Appunti del corso di Microbiologia

Università degli studi di Verona

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Appunti del corso di Microbiologia

Prof.ssa Annarita Mazzariol

Di Alberto Zorzi

Indice

Batteriologia generale

• La cellula procariote p. 12
• Patogenicità batterica p. 10
• Antibiotici e loro meccanismo d’azione p. 14
• Meccanismi di resistenza agli antibiotici p. 21
• Iter diagnostico per le infezioni batteriche p. 24

Batteriologia speciale

• Stafilococchi p. 32
• Streptococchi p. 37
• Clostridi p. 43
• Bacteroides p. 47
• Corinebatteri p. 48
• Enterobatteri p. 50
• Pseudomonas Aeruginosa p. 56
• Emofili p. 58
• Bordetelle p. 60
• Brucelle p. 62
• Legionella p. 32
• Vibrioni p. 64
• Helicobacter Pylori p. 65
• Campylobacter p. 67
• Neisserie p. 68
• Micoplasmi p. 72
• Clamidie p. 73
• Spirochete p. 75
• Micobatteri p. 79
• Altri patogeni p. 82

Virologia generale

• I virus p. 86
• Il ciclo replicativo virale p. 88
• Patogenesi virale p. 93
• Diagnosi virologica p. 95
• Terapia: antivirali ed interferoni p. 98

Virologia speciale

• Herpesviridae p. 102
• Orthomyxoviridae p. 106
• Coronaviridae p. 109
• Paramyxoviridae p. 110
• Rabdovirus p. 114
• Picornaviridae p. 115
• Rotavirus p. 118
• Caliciviridae p. 118
• Virus delle febbri emorragiche p. 119
• Virus delle encefaliti virali p. 122
• Virus epatitici maggiori p. 123
• Retrovirus - HIV p. 127
• Adenovirus p. 131
• Papillomavirus p. 133
• Poliomavirus p. 134
• Parvovirus p. 135
• Togaviridae - rosolia p. 136
• Poxiviridae p. 137

Parassitologia

• Parassitologia p. 138
• Protozoi p. 139
• Giardia p. 140
• Trichomonas vaginalis p. 140
• Entameba histolytica p. 141
• Toxoplasma gondii p. 142
• Plasmodio della malaria p. 143

Micologia

• Micologia p. 147
• Micosi superficiali
• Malassetia furfur p. 151
• Candida p. 151
• Micosi invasive
• Candidosi invasiva p. 153
• Cryptococcus neoformans p. 154
• Micosi da funghi filamentosi
• Dermatofitosi - tigne p. 156
• Evasione del microrganismo p. 157
• Histoplasma Capsulatum p. 158
• Antimicotici p. 159

Batteriologia generale

Batteriologia

La batteriologia è la branca della microbiologia che si occupa dello studio dei batteri, microrganismi procarioti quindi fondamentalmente diversi dalle nostre cellule, eucarioti come peraltro miceti e parassiti, due altre categorie di studio della microbiologia. Le differenze principali tra eucarioti e procarioti riguardano:

• Nucleo: assente nei procarioti, (pro-cariote, prima del carion=nucleo); i procarioti possiedono comunque materiale genetico organizzato in un cromosoma, che non è però delimitato da una membrana nucleare, non è quindi ben differenziato dal resto della cellula ma è libero nel citoplasma; manca anche il fuso mitotico (per cui i processi di riproduzione sono diversi);
• Membrane interne alla cellula come quelle di mitocondri e cloroplasti non sono presenti nei procarioti, tutti i processi, anche la respirazione cellulare, sono svolti a livello della membrana plasmatica; gli unici organuli presenti sono i ribosomi, comunque diversi da quelli eucarioti;
• Riproduzione: sessuata negli eucarioti, asessuata nei procarioti; la riproduzione asessuata non prevede scambio di materiale genetico per cui il batterio si replica sempre uguale a sé stesso. Questo non vuol dire che non ci sia scambio genetico tra i batteri (che anzi è frequente e determina il fenomeno della resistenza agli antibiotici), ma questo non avviene durante la riproduzione ma in un processo separato, cosa che li differenzia notevolmente dalle cellule eucariotiche;
• Metabolismo: i batteri sono spesso molto autonomi nel procurarsi il nutrimento dal momento che presentano un metabolismo molto ricco in grado di costruire tutti i precursori necessari;
• Parete cellulare: unica dei batteri, che non ha niente a che vedere con la parete cellulare dei funghi o delle cellule vegetali, totalmente assente in quelle animali;

La cellula procariote

La struttura di una cellula procariote è estremamente più semplice di quella di una procariote, con tutti i suoi vari organuli. In una cellula procariote, dall’esterno all’interno, troviamo la capsula (se presente), la parete cellulare, la membrana citoplasmatica, il citosol con all’interno dispersi ribosomi ed il cromosoma. In certe classi di batteri ci possono poi essere flagelli o altre strutture accessorie.

