Corso di microbiologia

Caratteristiche fondamentali

I microrganismi sono gli organismi più antichi (ca. 3 miliardi) e sono stati i primi a colonizzare la terra. Sono ampiamente distribuiti in natura: si trovano ovunque, in qualsiasi ambiente. Sono gli organismi più numerosi (ca. 10³⁰): la loro biomassa è superiore a quella di tutti gli altri organismi.

Ruolo ecologico: apporto di ossigeno nell’atmosfera; i decompositori della materia organica sono responsabili dei cicli biogeochimici. Sono responsabili di malattie dell’uomo, di piante e animali; ma anche utili per la nostra salute. Utili per l’industria alimentare, farmaceutica e biotecnologica.

Depositi microbici fossili sono stati individuati in strati laminari di roccia sedimentaria detti stromatoliti. Queste strutture pluristratificate contengono carbonato di calcio unitamente a microrganismi fossili filamentosi. Esistono ancora stromatoliti vivi sulla Terra: in Australia occidentale, nelle zone marine intercotidali, sono presenti stromatoliti colonnari in cui microrganismi depositano carbonato di calcio e altri minerali, così da formare vari strati successivi della struttura della stromatolite.

Morfologie cellulari

1. Sfere

Cocchi: Sono batteri sferici e si distinguono diverse forme in base all’associazione tra batteri. Molto spesso i batteri non sono separati tra loro ma si associano per formare strutture particolari. L’associazione deriva dalla divisione cellulare, in cui i batteri non si separano completamente. La divisione avviene in un solo piano (sempre lo stesso piano di divisione).

• Diplococchi – associati a coppie
• Streptococchi – associati in catene/filamenti di cellule di varia lunghezza.
• Tetradi – formano foglietti di cellule.
• Sarcine – pacchetti cubici formati da 8 cellule, 4 superiori e 4 inferiori.
• Stafilococchi – formano strutture a grappolo irregolare.

2. Bacilli

Sono batteri di forma allungata, cilindrica: è la forma più comunemente osservata tra i procarioti. Le estremità possono essere arrotondate, appuntite, squadrate, rigonfie o ramificate. Essendo cellule allungate, i bacilli possono variare nel rapporto tra lunghezza e larghezza e quindi essere corti, come i coccobacilli, o più lunghi.

3. Spirale

È una variazione della forma a bastoncello, che è avvolta a spirale.

• Vibrioni – forma a spirale poco accentuata (corta) ma piuttosto un aspetto ricurvo
• Spirilli – sono lunghi e rigidi.
• Spirochete – lunghi e flessibili, capaci di modificare la forma durante il movimento

4. Altre forme

• Stella
• Piatta e squadrata
• Forme particolari dovute alle appendici/prosteche

Procarioti pluricellulari

Nelle forme associate ogni batterio è un singolo individuo indipendente: sono forme unicellulari che si associano a formare strutture particolari. Esistono anche procarioti pluricellulari.

Attinomiceti

Gli attinomiceti sono batteri bastoncellari che formano filamenti ramificati, o ife. In seguito a crescita e ramificazione si forma una complessa rete di filamenti chiamata micelio (insieme delle ife). Sebbene il micelio abbia dimensioni batteriche, è in qualche modo analogo al micelio dei funghi filamentosi. In genere, le ife sono suddivise da setti in lunghe cellule (20 μm e più) contenenti numerosi nucleoidi. Nella crescita su substrati solidi come l’agar, la ramificazione ifale sviluppata dagli attinomiceti avviene sia all’interno del substrato, dando il micelio del substrato o micelio vegetativo, sia sulla superficie, nel qual caso si parla di micelio aereo. È un esempio di differenziamento cellulare perché questi due miceli svolgono funzioni differenti.

Tricomi

Molti cianobatteri hanno un’organizzazione pluricellulare, dove le cellule non sono distinte una dall’altra, ma mantengono dei canali per il passaggio di nutrienti e materiali. Un tricoma può contenere fino a 100 o più cellule che agiscono in modo concertato per muoversi o svolgere altre attività. Anche in questo caso si possono differenziare delle cellule che svolgono una funzione particolare: le eterocisti sono il sito di fissazione dell’azoto; gli acineti sono cellule quiescenti in grado di sopravvivere alle condizioni avverse.

