Enzimi

Unità di misura dell'attività enzimatica

U/mL: quantità di enzima in grado di trasformare una µmole di substrato in un minuto (µmol/min).

Si allestisce in una provetta una reazione enzimatica tentando di ripristinare in vitro le condizioni ottimali al funzionamento dell'enzima che vogliamo dosare (tampone con pH e forza ionica ottimali, [S], eventuali cofattori). L'aggiunta del nostro campione in cui vogliamo dosare l'enzima fa partire la reazione che può essere visualizzata allo spettrofotometro SE si forma, ad esempio, un substrato che λ assorbe ad una certa (nm).

Gli enzimi sono classificati in base alla reazione catalizzata.

Cinetica enzimatica: determinazione della velocità di reazione e di come questa varia in risposta a variazioni dei parametri sperimentali.

Velocità della reazione A → P.

Durante una reazione la quantità di substrato diminuisce, mentre aumenta la concentrazione di prodotto.

Questo avviene mediante la formazione di un complesso Enzima-Substrato. Ogni passaggio è regolato da una costante di velocità. La relazione tra concentrazione di substrato e velocità della reazione enzimatica può essere espressa in modo quantitativo.

La cinetica di Michaelis e Menten

Michaelis e Menten elaborarono un modello matematico in grado di descrivere l'andamento della velocità di una reazione enzimatica in funzione della concentrazione di substrato. Tale relazione è stata ottenuta basandosi su un semplice modello che potesse comunque approssimare con esattezza le condizioni che si realizzano dentro la cellula. Questo modello ci permette inoltre di definire due importanti parametri, Km e Vmax, che ci permettono di caratterizzare un enzima.

Come gli enzimi trasformano un substrato in un prodotto?

Meccanismo di azione: modalità mediante la quale un enzima interagisce con il suo substrato formando il complesso ES a bassa energia di attivazione.

acido-base specifica: Si ha quando è coinvolta l'acqua come substrato. H+ o OH- agiscono da accettori o donatori deboli di protoni.

1. acido-base generale: trasferimento di protoni da molecole diverse dall'acqua.
2. Catalisi covalente: formazione di un legame covalente durante la formazione di vari intermedi che si generano nel complesso ES. Il legame covalente è ovviamente rotto a fine del ciclo catalitico.
3. Catalisi da ioni metallici: è presente un metallo in prossimità del sito attivo. Il metallo permette la formazione dello stato di transizione e partecipa alla formazione di legami, ad esempio nel meccanismo di catalisi della chimotripsina e delle Serina-proteasi, enzimi estremamente importanti in cui si ritrovano molti di questi meccanismi di catalisi.
4. Il meccanismo di catalisi delle serino proteasi è particolarmente interessante in quanto si ritrovano tutti i tipi di catalisi: acido/base, covalente. Inoltre, le Ser-proteasi ci fanno capire la differenza di specificità dell'enzima e il meccanismo di catalisi, che è comune a.

tutte le Ser-proteasi, ma ognuna di loro ha una propria specificità che permette ad ogni proteasi di tagliare il legame peptidico a livello di specifici residui. La Chimotripsina taglia quei legami peptidici che hanno sul lato C-terminale residui idrofobici o aromatici. La tripsina taglia a livello di legami che hanno sul C-terminale residui di Lys e Arg e infatti nella tasca di specificità è presente un Asp che stabilizza la carica positiva. L'elastasi è specifica per AA con catena laterale piccola e infatti ha una tasca di specificità molto ridotta.

Specificità: ogni proteasi riconosce una particolare sequenza di AA e taglia un legame peptidico tra due AA adiacenti. L'esistenza di proteasi con diversa specificità permette di ottenere piccoli frammenti formati da 2-4 aminoacidi.

esochinasi: l'attivazione del glucosio; enzimi allosterici

Una proteina allosterica è una proteina che contiene due o più siti di legame.

topologicamente distinti che interagiscono in modo funzionale l'uno con l'altro. Il che significa che ci sono almeno due siti in due differenti posizioni che sono capaci di legare metaboliti. La formazione di un legame di un legante ad un sito altera le proprietà dell'altro sito. Il significato di Km in un enzima allosterico è analogo ed indica l'affinità per un substrato, ma il valore viene riferito come Ks o k0. Un enzima allosterico ha una Km così come un enzima monomerico. Il significato di Km è analogo ed indica l'affinità per un substrato, ma il valore viene riferito come Ks o K0.5. Se l'affinità è aumentata dal substrato stesso si parla di cooperatività positiva. Se questa capacità di legame viene diminuita si parla di cooperatività negativa. I due leganti che si influenzano l'uno l'altro possono essere chimicamente identici, cioè quando un substrato.

La capacità di legarsi di un’altra molecola di substrato può essere modificata, dando luogo a un effetto omotropico. Queste molecole possono essere diverse chimicamente, come nel caso di un inibitore, e si parla quindi di effetto eterotropo.

I modulatori allosterici possono essere positivi o negativi e si riferiscono agli effetti finali che hanno sugli enzimi. I modulatori allosterici negativi diminuiscono l’affinità per il substrato o la velocità di reazione.

Gli enzimi allosterici possono essere finemente regolati da effettori positivi e negativi.