Capsula

La capsula è la struttura più esterna che si può trovare in una cellula batterica; essa è una struttura accessoria dato che non si trova in tutti i batteri, ma è una componente molto importante per quanto riguarda la loro patogenicità. La capsula è un involucro amorfo, una impalcatura non ben determinata costituita da polisaccaridi secreti dal batterio che rimangono adesi alla cellula batterica, creando un secondo involucro esterno a quello della parete cellulare.

• Media l'adesione alle mucose, grazie alla sua natura polisaccaridica, permettendone la colonizzazione, step fondamentale della patogenicità dei batteri;
• Attività antifagocitaria, la capsula impedisce l'azione dei polimorfonucleati: questi riconoscono i microrganismi patogeni grazie a PAMP, antigeni generalmente proteici, che rilevano sulla superficie cellulare di questi ultimi; la capsula funge da copertura mascherando questi profili antigenici impedendo il riconoscimento dei batteri. Normalmente dunque i batteri capsulati sfuggono all'azione del sistema immunitario riuscendo ad arrivare a distretti molto profondi come le meningi;
• Formazione del biofilm: i dispositivi medici (cateteri, protesi etc.) sono generalmente costituiti di plastica inerte su cui i batteri non sono in grado di aderire e quindi di colonizzare. La capsula dei batteri capsulati permette loro di costituire il biofilm, una pellicola tramite riescono ad aderire alle superfici plastiche di questi dispositivi. Sul biofilm possono proliferare peraltro anche batteri non capsulati, che sfruttano quello prodotto dai capsulati, e al suo interno spesso gli antibiotici non sono attivi;

Parete cellulare

La parete cellulare è la struttura più esterna dei batteri sprovvisti di capsula. Questa è un involucro rigido costituito dal peptidoglicano, una sostanza caratteristica nettamente diversa da quella che forma la parete vegetale e fungina (la chitina, assente in quella dei batteri) e che non ha uguali in natura.

Struttura

Il peptidoglicano è un polimero complesso, è quindi formato da una unità di base che si ripete moltissime volte. L’unità di base è costituito da:

• Due zuccheri
  • N-acetilglucosammina: è una sostanza presente in natura, largamente presente anche nelle cellule eucariotiche;
  • Acido N-acetilmuramico: non è presente in natura e viene sintetizzato esclusivamente dai batteri a partire dalla N-acetilglucosammina;
• Tetrapeptide: varia tra le diverse specie di batteri, che però condividono tutti gli ultimi due dei 4 amminoacidi che lo formano, che sono sempre D-alanina. Gli amminoacidi in natura sono presenti solo nella forma L, sono trasformati nella forma D da una racemasi;

Ogni unità di base è quindi formata dai due zuccheri e dal tetrapeptide legati uno in fila all’altro; dal legame tra l’N-acetilglucosammina e il tetrapeptide si formano lunghi filamenti di peptidoglicano, filamenti che si legano tra di loro attraverso le D-alanina del tetrapeptide con i cosiddetti legami crociati (o direttamente tra le D-alanine o tramite interposizione di pentaglicine), formando una rete tridimensionale.

Il peptidoglicano è la componente peculiare della parete cellulare di tutti i batteri, di cui però non è l’unico componente ed in cui è presente in modo differente. In base a questo differenza i batteri sono classificati in:

• GRAM positivi (GRAM+): il peptidoglicano disposto in numerosi strati (fino a 40) rappresenta il 95% della parete cellulare; il restante 5% è formato da due tipi di acidi grassi derivati dal glicerolo inseriti nel peptidoglicano:
  • Acidi teicoici, piccoli, disposti in superficie e connessi solo al peptidoglicano;
  • Acidi lipoteicoici, attraversano completamente lo strato di peptidoglicano e si ancorano alla membrana plasmatica, svolgendo quindi azione di ancoraggio tra questa e la parete cellulare;
• GRAM negativi (GRAM-): il peptidoglicano è presente anche nei GRAM- nei quali però costituisce solo uno strato sottilissimo, non è quindi il principale costituente della parete come lo è nei GRAM+: è fondamentale, ma non preponderante quantitativamente. Questi pochi strati non sono però da soli sufficienti a garantire la tenuta osmotica, funzione fondamentale della parete cellulare: vi è quindi una cosiddetta membrana esterna, con caratteristiche peculiari tra cui spicca l'impermeabilità. Le infezioni da GRAM- sono peggiori di quelle GRAM+ perché la membrana esterna impermeabile rende inefficaci molti antibiotici, che fanno più fatica a raggiungere i loro bersagli intracellulari. La membrana esterna non ha la stessa composizione di quella citoplasmatica ed è ancorata a quest’ultima tramite lipoproteine (come gli acidi lipoteicoici per i GRAM+). Essa è una membrana bilaminare, ma asimmetrica, i due foglietti non hanno dunque la stessa composizione:
  • Il foglietto interno, a contatto con il peptidoglicano, è un normale strato di fosfolipidi come nella membrana citoplasmatica;
  • Il foglietto esterno è costituito da lipopolisaccaride (LPS), una endotossina formata da acidi grassi con catene molto lunghe e complesse a cui sono legati diversi zuccheri. L’LPS è formato da tre porzioni:
    • Lipide A, molto simile ad un fosfolipide, è la parte che funge da endotossina vera e propria;
    • Core;
    • Antigene 0/somatico, formato da unità polisaccaridiche ripetute;

La colorazione di GRAM

La colorazione di GRAM è una colorazione bicromica detta differenziale perché si basa su una reazione differente tra diverse cellule. La reazione differenziata è dovuta alla differenza strutturale nella parete cellulare delle due classi di batteri: nei GRAM+ è costituita da un grosso strato di peptidoglicano con inseriti acidi teicoici e lipoteicoici; quella dei GRAM- è formata da un sottile strato di peptidoglicano circondato da una membrana esterna asimmetrica il cui foglietto interno è uguale a quello della membrana citoplasmatica mentre quello esterno è costituito da LPS. Il componente determinante per la reazione differenziata è il foglietto esterno della membrana esterna dei GRAM-: l’LPS ha una grossa componente lipidica, e sono proprio i lipidi che vengono colorati diversamente da questa tecnica. Una volta che i batteri sono fissati su un vetrino sono sottoposti ai seguenti passaggi:

1. Immersione in una soluzione di cristalvioletto che penetra sia il peptidoglicano che la membrana esterna —> sia GRAM+ che GRAM- appaiono blu;
2. Fissaggio del colorante alla parete esterna dei batteri con il Lugol —> permane la colorazione blu;
3. Decolorazione in alcol: il peptidoglicano non si scioglie, quindi la parete dei GRAM+ rimane colorata dal blu che aveva impregnato il peptidoglicano; i lipidi dell’LPS che costituisce il foglietto esterno della membrana esterna dei GRAM- invece in alcol si discioglie, così che i GRAM- perdono la colorazione blu: GRAM+ —> blu; GRAM- —> incolore;
4. Colorazione con safranina, rosso, che penetra sia nei GRAM+ che GRAM-: il rosso non è però molto evidente rispetto al blu, per cui: GRAM+ —> blu/violetto; GRAM- —> rosso

Spazio periplasmico

Lo spazio che si trova tra membrana citoplasmatica e membrana esterna della parete cellulare è detto spazio periplasmico, spazio che a differenza di quanto si riteneva in passato è reale e non virtuale: esso costituirebbe addirittura tra il 20 ed il 40% del volume cellulare totale. In esso si trova il peptidoglicano ed una matrice proteica gelatinosa in cui si riversano le secrezioni della cellula batterica.

I GRAM- sfruttano questo spazio per concentrare le esotossine e gli enzimi di resistenza, sostanze che quando prodotte dai GRAM+ (nei quali non esiste lo spazio periplasmico) si disperdono invece nel mezzo: i GRAM+ devono quindi produrre maggiori concentrazioni di queste sostanze perché queste risultino efficaci.

Porine

La membrana esterna è attraversata dalle porine, strutture proteiche attraverso cui i batteri attuano lo scambio di sostanze tra interno ed esterno. Sono solitamente omoproteine trimeriche (quindi formate dall’associazione di tre monomeri identici) che formano canali attraverso cui passano piccoli soluti come amminoacidi, zuccheri e ioni minerali. Per sostanze più grandi ci sono invece sistemi di trasporto attivo come nelle cellule eucarioti. Alcuni antibiotici possono penetrare nella cellula perché mimano sostanze che normalmente passano nelle porine, per esempio un amminoacido.