Dimensioni

Le dimensioni ridotte dei batteri sono convenienti per lo scambio con l'ambiente esterno. Strutturalmente i batteri sono più semplici delle cellule eucariotiche ma hanno un metabolismo molto intenso, che richiede uno scambio continuo ed efficiente con l'ambiente esterno. Questa condizione si può verificare al meglio se il rapporto superficie/volume è elevato, e ciò avviene con volumi molto ridotti.

• Oscillatoria ha un diametro di 7 μm, paragonabile a quello di un eritrocita.
• E. coli è un batterio di medie dimensioni e ha un diametro di 1-1,5 μm.
• Gli Streptococcus sono piccoli, circa 800 nm.
• I Mycoplasma sono piccoli come virus, 200 nm.

Batteri giganti

Epulopiscium fishelsoni, presente nell’intestino del pesce chirurgo del Mar Rosso, può raggiungere una grandezza di 80 μm x 600 μm. Il suo volume è circa un milione di volte quello di E. coli. Ha una forma allungata e al suo interno può contenere altri organismi unicellulari. Presenta una membrana plasmatica molto involuta: è un adattamento per aumentare la superficie di scambio e favorire il trasporto dei nutrienti. Ha una particolare modalità di replicazione (la maggior parte dei batteri si replica per scissione binaria): le cellule figlie si sviluppano all’interno della cellula madre, che esploderà e darà vita a numerose cellule figlie. Inoltre questo batterio presenta moltissime copie del genoma.

Thiomargarita namibiensis, presente sulle coste della Namibia, è un batterio sferico con un diametro compreso tra 100-750 μm. Il suo volume è più di 100 volte quello di E. fishelsoni ed è visibile ad occhio nudo. Circa il 98% della cellula è occupato da un vacuolo contenente nitrati. Il citoplasma è limitato a un sottile strato addossato alla membrana cellulare; il suo sottile spessore favorisce una diffusione efficace delle sostanze.

Struttura della cellula procariotica

Le cellule procariotiche non sono più semplici delle eucariotiche, sono solo organizzate in modo diverso. La caratteristica fondamentale che differenzia procarioti da eucarioti è l'assenza del nucleo. Nei procarioti il genoma è diffuso in una regione del citoplasma non delimitata da membrane (nucleoide). Le cellule eucariotiche presentano organuli rivestiti da membrane, che mancano nelle cellule procariotiche (eccetto rari casi, come vacuoli).

Membrana citoplasmatica

È il principale punto di contatto con l’ambiente in cui la cellula vive ed è responsabile di tutti i rapporti che intercorrono tra la cellula e il mondo esterno. Nei procarioti svolge un’incredibile varietà di ruoli.

Funzioni

• Barriera permeabile in modo selettivo: per diffusione passiva consente il passaggio in entrambi i versi di alcune molecole mentre ostacola il passaggio di altre.
• Regola il passaggio di sostanze che spontaneamente non attraversano la membrana: è la sede di sistemi di trasporto specifici.
• Nei batteri è la sede d’importanti processi metabolici: Respirazione e Fotosintesi (svolti in organelli specifici nella cellula eucariotica).
• È sede della conservazione dell’energia cellulare; essa può esistere in forma energeticamente “attiva” quando attraverso la sua superficie si ha una separazione di carica degli ioni H⁺ e OH^- che produce un gradiente (forza protomotrice).
• Sede dei recettori della chemiotassi per capire e percepire l’ambiente in cui si trova.
• Sede di sistemi enzimatici per la sintesi di lipidi e altri costituenti della parete.

Composizione

La composizione della MC ne determina la fluidità, che può essere variata in base alle condizioni ambientali: i batteri sono capaci di adattare la composizione della membrana in base all’ambiente in cui vivono (condizioni estreme).

