Enzimi e cinetica enzimatica

Teoria della stabilizzazione dello stato di transizione

B −E /RT ∆S /Rk = e eah∓∆ Hla differenza tra E e è marginale, dunque sono trattati come sinonimi.! a−E /RTe aIl termine è noto come fattore di Boltzmann e rappresenta la frazione di molecole chepossiede un’energia maggiore o uguale all’energia di attivazione molecole che hanno!un’energia sufficiente per poter reagire. 2−E /RTe aequazione di Arrhenius: k = A (incorpora in A tutti i fattori diversi dal fattore di!Boltzmann, A = K T/h). A è costante.BLa stessa equazione viene spesso presentata in forma logaritmica:EaIn K = cost − RTTEORIA DELLA STABILIZZAZIONE DELLO STATO DI TRANSIZIONE (Pag.195-198)Formulata da Pauling nel 1946▪ ∓∆ HL’interazione dell’enzima con il substrato porta alla riduzione del (o dell’energia interna)▪ associata allo stato di transizione.Il legame del substrato all’enzima avviene in una regione dell’enzima ben definita e composta▪ da un numero limitato di

residui amminoacidici sito attivo. Si forma così il complesso enzima-substrato. Dunque, il legame del substrato all'enzima non avviene in una regione dell'enzima casuale (vedi immagine pag.197).

Il sito attivo dell'enzima è costruito in modo tale da accogliere preferenzialmente la struttura dello stato di transizione piuttosto che quella del substrato quindi il substrato deve modificarsi, distorcersi e assumere una struttura almeno simile a quella dello stato di transizione si può dire che l'enzima stabilizza lo stato di transizione perché lega a sé quest'ultimo e non il substrato come tale (prima che subisca la modificazione).

Ma da dove arriva l'energia per stabilizzare lo stato di transizione? È fornita dall'interazione enzima-substrato il legame enzima-substrato è possibile grazie a legami H, legami elettrostatici, interazioni di van der Waals. Inoltre, l'energia di questi legami

viene“spesa” in parte per distorcere la struttura del substrato per assumere la struttura planaredello stato di transizione. Se l’enzima legasse il substrato come tale NON distortorallenterebbe la reazione!!!

ANALOGHI DELLO STATO DI TRANSIZIONE: strutture simili allo stato di transizione chevengono predette in base alla conoscenza del meccanismo di reazione se la predizione è!corretta l’analogo stabile dello stato di transizione dovrebbe legare l’enzima con molta più affinitàdi quanto non faccia il substrato.

Molti farmaci oggi disponibili sono analoghi di uno stato di transizione.

• Inibiscono l’enzima legandosi al suo sito attivo con un’affinità maggiore rispetto al substrato.
• Sono analoghi dello stato di transizione alcuni inibitori della proteasi del virus HIV.

REAZIONE CATALIZZATA DA ENZIMI

1. Formazione del complesso enzima-substrato
2. Conversione nel prodotto attraverso lo stato di transizione
3. Formazione

del complesso enzima-prodotto4. Rilascio del prodotto.

FATTORI CHE CONCORRONO ALL'EFFICIENZA CATALITICA DEGLI ENZIMI(Pag.199-207)

1. Stabilizzazione dello stato di transizione stiramento e distorsione del legame destinato alla rottura.
2. Contributo entropico orientamento reciproco dei substrati tra di loro e "bloccaggio" dei substrati nell'orientamento più idoneo per la reazione la reazione avviene nel sito attivo dell'enzima e in questo modo si avrà una piccola diminuzione di entropia nel passaggio attraverso la barriera di attivazione. In una reazione non catalizzata si perde molta più entropia che in una reazione catalizzata.
3. Catalisi acido-basica eventi catalitici che comportano l'acquisto o la cessione di protoni da parte delle molecole, quando ciò sia necessario per la rottura di un loro legame. Si classificano in:
   • Catalisi specifica acido-base: in specie chimiche acquose
   • Catalisi generale acido-base: le specie sono

acidi o basi. Gli enzimi attuano solo catalisi generale acido-base!

Catalisi covalente prevede un intermedio di reazione legato covalentemente all'enzima, che viene rilasciato al termine della reazione, rigenerando la struttura iniziale dell'enzima.

Catalisi da ioni metallici certi enzimi devono legare ioni metallici per essere cataliticamente attivi. Gli ioni più frequenti sono: Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Mg²⁺.

Adattamento indotto la struttura di un enzima si modifica quando esso si lega ai substrati?! Fischer ipotesi chiave serratura: un substrato si lega al sito attivo come una chiave entra nella rispettiva serratura, quindi gli enzimi non si modificano. Koshland gli enzimi vanno incontro a modificazioni conformazionali mentre legano i substrati il legame dei substrati porta i gruppi catalitici dell'enzima a orientarsi propriamente verso il substrato medesimo, così da rendere possibile la trasformazione dei substrati stessi è il

legame del substrato a generare il sito attivo. Es: esochinasi. (vedi immagine pag. 206)

LE PROTEASI (Pag. 207-209)

Le proteasi fanno parte delle idrolasi e sono enzimi in grado di catalizzare il legame peptidico. Le proteasi sono suddivise in 2 gruppi:

Esopeptidasi: degradano le proteine dall'N-terminale e dal C-terminale rilasciando singoli amminoacidi e accorciando la catena polipeptidica di un residuo alla volta. Si dividono in:

• Aminopeptidasi: rimuovono residui dall'N-terminale
• Carbossipeptidasi: rimuovono residui dal C-terminale

Endopeptidasi: frammentano una catena polipeptidica al suo interno, cioè in posizioni distanti dall'N-terminale e dal C-terminale.

