Appunti corso completo Microbiologia Applicata

Microbiologia applicata generale

Sterilizzazione

La sterilizzazione con calore umido è più efficace perché conduce meglio il calore e la temperatura e tempo sono molto più contenuti rispetto all’utilizzo del calore secco. I rapporti tempo e temperatura si scelgono a seconda del tipo di terreno che abbiamo; ci sono molecole che vanno incontro a instabilità termica, reazioni di imbrunimento, che sottraggono zuccheri al terreno. Ci sono costituenti che devono essere sterilizzati a parte perché provocherebbero imbrunimento o caramelizzazione oppure hanno bisogno di un’altra sterilizzazione perché termolabili (antibiotici, vitamine). Queste vengono sterilizzate per filtrazione con filtri di pori inferiori al diametro dei batteri. Dopodiché, vengono assemblati garantendo sempre la sterilità.

Leggi che regolano la sterilizzazione

Tempo di riduzione decimale: tempo necessario per inattivare il 90%, ossia per ridurre di 10 la popolazione microbica a una determinata temperatura. È molto influenzato dalla temperatura: più aumenta la temperatura e più il tempo diminuisce. Per misurare il tempo di riduzione decimale creo una sospensione a carica nota nella matrice che dovrò sterilizzare e vado a costruirmi queste rette preparando campioni di aliquote diverse degli stessi microrganismi e queste aliquote verranno esposte a temperature diverse. Poi faccio un prelievo e, mediante diluizione e piastramento, conto i microrganismi, oppure con citometria a flusso. Ciò mi dice la temperatura più efficace per avere la riduzione della carica microbica in quella condizione (stessa matrice alimentare perché c’è un effetto protettivo). Pertanto, questo parametro indica la sensibilità termica di quella specie/ceppo (termoresistenza o termosensibilità).

Il tempo di riduzione decimale è in funzione della temperatura (Legge di Bigelow). Se metto D considerando il numero di microrganismi al tempo iniziale e finale a una certa temperatura, ottengo il 2^o grafico (log D minuti rispetto alla temperatura) ottengo Z. Il grafico rappresenta la curva di morte termica di un microrganismo, Z rappresenta l’aumento di temperatura che devo realizzare per avere una riduzione di D di un fattore 10.

D = resistenza di un microrganismo esposto a una precisa temperatura.

Z = resistenza di un microrganismo quando esposto a differenti temperature di trattamento.

Lavorare in sterilità

Il becco Bunsen funziona a metano, creando una sterilità nel suo vicino. La fiamma gialla è una fiamma riducente che crea oscillazioni e non va bene nel contesto microbiologico perché il sistema deve essere omogeneo, pertanto si usa una fiamma azzurra ossidante, ossia fluisce ossigeno e si miscela con il metano rendendo la fiamma di colore azzurro al centro e trasparente ai lati. Differenze: fiamma ossidante più stabile e più calda che garantisce un intorno di lavoro sterile più ampio di quello garantito da una fiamma riducente.

Come preparare un terreno di coltura

Preparato in beuta pesandolo e sciogliendolo in acqua, aggiungendo agar se necessario per ottenere piastre Petri. Se il terreno deve rimanere liquido, non si aggiunge agar. L’Agar non interferisce con le caratteristiche chimico fisiche del terreno, non interferisce a livello di nutrimenti, è inerte, si scioglie scaldando il terreno a 100°C, inizia a solidificare al di sotto dei 40°C e ciò consente di versarlo nella piastra Petri e poi farlo solidificare.

Queste operazioni si fanno sopra il becco Bunsen con fiamma ossidante per garantire la sterilità. Una volta che le piastre sono preparate, si hanno 2 possibilità di preparazione dell’inoculo:

• Piastramento superficiale o spatolamento: in condizioni di sterilità il campione viene depositato con una pipetta sterile sulla superficie solida del terreno, poi si usa una spatola per distribuire la goccia di sospensione microbica su tutta la piastra in modo da occupare tutta la superficie possibile. La parte liquida della sospensione viene assorbita dal terreno gelificato, le cellule si trattengono sulla parte solida del terreno. Poi la piastra viene chiusa, capovolta e sottoposta a incubazione. Si ha poi lo sviluppo della colonia a seconda della carica microbica iniziale. Il quantitativo di campione da depositare è 0,1 mL (volumi superiori non verrebbero assorbiti e quindi si forma un film liquido sulla piastra). Contando le colonie e sapendo il volume iniziale risalgo al numero di microrganismi. L’incubazione (24/48 ore) viene fatta capovolgendo le piastre perché se non capovolgo si forma condensa che si accumula e gocciola sul terreno e si forma un film sulla superficie, e i microrganismi cresceranno su questo film e non avrò formazione della colonia. Se capovolgo, l’umidità esce dai bordi in modo da far fuoriuscire l’evaporazione del terreno. Le piastre capovolte consentono anche l’ingresso dell’aria e, se le piastre devono essere incubate a una determinata temperatura per un determinato tempo, scelgo se mettere le piastre in ambiente aerobio o anaerobio a seconda del tipo di microrganismo che sta crescendo.
• Piastramento per inglobamento: aggiungo la sospensione che contiene i microrganismi nella piastra vuota, la sospensione è liquida (temperatura sopra i gradi) e ciò mi consente di versare il terreno agarizzato nella piastra, miscelare il terreno con il volume di sospensione microbica che ho aggiunto e poi lascio solidificare, capovolgo nella fase di incubazione. Si usa un piastramento così quando dobbiamo contare microrganismi sensibili all’ossigeno oppure perché la conta viene meglio se le loro cellule sono inglobate nella sospensione e non in superficie. Il volume usato è maggiore (fino a 1 mL) perché non ho problemi di assorbimento sulla superficie.
• Piastramento per striscio superficiale: dividere la piastra in 3 o 4 quadranti, usando un’ansa preleva microrganismi cresciuti sulle piastre e poi inizia a depositarla procedendo a zig-zag appoggiando l’ansa sulla superficie fino a riempire il primo quadrante senza sollevare mai l’ansia dalla superficie. Il movimento a zig-zag mi consente di depositare tutte le cellule e pulire la mia ansa (diluisco le cellule). Poi alzo l’ansa e faccio lo stesso sul secondo quadrante, poi sollevo e faccio lo stesso sul terzo. Il ripetere di strisci partendo da un'unica colonia mi consente di diluire in modo progressivo nei vari quadranti. Il risultato sarà che nel primo quadrante è pieno di cellule che formano colonie ed essendo fitte si vede un’unica striscia, nel secondo si hanno sempre cellule molto vicine però man mano che procedo ho un effetto di diluizione e lascio cellule sempre più distanziate fino ad arrivare al terzo che ho cellule distanziate di diverso cm o mm. Partendo da una coltura ottengo così colonie singole e separate.

Differenze

Piastramento superficiale per piastramento o inglobamento: usato nella conta vitale. Questi sistemi di semina servono per ottenere colonie ben separate che si possono contare. L’unità di misura della conta vitale è l’UFC. Si parte da un volume noto.

Piastramento per striscio superficiale: Non può essere usato nella conta vitale (l’ansa non trasporta volumi definiti) questo sistema serve principalmente ad ottenere colonie singole a partire da una coltura pura senza tenere conto della concentrazione.

Risultato dalla semina di una comunità microbica (insieme di cellule che appartengono a specie e generi diversi) è una complessità di colonie di forma, colore e superficie diversa. Le cellule che si sviluppano non sono tutte quelle che sono presenti nel campione perché ci potrebbe essere una competizione sui nutrienti oppure produzione di antibiotici da parte di una specie. Oppure il fattore principale è il terreno di coltura costituito da nutrienti che un microrganismo non riesce a utilizzare (il terreno è selettivo) o la presenza o meno di ossigeno (crescono solo aerobi o anaerobi) e infine la temperatura. È per quello che, in base alle condizioni, al tipo di terreno e alle condizioni esterne, cresceranno solo determinate specie.

Descrizione e sviluppo delle colonie

Le colonie devono essere coltivate in coltura pura e per essere descritte vanno presi in riferimento spessore (piatte, convesse, cupoliformi, umbonate, sopraelevate); margine (regolare, ondulato, lobato, eroso, filamentoso, increspato) e il colore. La dimensione e la superficie (liscia, opaca, ecc.) sono altri due parametri descrittivi. Descritta la colonia, non è possibile a priori guardando queste caratteristiche dire che si tratta di un particolare microrganismo (non ha rilevanza tassonomica). C’è un solo caso: Bacillus mycoides è un gram +, sporigeno. Le colonie sono particolari pertanto è facilmente riconoscibile. Le colonie invadono la superficie della piastra. Piastre incubate in aerobiosi. La colonia è fatta da ricciolini che ruotano in un senso; ci sono varianti più regolari o lobate. Possono avere colonie con rotazione dei ricci in senso orario o antiorario.