• Fosfolipidi sono molecole amfipatiche, ovvero formate da: Testa polare idrofila – Etanolammina legata ad una molecola di Glicerolo mediante un gruppo fosfato. Coda apolare idrofobica – legame estere tra il gruppo ossidrilico (-OH) del Glicerolo e quello carbossilico (-COOH) dell’Acido grasso.
• Proteine compongono circa il 50% della membrana e servono per svolgere quelle funzioni aggiuntive che non svolge la membrana degli eucarioti.
• Integrali – anfipatiche: formate da un core idrofobico che attraversa la m. e una porzione idrofila che sporge fuori la m..
• Periferiche – sono idrofile, associate alla membrana sul lato interno o esterno.
• Opanoidi sono molecole simili agli steroli degli eucarioti (i procarioti non hanno steroli). Gli opanoidi, come gli steroli, sono molecole planari rigide e contribuiscono a stabilizzare la membrana, rendendola meno flessibile. Sono molecole fortemente resistenti, ad esempio ad acari o acidi e per questo motivo si sono accumulate in miliardi di anni nei sedimenti.

È la molecola più rappresentata nella terra ed ha contribuito alla formazione del petrolio: sono presenti in quantità enormi nei sedimenti, pari quasi alla massa del carbonio organico di tutti gli organismi viventi (10^11-12 tonnellate). Alcuni batteri sono capaci di sintetizzarli, mentre altri li acquisiscono dall’ambiente esterno. Gli Archea ed alcuni batteri non presentano opanoidi. I Mycoplasma non hanno opanoidi ma steroli, che acquisiscono dall’ambiente. Anche i batteri Metilotrofi hanno steroli, ma sono capaci di sintetizzarli ex novo.

Membrana archeobatteri

La membrana degli archeobatteri è leggermente differente perché vivono in condizioni ambientali estreme: infatti la maggior parte degli archea sono estremofili.

Lipidi

• Hanno code idrofobiche costituite da idrocarburi a catena ramificata formati da unità isopreniche (sostituiscono gli acidi grassi). Queste catene idrofobiche sono legate al glicerolo mediante legame etere (non c’è il gruppo carbossilico). L’idrocarburo più comune è il fitanolo, formato da 4 unità di isoprene.
• In molti archeobatteri i lipidi formano un monostrato invece che un doppio strato lipidico, dove entrambe l’estremità della catena idrocarburica sono legate ad una molecola di glicerolo. Questo monostrato rende la membrana meno fluida e più resistente, adatta a vivere a temperature estreme. In altri ancora la membrana è costituita in parte da un doppio strato e in parte da un monostrato.

Parete

I batteri vivono in ambienti ipotonici, che presentano concentrazioni di soluto minori rispetto all’ambiente cellulare interno, e quindi l’acqua per osmosi tende ad entrare nella cellula, rischiando di provocare lisi osmotica: per questo motivo le cellule procariotiche presentano una parete. La parete è uno strato rigido, disposto all’esterno della membrana citoplasmatica, che protegge i batteri dalla lisi osmotica in soluzioni diluite (ipotoniche).

Si pone una cellula batterica in un terreno isotonico, che si ottiene aggiungendo saccarosio; il batterio viene trattato con penicillina o lisozima in modo da eliminare la parete. Il batterio senza parete cambia di forma (da bastoncellare a sferica) ma può comunque vivere in un terreno isotonico: quindi viene trasferito in un terreno diluito (ipotonico). Per effetto osmotico inizia a entrare acqua all’interno della cellula fino a provocarne l’esplosione. Il lisozima è un enzima presente in lacrime/saliva, capace di eliminare la parete dei batteri. Ha la funzione di limitare la riproduzione di batteri in quanto interferisce con la parete.

Funzioni

• Contrastare la lisi osmotica
• Determinare la forma dei batteri
• Proteggere il batterio da sostanze tossiche
• È bersaglio di numerosi antibiotici e farmaci ad azione antimicrobica

Colorazione Gram

È un tipo di colorazione differenziale che distingue i batteri in due categorie in base all’organizzazione strutturale della parete (in particolare del peptidoglicano): alcuni rispondono positivamente alla colorazione mentre altri negativamente.

