanno dimostrato questo fatto sperimentalmente. Hanno estrapolato una relazione matematica che tiene conto di questo comportamento. Concentrazione di prodotto al passare del tempo incubando un enzima e facendolo reagire. Mano a mano che avanza il tempo, il substrato diminuisce e si consuma, quindi il prodotto a sua volta cala insieme alla velocità di reazione. Lo stesso procedimento è stato ripetuto per concentrazioni crescenti di substrato. Se la concentrazione è maggiore, a parità di tempo, la quantità di prodotto ottenuta è maggiore. Questi risultati sono stati ottenuti sperimentalmente per comprendere come varia la velocità di reazione in base alla concentrazione di substrato.quantità di prodotto. La velocità è una variazione di una grandezza nel tempo. In questo caso, la variazione è rappresentata da quella di prodotto. La velocità è rappresentata dalle tangenti alle curve. La tangenza diminuisce, la velocità nel tempo diminuisce. La velocità più importante è V e viene chiamata VELOCITÀ INIZIALE. Viene misurata all'inizio della reazione quando la concentrazione di substrato è ancora elevata, non è ancora stato consumato e quindi non influenza la reazione. Se ad ogni concentrazione di substrato considero le varie tangenti, ottengo un determinato valore di V. Su un altro grafico poi riporto i valori di V0 in funzione della concentrazione di substrato. Ottengo i punti disposti così. Uniti, ottengo una curva iperbolica. V0 e concentrazione di S. Sperimentalmente, come varia la quantità di prodotto. Si appiattisce perché il substrato si consuma. Per ogni curva.calcolo la velocità. Tutte queste velocità non sono uguali perché il substrato diminuisce. Considero sempre V iniziale perché ho una concentrazione di S che non limita la velocità di reazione. È la retta tangente in quel punto della curva. È rappresentata dalla pendenza della retta. I due scienziati hanno condotto questi esperimenti per capire come varia la velocità in base alla concentrazione di substrato: la relazione è IPERBOLICA. A un certo punto la velocità non aumenta più. La curva che rappresenta la relazione tra V e s è l'iperbole. La curva iperbolica tende a un asintoto rappresentato da a. B è il valore di x quando a è a ½. - Se x è molto più piccolo di b, y è ab x x. Y è direttamente proporzionale a x. A concentrazioni basse la relazione è lineare. - Se x è molto maggiore di b, y risulta indifferente alle variazione di x. X = conce s Y =VA = asintoto Vmax
VB = Km
Come la velocità dipende dalla concentrazione di substrato.
Sono importanti i valori di V e di Kmax.
Km è la concentrazione di substrato alla quale la velocità di reazione è ½ della velocità massima. Serve a definire l'affinità di un enzima per un determinato substrato.
Io posso confrontare enzimi diversi grazie a questo valore di Km.
L'enzima ha maggiore affinità al substrato quando Km è basso. Più è alto Km, maggiore sarà la concentrazione di substrato per raggiungere ½ della velocità massima.
Più è alto Km, meno è affine l'enzima per il substrato perché più è alto Km, maggiore sarà la concentrazione di substrato per raggiungere ½ della velocità massima.
Km: Misura il grado con cui l'enzima è legato al substrato, è una misura dell'affinità Substrato
– Enzima.- E’ caratteristica di un enzima per un certo substrato.- Se ha valori bassi, l’enzima si satura con poco substrato = affinitàelevata.- Se ha valori alti, l’enzima si satura con molto substrato = affinità bassa.I valori di K possono essere misurate in laboratorio sperimentalmente.mÈ specifico per un enzima per quel substratoÈ difficile calcolare K da una curva iperbolica perciò la curva vieneminvertita passando così a una retta.inizialmente lineare poi tende a un asintoto che è la V maxk (numero di turnover o costante catalitica): massimo numero dicatmolecole di substrato convertite nella unità di tempo da una molecola
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