Come si sviluppa una colonia? Singola cellula di Bacillus, inizia a dividersi senza separarsi. Le catenelle iniziano ad allungarsi e, a un certo punto, si ha un ripiegamento e da questo le cellule si duplicano creando un’altra catenella formando la classica morfologia che dopo 14 ore di incubazione diventano visibili fino a formare i ricciolini destrogiro o levogiro.

Terreni di coltura

• Fonti di carbonio: CO2, CH4, C6H12O6, monosaccaridi, polisaccaridi, amminoacidi. Usare zucchero significa avere in membrana il sistema di trasporto dedicato allo zucchero e avere gli enzimi che metabolizzano tale zucchero. La capacità di usare le fonti di carbonio mi dà una chiave di lettura che mi permette di identificare il microrganismo che sto analizzando.
• Fonti di azoto: N2, NH3, amminoacidi, peptidi, proteine, ecc. Se ho come unica fonte di azoto delle proteine, devo presupporre che i microrganismi che crescono siano dotati di proteasi.
• Sali minerali
• Vitamine
• pH
• Eventuali agenti selettivi la crescita di alcuni gruppi microbici: antibiotici, sali biliari (seleziono enterobatteri che resistono ai sali biliari, stabilizzano i lipidi), NaCl (selezioni gli osmofili).
• Eventuali indicatori di pH (visualizzo se le colonie hanno prodotto degli acidi organici e quindi hanno variato il pH).
• Agar se prevista la preparazione di piastre (serve per solidificare il terreno).

Preparato il terreno, devo scegliere temperatura di incubazione, aerobiosi, anaerobiosi, tempo di incubazione. Tutto questo deve essere considerato per la preparazione del terreno di coltura, ogni componente ha una funzione ben precisa.

Formulazione terreno coltura

Es. lattobacilli. Dall’MRS (terreno che si usa generalmente per la crescita dei microrganismi) poi le varie case produttrici formulano terreni con diversi componenti. TABELLE CON TERRENO E CRESCITA SPECIFICA di un microrganismo. Anche il terreno più selettivo consente sempre in minima parte lo sviluppo di altri. Ci sono una serie di sottoprodotti dell’industria alimentare che vengono recuperati per usarli come fonti di azoto o lipidi per la coltivazione e sviluppo microbico. Per rendere i terreni più selettivi, aggiungo componenti (fruttosio, maltosio, varianti acidificanti) che mi rendono selettivo il terreno. Posso sfruttare il fatto che alcuni microrganismi usino zuccheri complessi come il maltosio oppure aggiunta di bile, oppure alcuni sono resistenti ad antibiotici (Pediococcus con vancomicina).

Es: sviluppo di un terreno per Streptococcus thermophilus: usa lattosio (antiporto), il glucosio consente fermentazione con produzione di acido lattico che consente acidificazione dell’ambiente. Altra caratteristica è che utilizza lo zucchero saccarosio e lo idrolizza a fruttosio e glucosio (usato nella glicolisi). Altra caratteristica peculiare della specie è la capacità di usare urea presente nel latte, ha un sistema di trasporto e un enzima ureasi che idrolizza urea in CO2 e 2 molecole di ammonio. Pertanto, ottiene ammoniaca usata per la sintesi di amminoacidi e basi azotate e di CO2 rilasciata. L’ammonio in eccesso esce ed alcalinizza l’ambiente. Ho 2 situazioni contrastanti, scede che all’inizio parte dell’ammoniaca tampona l’acido lattico prodotto.

Per sviluppare un terreno di coltura con queste caratteristiche uso come base latte scremato in polvere perché la componente grassa interferirebbe con la popolazione del prodotto (crea untuosità e viscosità). Aggiungo poi il saccarosio perché favorisce lo sviluppo del microrganismo perché fornisce energia. Aggiungo degli indicatori di pH (verde di bromocresolo e rosso di bromocresolo), la miscela di questi indicatori consente il passaggio da giallo-verde a blu-verde intenso in funzione del pH raggiunto. Poi aggiungo agar 15g/l per rendere solido e poi procedo alla sterilizzazione. Dopo la sterilizzazione aggiungo urea in quantità elevata per accentuare l’alcalinizzazione e perché tutto il terreno viene sterilizzato e la molecola è termosensibile, pertanto provocherebbe idrolisi dell’urea che non sarebbe disponibile per l’idrolisi enzimatica dell’enzima ureasi. Gli indicatori di pH tenderanno molto più verso il verde chiaro quanto più è acido il terreno.