UN ESEMPIO DI PROTEASI: CHIMOTRIPSINA (Pag. 209-215)

Enzima proteolitico prodotto nel pancreas e secreto nel tratto digerente, partecipa alle funzioni digestive. Massa molecolare di 25 kDa. La chimotripsina viene sintetizzata in forma di un precursore inattivo chimotripsinogeno: consiste in

Un' unica catena polipeptidica viene trasformata nella forma matura cataliticamente attiva chimotripsina mediante la rimozione proteolitica di 2 dipeptidi (tra leucina 13 e isoleucina 16 + tra tirosina 146 e alanina 149) proteolisi limitata = processo di rimozione di uno o più legami peptidici per passare da forma inattiva a forma matura attiva dell'enzima. La chimotrispina è formata da 3 catene polipeptidiche tenute insieme da 2 ponti disolfuro.

La chimotripsina è una proteasi, in particolare endopeptidasi vengono attaccati solo quei legami peptidici nei quali il gruppo C=O è dotato di un residuo apolare voluminoso (aromatico) affinché un legame peptidico possa essere idrolizzato deve essere presente un residuo apolare.

Come funziona l'enzima?

Nel sito attivo sono presenti 3 residui che sono essenziali per la catalisi:

• Serina 195
• Istidina 57 Triade catalitica
• Aspartato 102

1. ACILAZIONE

Avvengono 2 eventi:

• Cessione del protone

All'istidina da parte della serina In assenza del substrato!l'istidina non è protonata si crea un effetto di polarizzazione tra l'N dell'anello!imidazolico e il vicino gruppo -OH della serina, per cui la serina dona un protone H+all'istidina che si protona.

Attacco nucleofilo l'atomo di O della serina, dopo aver ceduto il protone H , effettua! +un attacco nucleofilo sul carbonio carbonilico (C=O) del substrato.

Rimaneggiamento dei doppietti elettronici si forma un legame elettrostatico tra istidina e!aspartato.Si forma un intermedio tetraedrico transiente (carbonio del gruppo carbonilico del substrato ha assunto geometria tetraedrica) è presente un O carico negativamente!chiamato ossanione. La sua formazione è dovuta alla formazione di legami H tral'ossanione e due gruppi NH dello scheletro polipeptidico (immagine pag. 214) queste!interazioni consentono di delocalizzare la carica negativa e quindi stabilizzare l'intermediotetraedrico.

4L'ossanione ricostituisce il doppio legame con il carbonio, che ora si trova con una carica negativa dunque cede all'N il doppietto elettronico condiviso il legame C-N si rompe! E si forma temporaneamente l'intermedio instabile R-NH questo sottrae immediatamente all'istidina il protone in precedenza ceduto dalla serina e si forma R-NH.

Intermedio acil-enzima è quello che si ottiene alla fine della prima tappa.

DEACILAZIONE: Inizia quando una molecola di H O entra nel sito attivo al posto della componente amminica. Stessi passaggi dell'acilazione ma ripercorsi a ritroso. La reazione di catalisi della chimotripsina è termodinamicamente reversibile.

PRINCIPI DI CINETICA ENZIMATICA (Pag. 216-Meccanismo cinetico = è l'equazione chimica che rappresenta l'ordine con cui i singoli ligandi si legano e si distaccano dall'enzima. Ligando = qualsiasi specie molecolare in grado di legarsi ad un enzima E! substrati.

S, prodotti P, inibitori I, attivatori A.

Equazione cinetica è la relazione matematica che correla la velocità di reazione alla concentrazione dei singoli ligandi e dell'enzima.

Obiettivi della cinetica enzimatica:

• Identificare i meccanismi cinetici con cui i singoli enzimi obbediscono
• Determinare i valori delle relative costanti cinetiche.

Ecco la strategia della cinetica enzimatica:

A. FASE TEORICA

• Formulazione di modelli cinetici
• Produzione delle equazioni cinetiche

B. FASE SPERIMENTALE

• Misure di velocità a diverse concentrazioni di S, P, A, I, E
• Selezione dell'equazione cinetica più adatta
• Identificazione del rispettivo modello cinetico.

MODELLO CINETICO DI MICHAELIS E MENTENE

enzimaES = complesso enzima-substrato

K = velocità iniziale 1

K = velocità iniziale 2

k = velocità finale 1-1

Condizioni di validità:

• La velocità finale 2 non si determina introducendo la limitazione del tempo iniziale
laformazione di ES a partire da E+P è trascurabile al tempo iniziale. L'equazione cinetica è applicabile solo per valori di velocità iniziale (deriva dal punto precedente). [S] deve essere molto maggiore di [E]; in questo caso l'enzima è saturato, cioè si trova solo in forma ES (complesso enzima-substrato) e la v è pari alla velocità massima V.0 max. Relazioni: v = k [ES]0 2v = velocità iniziale.