Microbiologia I e II - Corso completo

Facoltà di medicina e chirurgia

Università degli studi di Foggia

“Microbiologia I e II”
Batteriologia
Virologia
Parassitologia
Prof. Donato Fumarola
Studente: Esposto Massimo

Microbiologia

Batteriologia

Organizzazione del mondo microbico

Uomo, animali e piante sono organismi superiori. Organismi più semplici, unicellulari: Protisti superiori e inferiori.

I protisti superiori sono dotati di struttura eucariotica e sono distinti in:

• Protozoi: appartengono al regno animale come i Plasmidi della malaria.
• Protofiti: appartengono al regno vegetale come le muffe, lieviti, miceti, alghe.

I protisti inferiori sono dotati di struttura procariotica e sono rappresentati dai batteri di cui si occupa la batteriologia. La parola batterio deriva dal latino “bacterium” che significa “bastoncino”.

Nomenclatura dei batteri

• Regno: procarioti.
• Ordine: desinenza ALES (le clamidie sono dell’ordine clamidiales).
• Famiglia: desinenza CEAE (fam. enterobacteriaceae).
• Tribù: desinenza EAE (solo per la fam. enterobacteriaceae).
• Genere: desinenza US, A, UM (staphylococcus, salmonella, corynebacterium).
• Specie: si usa il genitivo o l’aggettivo (E. coli, Salmonella typhi, Streptococcus pyogenes).

Morfologia dei batteri

I batteri sono di piccole dimensioni, di forma rotondeggiante (cocchi), bastoncellare o a bastoncino. I cocchi possono essere a grappolo (staphilococchi) o a catena corta o lunga (streptococchi). I bastoncini possono essere rigidi (enterobatteri), incurvati con curva a virgola o a parentesi (vibrione del colera), a spirale o a elica (campilobacter), a spirale multipla (spirochete).

Struttura dei batteri

La struttura dei batteri viene distinta in primaria o fondamentale e facoltative.

La struttura primaria è tipica di tutti i batteri, necessaria per la crescita e divisione cellulare, cioè parete cellulare, membrana plasmatica, citoplasma, nucleoide, mesosomi e cromatofori (invaginazioni della membrana plasmatica), DNA cromosomiale ed extracromosomiale, RNA solubile (20%) e RNA ribosomiale (80%) con subunità minore di 30S e subunità maggiore di 50S.

Le strutture facoltative sono tipiche solo di alcune specie batteriche e sono distinte in:

• Strutture facoltative microscopiche: capsula ed equivalente capsulare, flagelli, inclusioni intracitoplasmatiche, spore.
• Strutture facoltative ultramicroscopiche: pili o fimbrie, pili sessuali.

Parete cellulare

La parete cellulare è un involucro rigido che separa la membrana plasmatica dall’ambiente esterno, conferisce la forma al batterio e presenta diverse funzioni: consente la sopravvivenza del batterio anche in condizioni ambientali molto variabili e sfavorevoli, protegge la membrana plasmatica e impedisce la lisi osmotica. Inoltre, presenta potere tossico, funzione di adesione cellulare, potere antigenico capace di indurre una risposta immunitaria nell’ospite con produzione di Ab.

Mediante la colorazione di Gram possiamo fare una distinzione tra Gram+ e Gram-. I Gram+ producono attivamente esotossine e sono sensibili alle penicilline, mentre i Gram- producono attivamente endotossine e sono meno sensibili alle penicilline.

La parete cellulare dei Gram+ è meno complessa dei Gram-, costituita per l’80% da peptidoglicani PG o glicopeptidi costituiti da una parte glicanica (zuccheri) e da una parte peptidica (proteine). La parte glicanica è costituita da aminozuccheri come l’N-acetil-glucosamina (NAG) e l’N-acetilacido muramico (NAMA) che sono disposti in maniera alternata e incolonnati tra loro.

• NAG-NAMA-NAG-NAMA-NAG

Il legame NAG-NAMA può essere interrotto dal lisozima cioè un enzima litico presente nella saliva, muco nasale, lacrime, granulociti e rappresenta una difesa contro i batteri Gram+ e in minima parte contro i Gram-.

Nei batteri Gram- i peptidoglicani sono collocati in una parte profonda della parete e rappresentano solo il 10% di tutta la parete batterica, per cui il lisozima ha difficoltà ad esercitare la sua azione di difesa.