L’effetto del metabolismo omofermentativo porta il terreno alla colorazione gialla e le colonie appaiono traslucide, tonde e regolari. Quando le colonie attivano l’idrolisi dell’urea (ureasi) idrolizzandola e alcalinizzando il terreno vira al blu e le colonie appaiono su sfondo blu di colore bianco, colorazione lucida e sempre tonda. Il terreno mi verifica simultaneamente l’acidificazione e l’attività ureasica delle cellule. Il microrganismo cresce, si duplica produce acido lattico e usa pochissima urea. Le piastre poi le sposto dalla temperatura di incubazione (37°C) e le lascio a T ambiente, succede che l’attività metabolica del thermophilus si interrompe (è termofilo) mentre l’attività ureasi continua a funzionare (ottengo effetto blu con colonie bianche).

Questo terreno mi permette di contare in modo differenziale in una popolazione mista di ceppi di streptococcus thermophilus quelli dotati di un’attività ureasi e quelli privi o con attività ureasica ridotta. È stato sviluppato un terreno di questo tipo perché l’attività ureasi è negativa perché crea tampone durante l’acidificazione (yogurt), più ammoniaca ho nel latte e più l’acidificazione è lenta. Acidificazione più rapido, meno costo, maggior standardizzazione del processo (urea nel latte non costante).

Partendo da latte scremato e aggiungendo man mano quantitativi di urea via via maggiori si osserva una gobba, ossia l’effetto di produzione di ammoniaca durante l’acidificazione. L’ammoniaca mi tampona l’acido lattico quindi ho un rallentamento iniziale di discesa del pH, poi l’ammoniaca diventa preponderante e pertanto ho una alcalinizzazione (sale) quando ho il termine dell’idrolisi dell’urea ho produzione di maggiore di acido lattico e pertanto la curva scende.

Citometria a flusso

Metodo di conta diretta che permette di avere la concentrazione e contare in modo preciso il numero di cellule presenti in una sospensione. Il primo citometro a flusso è stato ideato nel 1949 da Wallace Coulter e diede il nome alla macchina. Aveva ideato tale macchina che consente di rilevare cellule e particelle presenti in una sospensione. Lo strumento è costituito da corrente elettrica che una volta che incontrava una particella o una cellula segnalava la rilevazione della particella con un’interruzione della corrente elettrica e ogni volta che la corrente veniva interrotta segnalava la presenza della particella. Questo tipo di strumento brevetto è nato per la conta dei globuli bianchi e rossi delle cellule del sangue. Successivamente a tale camera di conta sono stati sviluppati dei citometri a flusso più articolati e complessi. Sviluppati sempre per fini clinici e medici. Solo negli anni ’70 si è arrivati alla citometria a flusso per i batteri. Le grandi limitazioni di tale metodo sono che il microbiologo va ad utilizzare uno strumento che è stato ideato per la conta di cellule più grandi. Il vantaggio invece è quello che il microbiologo si trova uno strumento in grado di vedere e contare anche delle cellule presenti in sospensione indipendentemente dalla loro capacità di crescere su terreno agarizzato (metodo colture indipendent method) ossia indipendente dalla coltivazione e coltivabilità delle cellule.

Citometria a flusso:

• Flow: flusso ossia le nostre cellule devono essere in un fluido (in sospensione) che possono essere presenti in un campione d’acqua; campione di suolo diluito, sostanze zuccherine, ecc.
• Cytometry: misurazione della cellula: si misurano la concentrazione (n° totale su volume); dimensione delle cellule; morfologia e complessità interna delle cellule (es. lievito).

Il citometro a flusso ha il vantaggio di essere un metodo che non passa per la coltivazione delle cellule, inoltre consente di contare una cellula per volta e caratterizzare dal punto di vista fisiologico una cellula per volta. Parti costituenti del citometro: 5 parti:

• Sistema fluidico: parte più importante che serve per analizzare una singola cellula per volta.
• Laser: fonte di eccitazione che ha diverse lunghezze d’onda la cui deviazione ci consente di stabilire la presenza di cellule o particolato.
• Filtri, lenti e specchi: che consentono la trasmissione della luce e della fluorescenza.
• Detector: rilevatori della fluorescenza e della luce del laser che viene deviato dalla presenza di cellula o particella.