• Protezione dalla pressione osmotica: la rigidità della parete cellulare protegge il batterio dalla pressione osmotica, che è particolarmente alta in un batterio rispetto ad una cellula eucariote a causa delle sue dimensioni estremamente ridotte: senza la parete cellulare i soluti del mezzo si riverserebbero in massa dentro alla cellula determinando la lisi del batterio. La fondamentale importanza di questa struttura è sottolineata dal fatto che essa è il bersaglio della maggior parte degli antibiotici;
• Ruolo nella replicazione: la parete cellulare è talmente importante che essa non può presentare pori neanche durante la riproduzione. Durante la replicazione durante il quale essa si duplica in modo fluido, senza presentare mai alcuna discontinuità sulla sua superficie che porterebbe alla lisi osmotica della cellula;
• Determina la forma dei batteri, data la sua rigidità impone una forma abbastanza fissa al batterio; in base a questa forma i batteri vengono classificati in: cocchi (sferoidali), bacilli (a forma di bastoncino), vibrioni (a virgola) spirilli (lineari e leggermente avvolti a spirale);

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica dei procarioti strutturalmente è (da certi libri anche detta “membrana interna”) praticamente identica a quella degli eucarioti; la differenza principale tra le due è l’assenza degli steroli in quella procariote: questi nella cellula eucariote garantiscono una certa solidità e robustezza alla membrana, funzione che nei procarioti è svolta dalla parete cellulare. Come per gli eucarioti una importante funzione della membrana citoplasmatica è delimitare la cellula e mediarne gli scambi con l’esterno, ma nei batteri essa è particolarmente importante dal momento che svolge numerose altre funzioni che negli eucarioti sono invece a carico degli organelli citoplasmatici.

Caratteristica della membrana citoplasmatica procariote è la presenza di invaginazioni dette mesosomi. Uno di questi ha la funzione specifica di fungere da punto di attacco per il cromosoma, che quindi non è limitato all’interno del nucleo ma non è neanche completamente libero nel citoplasma: questo attacco è fondamentale per garantire una corretta duplicazione del batterio per far si che ognuna delle cellule figlie abbia un cromosoma. Dato che la maggior parte delle funzioni della cellula batterica si svolgono a livello della membrana queste invaginazioni possono essere considerate come un mezzo per aumentare la superficie.

• Permeabilità e trasporto di composti attraverso la membrana: la membrana cellulare è una barriera osmotica che controlla entrata e uscita di sostanze (proteine, amminoacidi, ioni etc.) tramite:
  • Diffusione semplice: è il caso dell’acqua che fluisce secondo gradiente di concentrazione attraverso canali regolati nella loro apertura e chiusura; altre sostanze solubili in acqua come il glicerolo sfruttano questa diffusione facilitata; (dal momento che disciogliendosi in acqua ne possono sfruttare i canali)
  • Sistemi di trasporto a scambio di ioni, molto comuni nei batteri aerobi; Il movimento della sostanze è accompagnato da uno scambio di ioni, nello stesso verso o in verso contrario; (sinporto) (antiporto)
  • Trasportatori ABC (ATP - binding - cassette): sono trasportatori attivi in cui l'energia messa in gioco non è quindi la forza protonica ma l'utilizzo di ATP come fonte di energia. Un esempio è il trasporto del galattosio: una proteina lega lo zucchero e lo trasporta all’interno grazie all’idrolisi dell'ATP ad ADP+P;
  • Traslocazione di gruppo, in cui si aggiunge un gruppo chimico ad una sostanza; è un trasporto che richiede più di una proteina, quindi non solo il trasportatore in senso stretto. Un esempio è il trasferimento del glucosio nella cellula batterica, dove troviamo un sistema trasportatore e uno di fosfotransferasi; il glucosio penetra per diffusione semplice nella cellula ma allo stesso modo ne esce: la cellula per fermare il glucosio all’interno lo fosforila a glucosio 6 fosfato (G6P), che non può diffondere all’esterno. Il nome “traslocazione di gruppo” deriva quindi dal fatto che si “trasloca” un gruppo su una sostanza per trattenerla all’interno della cellula;
• Respirazione cellulare: nelle cellule eucarioti la respirazione avviene nei mitocondri/cloroplasti, che sono assenti nei batteri, dove questo processo si compie invece a livello della membrana citoplasmatica;