Il 15% della parete cellulare è costituita da acidi teicoici o lipoteicoici LTA che si trovano sulla superficie della parete cellulare e hanno funzione di adesione, tossica e antigenica, oppure si trovano a livello del peptidoglicano o più in profondità dove si oppongono all’azione delle autolisine o enzimi autolitici. Tra la membrana plasmatica e la parete cellulare c’è lo spazio periplasmatico che è reale nei Gram+ mentre è virtuale nei Gram- a causa della pressione interna citoplasmatica che schiaccia la membrana plasmatica contro la parete cellulare.

Il restante 5% della parete cellulare dei Gram+ è costituito da polisaccaridi e proteine di superficie che hanno funzione di adesione e antigenica, come la proteina M dello Streptococco che è anche tossica, la proteina A dello Staphylococco e il polisaccaride C dello Streptococco, che sono fattori di virulenza.

La parete dei Gram- è più complessa: in profondità è formata dal peptidoglicano sottile (10-20%) mentre in superficie presenta una massa fluida ricca di lipidi, proteine e polisaccaridi, e più esternamente abbiamo i lipopolisaccaridi (LPS) o endotossine che rappresentano il 50% della parete cellulare e presentano azione tossica notevole, ecco perché le infezioni da Gram- sono più difficili da trattare e spesso è necessario usare farmaci ad ampio spettro d’azione.

Gli LPS presentano 3 regioni:

• Una regione variabile, esterna, antigenica, di natura polisaccaridica.
• Una regione del core, intermedia, antigenica, costituita da lipidi, proteine e saccaridi (glucosio, galattosio, N-acetil glucosamina...).
• Regione lipidica o lipide A, interna, antigenica, ad azione tossica principale, diversa per ogni batterio Gram- che l’organismo cerca di bloccare mediante la produzione di Ab specifici.

Alcuni batteri Gram- producono anche l’esotossina, come il Vibrio cholerae, che va a potenziare l’effetto dell’endotossina, aggravando la situazione.

I Gram- possono provocare vari effetti nel nostro organismo:

• Effetto fortemente tossico o pirogeno: aumento della T°C corporea con febbre alta, fino a 40-41°C, dovuta ai LPS che agiscono sul sistema termoregolatore, alterando il sistema di dispersione del calore. Non bisogna somministrare subito gli antipiretici perché solo a T°C alte si ha la produzione di linfociti, Ab, linfochine e citochine.
• Effetto adiuvante pro-host: effetto benefico perché aiuta l’organismo a rispondere efficacemente mediante il sistema immunitario con intervento dei macrofagi, fagociti... La flora batterica intestinale è costituita prevalentemente da batteri Gram- stimolando continuamente il SI.

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica presenta un doppio strato fosfolipidico, proteine estrinseche o di superficie e proteine intrinseche o integrali o interne di membrana. Inoltre, presenta delle invaginazioni dette mesosomi che formano setti o vescicole che aumentano la superficie della membrana stessa e sono equivalenti mitocondriali che nei batteri sono assenti.

La membrana plasmatica regola il trasporto di varie molecole, presenta enzimi per la sintesi dei precursori polisaccaridici, ATP e per la replicazione del DNA. Non è possibile usare antibiotici che agiscono contro la membrana plasmatica perché è identica a quella delle cellule eucariotiche, per evitare danni alle cellule del nostro organismo.

Citoplasma batterico

Il citoplasma batterico è una massa fluida priva di correnti, R.E.R. o R.E.L., complesso di Golgi, mitocondri e altri organelli tipici delle cellule eucariotiche. Presentano enzimi, materiale di riserva e soprattutto i ribosomi che hanno dimensioni di 70 S, costituiti da rRNA (60%) e da proteine ribosomiali (40%).

Nucleoide o equivalente nucleare

La cellula procariotica non presenta il nucleo, la membrana nucleare, i nucleoli e la matrice nucleare, ma presenta il nucleoide che è sospeso nella massa citoplasmatica, con contorni irregolari, a diretto contatto con i ribosomi: presenta una molecola di DNA circolare, chiusa, lunga un migliaio di volte la cellula che lo contiene, da 250 a 1500 µm di lunghezza. Si nota il DNA cromosomiale e DNA extracromosomiale formato da molecole accessorie dette plasmidi che codificano le tossine, che possono essere trasferite da una cellula all’altra mediante un fago cioè un virus batterico o mediante i pili sessuali.

Strutture facoltative

Capsula

Tra le strutture facoltative abbiamo la capsula cioè un involucro superficiale della parete cellulare formato da polisaccaridi cellulari, ad eccezione del Bacillus antrachis dove è di natura polipeptidica. La capsula è presente nei batteri Gram+ come Streptococcus pneumoniae, Bacillus antrachis (carbonchio) e nei Gram- come Haemophilus influenzae, Salmonella tiphy, Escherichia coli, Klebsiella...