1. Fissazione – Il batterio è posto sulla superficie del vetrino e mediante calore o trattamento chimico viene fissato sul vetrino.
2. Colorazione primaria – con Cristal-violetto (colorante basico) che viene lasciato agire per 1 minuto, in modo da permettere al colorante di penetrare nella parete: agisce allo stesso modo in tutti i tipi di batteri e li colora di un viola intenso.
3. Soluzione di Lugol – è una soluzione di I₂ in KI (ioduro di potassio) che funge da mordente: aumenta il fissaggio del colorante in quanto il complesso Iodio-Cristal-violetto, più permanente rispetto al solo Cristal-violetto.
4. Decolorazione – per circa 10 secondi con alcol etilico/acetone 1:1. È la fase critica. Lava via il colorante in eccesso che non si è fissato alle strutture. È il primo momento in cui si possono vedere differenze perché i Gram-negativi si decolorano.
5. Colorazione secondaria – con Safranina per 30 secondi. È una colorazione di contrasto in modo da rendere visibili al microscopio i batteri Gram-negativi che si colorano di rosa; mentre i Gram-positivi rimangono di color viola intenso.

Peptidoglicano – mureina

È il componente principale della parete: un eteropolimero di amminozuccheri acetilati e amminoacidi. La subunità del peptidoglicano è formata da:

• Amminozuccheri acetilati: NAM – acido N-acetilmuranico
• NAG – N-acetilglucosammina

Questi due zuccheri sono molto simili tra di loro, si differenziano solo dalla presenza di acido lattico nel NAM. Sono legati tra di loro mediante un legame glicosidico (β1-4) per formare il monomero del peptidoglicano, che è ripetuto (10-65 unità disaccaridiche). Legati al NAM sono presenti degli amminoacidi:

1. L-alanina
2. D-acido glutammico
3. Acido meso-diamminopimelico (DAP)
4. D-alanina
5. D-alanina

I D-amminoacidi hanno un’azione protettiva contro l’attacco della maggior parte delle peptidasi: gli stereoisomeri D sono meno comuni e non esistono proteasi capaci d’idrolizzarli. Il DAP si trova prevalentemente nei Gram –, mentre nei Gram + può essere sostituito dalla L-lisina: la particolarità di questi due amminoacidi è che presentano due gruppi amminici:

• Un gruppo amminico è impegnato nel legame peptidico con l’amminoacido precedente.
• Mentre l’altro –NH₂ forma legami crociati tra catene parallele (con altri glicani).

Legami crociati

I filamenti di glicano sono legati tra loro per formare un’unica molecola che ricopre l’intero protoplasto (membrana citoplasmatica): i legami crociati tra catene parallele consentono alla parete di adempiere le sue funzioni. Questi particolari legami avvengono tra il gruppo amminico di DAP/D-Lys (in posizione 3) e il gruppo carbossilico della D-alanina in posizione 4 di un altro filamento.

• Diretti DAP (-NH₂) ---- D-Ala (-COOH) – Gram –, alcuni Gram +
• Indiretti il legame tra L-Lys e D-Ala è interposto da un ponte peptidico di 5 Glicine – Gram +

Durante la biosintesi del peptidoglicano sono presenti due D-Ala terminali. L’enzima transpeptidasi è responsabile della formazione dei legami crociati: lega DAP con D-Ala dopo aver eliminato dal filamento di glicano la D-Ala in posizione 5. Nei Gram + quasi tutte le catene formano legami crociati tra filamenti paralleli. Nei Gram - solo alcune catene di glicano formano legami crociati. Inoltre, alcune catene hanno 4 amminoacidi anche se non sono impegnate nella formazione di legami crociati (la transpeptidasi ha eliminato l’ultima D-Ala).

Archeobatteri

Negli Archeobatteri non è presente il peptidoglicano. Alcuni possono presentare pseudomureina in cui il NAM è sostituito da N-acetiltalosamminuronio, legato al NAG con legame glicosidico β1-3. La pseudomureina non contiene D-amminoacidi ma solo stereoisomeri L.

Antibiotici β-lattamici

La penicillina è il primo antibiotico che è stato scoperto e agisce a livello del peptidoglicano della parete. Appartiene alla famiglia degli antibiotici β-lattamici che sono formati da un anello β-lattamico, struttura molto simile alle due D-Ala terminali (dimero di D-alanil-D-alanina). Il β-lattame s’inserisce nel sito attivo della transpeptidasi, inibendo la formazione di legami crociati tra filamenti di glicano e quindi la sintesi del peptidoglicano che compone la parete. Sotto l’azione di antibiotici β-lattamici la parete viene compromessa e il batterio muore per lisi osmotica. Altri β-lattamici sono le cefalosporine, carbapenemi e i monobattami.

Gram positivi – Monodermi

La parete è formata da...