La capsula svolge una funzione difensiva nei confronti dell’ambiente esterno, farmaci, difese immunitarie dell’ospite, inoltre è un fattore di virulenza perché ha potere antifagocitario cioè si oppone alla fagocitosi, e cioè si oppone alle opsonine (globuline presenti nel sangue e che consentono ai fagociti di catturare i batteri sprovvisti di capsula per eliminarli).

Queste proprietà della capsula possono essere dimostrate mediante il metodo di inoculazione intraperitoneale del topolino bianco: la fagocitosi elimina i batteri privi di capsula inoculati, mentre quelli con capsula resistono alla fagocitosi e provocano la morte dell’animale, per cui l’infezione può essere contrastata solo mediante i vaccini formati da polisaccaridi capsulari, come lo Streptococcus pneumoniae, H. influenzae (anche se in Italia non sono vaccini obbligatori).

Nel caso del Pneumococco si usano vaccini polivalenti perché sono noti più di 80 tipi a seconda della costituzione polisaccaridica della capsula.

Esiste anche il vaccino per la Salmonella tiphy costituito da materiale capsulare o da mutanti vivi ma avirulenti che, rispetto al vaccino con germi uccisi o inattivati, induce una maggiore risposta difensiva, di lunga durata d’azione.

Equivalenti capsulari

Gli equivalenti capsulari hanno le stesse funzioni della capsula (antifagocitarie e antiopsoniche) e sono distinti in slime e alginato.

Lo slime (fango) è di natura glicoproteica, è gelatinoso, viscido, presente sia nei Gram+ come lo Staphylococcus epidermidis e saprophiticus, che nei Gram- come Pseudomonas aeruginosa.

Lo slime è responsabile della contaminazione degli strumenti usati a scopo diagnostico o terapeutico (protesi osteo-articolari) contaminati da Staphylococchi, oppure da Pseudomonas aeruginosa attraverso protesi, respiratori artificiali, soluzioni fisiologiche (lenti a contatto) con infezioni resistenti alla terapia.

L’alginato è di natura polisaccaridica, presente nei batteri predetti, provoca infezioni respiratorie resistenti alle terapie e recidivanti.

Ciglia e Flagelli

Le ciglia o flagelli sono strutture facoltative filamentose tipiche dei batteri bastoncellari, originano dal corpo basale citoplasmatico e perforano la membrana plasmatica e la parete cellulare fuoriuscendo dal corpo batterico. Sono costituite da proteine elastiche dette flagelline, antigeniche, e favoriscono la motilità del batterio.

I batteri sprovvisti di flagelli sono detti atrici come le Shigelle. I batteri provvisti di ciglia o flagelli sono distinti in:

• Monotrici se presentano un solo flagello ad un polo (Vibrio colerae).
• Anfitrici se presentano ciuffi di flagelli ad entrambi i poli.
• Lofotrici se presentano un ciuffo di flagelli ad un polo.
• Peritrici se presentano flagelli emergenti da tutto il corpo batterico (Enterobacteriaceae a eccezione di Shigelle e Klebsielle).

Le ciglia o flagelli possono essere osservati al M.O. solo dopo fissazione e colorazione con fucsina basica, facendo attenzione perché sono molto fragili. Possiamo anche individuarle mediante il metodo della piastra di agar: si striscia la goccia di sospensione batterica con l’ansa di platino e si mettono le colonie batteriche sul vetrino portaoggetti in una goccia di soluzione fisiologica per osservare se i batteri sono mobili o meno. Possiamo usare anche il tubo di agar molle dove la % di agar è minore rispetto al brodo in cui è immerso: i batteri immobili crescono solo lungo il canale procurato dall’ago per l’inseminazione nell’agar, i batteri mobili crescono anche nelle aree adiacenti.

Granuli o inclusioni intracitoplasmatiche

I granuli sono strutture facoltative tipiche del genere Corynebacterium, come la specie difteriae, cioè batteri Gram+, bastoncellari, dotati di queste granulazioni ai poli, detti anche granuli di volutina o metacromatici, messi in evidenza mediante il metodo di Neisser-Ginsil: il materiale allestito sul vetrino portaoggetti viene sottoposto a miscela di Neisser cioè blu di metilene acetico cristal violetto, si mordenza con Lugol cioè soluzione a base di iodio ioduro potassico acido lattico, si lava, si colora il corpo batterico con vesuvina o crisoidina. Il corpo batterico assumerà un colore grigio-rosso o grigio-arancio, i granuli un colore blu-viola.

Spore

Le spore sono delle vere e proprie cellule che consentono la sopravvivenza al batterio in condizioni ambientali sfavorevoli. Non tutti i batteri presentano le spore, per cui si fa una distinzione tra batteri sporigeni e non asporigeni.

A seconda della posizione della spora si fa una distinzione tra:

• Battridio: la spora è in posizione centrale non eccedente il trasverso del batterio (Bacillus a.).
• Clostridio: la spora è in posizione centrale eccedente il trasverso del batterio, alterando i contorni del batterio (Gangrena gassosa).
• Pletridio: la spora è in posizione polare, ad un’estremità, tale da deformare il corpo batterico (Clostridium tetani: sporigeno anaerobio).

Quando un batterio si trova in condizioni ambientali sfavorevoli, avviene il fenomeno della sporulazione o sporogenesi cioè la separazione di materiale citoplasmatico fertile con formazione di 4 involucri che lo circondano e che dall’interno all’esterno sono: membrana citoplasmatica, corteccia o cortex, tunica interna, tunica esterna. La pluristratificazione degli involucri rappresenta il passaggio da forma vegetativa a spora favorendo la sopravvivenza dei batteri in ambienti sfavorevoli.

Quando le condizioni ambientali si normalizzano si ha la germinazione con scomparsa degli involucri aggiuntivi, cioè si ha il passaggio dalla spora a forma vegetativa e il batterio assume H₂O dall’esterno.

I batteri sporigeni resistono a T°C di 100-120°C per ~ 10 min, mentre i batteri asporigeni già a 70-80°C vengono distrutti. Tra i batteri asporigeni solo lo pneumococco riesce a resistere in ambienti ostili. Le spore vengono messe in evidenza mediante la colorazione di Alessandrini.

Fimbrie

Le fimbrie sono strutture ultramicroscopiche, appendici filamentose numerosissime intorno al corpo batterico, esili, corte o piene, tipiche soprattutto dei Gram- (Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae), mentre l’unico Gram+ dotato di fimbrie è il Corynebacterium renale.

Le fimbrie hanno lunghezza di 0,2-20 nm, spessore di 3-14 nm, hanno funzione di adesività tra il batterio e i tessuti, come le cellule epiteliali di rivestimento della mucosa delle vie respiratorie con attività cilio-statica e cilio-tossica cioè prima bloccano le ciglia vibratili e poi le distruggono, oppure delle vie urinarie impedendo la rimozione del batterio attraverso il flusso urinario. Quindi il vaccino deve avere la proprietà di contrastare la funzione di adesività delle fimbrie.

Le fimbrie possono essere identificate al M.E. o per la loro capacità di agglutinare le emazie, per cui sono dette emoagglutinine filamentose, che messe in una soluzione a base di emazie e mannoso sono distinte in mannosio-resistenti se agglutinano le emazie (MR) e mannosio sensibili se non agglutinano le emazie (MS).

Pili

I pili sono strutture numerosissime, esili, corte e piene, distinti in comuni e somatici, hanno funzione di adesività soprattutto a livello della mucosa intestinale. Inoltre, abbiamo i pili sessuali lunghi, larghi e cavi, non molto numerosi, che presentano una specie di canale che consente la comunicazione tra cellule batteriche adiacenti favorendo il trasferimento del materiale genetico tra le cellule batteriche stesse o di specie diverse, favorendo la resistenza agli antibiotici.

Esame batterioscopico

L’esame batterioscopico avviene mediante osservazioni al M.O. di materiale fresco fissato e colorato o allestiscono dei terreni di coltura. Nell’esame a fresco si studia materiale patologico prelevato dalla sede dell’infezione cioè pus, liquor, feci, urine, che contengono i batteri, eritrociti, leucociti, detriti cellulari, oppure si usano materiali coltivati che contengono solo i batteri che riescono a moltiplicarsi in poche ore.

L’allestimento del preparato avviene ponendo la sospensione batterica tra il vetrino portaoggetti e il vetrino coprioggetti mediante la pipetta di Pasteur che consente di aspirare i materiali liquidi oppure mediante l’ansa di platino o nichel-cromo che consente di prelevare materiali solidi e liquidi. Mediante il microscopio con obiettivo ad immersione, si valuta la forma dei batteri, la mobilità e altre caratteristiche strutturali fondamentali per il loro riconoscimento.