Appunti corso completo Microbiologia Applicata

DIFFUSIONE DI MICRORGANISMI

Contatto diretto: trasmissione dell'agente microbico da un soggetto infetto portatore ad un soggetto suscettibile attraverso contatto, ad esempio con le mani o la cute.

Contatto indiretto: trasmissione dell'agente microbico ad un soggetto suscettibile attraverso contatto con oggetti, superfici o altri veicoli definiti.

Veicolo (di infezione): tutti gli oggetti che possono trasmettere agenti infettivi. I veicoli possono essere inerti, nei quali i microrganismi possono sopravvivere ma non riprodursi (esempio: acqua), veicoli favorenti che favoriscono la riproduzione dei microrganismi, veicoli ostacolanti nei quali la sopravvivenza dei microrganismi non è favorita (aria, sostanze acide).

Bio-aerosol: particelle aeree disperse composte da organismi viventi o loro derivati. Comprendono microrganismi e loro frammenti, tossine e prodotti di rifiuto in forma particellare prodotti da qualsiasi specie vivente.

Parametri microbiologici da valutare per qualità:

indoor:

• Carica batterica totale
• Carica fungina totale (muffe e lieviti)
• Allergeni
• Virus

Il d.Leg 81/2008 non fornisce valori di carica batterica o micetica cui riferirsi per valutare la qualità dell'aria degli ambienti di lavoro.

Controllo microbiologico dell'aria:

• Campionamento passivo
• Campionamento attivo

Campionamento passivo: piastre contenenti terreno culturale sono esposte per tempi opportuni aperte nell'ambiente, dove vengono lasciati sedimentare microrganismi. Il livello di raccolta influenzato dal grado di ventilazione dell'ambiente e dalle caratteristiche aerodinamiche delle particelle. La preoccupazione si esegue la conta delle colonie cresciute.

Indice microbico aria (IMA): il grado di inquinamento microbiologico dell'aria viene espresso in unità formanti colonia contate in una piastra di Petri di 90 mm (contenenti terreno Plate count agar) lasciata aperta per 1 ora ad un'altezza di 1 m da terra ed a una distanza di 1 m

ed ogni ostacolo fisico.

Norma UNI e 11527: 2014 Beni culturali, rilevamento della carica microbica dell'aria in ambienti interni, metodo di campionamento passivo mediante piastre di sedimentazione. Per l'elaborazione del resoconto di prova, la norma include un modello di scheda per il rilevamento dei dati dell'ambiente esaminato e una scheda per l'espressione dei risultati del monitoraggio.

Vantaggi: economico e semplice

Svantaggi: non è quantitativo, non è standardizzabile, influenzata da molti fattori e temperatura dell'aria, dimensione microrganismi e loro distribuzione. Non permette di associare il numero di microrganismi ad un dato volume d'aria ed è poco sensibile (rileva una carica microbica più bassa rispetto a quella determinabile con un campionamento attivo; è stato dimostrato infatti che la carica ambientale è così determinabile nella misura del 5-10% rispetto al dato reale)

Campionamento passivo: se si effettua

il monitoraggio con tecnica passiva si fa solitamente riferimento alle quattro classi di contaminazione microbica dell'area definiti dall'IMA. Il metodo IMA prevede che, in assenza di normative ufficialmente approvate, l'operatore individui quale classe di contaminazione microbica dell'aria adottare come limite massimo per l'ambiente da monitorare, in base al rischio di infezione che questo presenta. Le classi IMA e i livelli massimi accettabili dell'IMA sono stati definiti empiricamente. Questo è stato possibile grazie alla grande mole di dati raccolti molti diversi tipi di ambienti chiusi e all'aria aperta per diversi anni. Campionamento attivo: aspirazione di un volume noto di aria in un determinato intervallo di tempo appunto fornisce una valutazione del numero preciso di microrganismi vitali in un ambiente e fornisce la probabilità che qualcosa possa essere contaminato. I campionatori attivi aspirano volumi predeterminati di aria,convogliandoli sul terreno di coltura liquido o solido. Esistono diverse tipologie e modelli di campionatori attivi. Per esempio, SAS e Microflow sono campionatori monostadio ad impatto ortogonale, in cui l'aria aspirata viene inviata sulla superficie di un specifico terreno di coltura agarizzato, scelta seconda del microrganismo che si vogliono andare a rilevare. Per evitare la disidratazione dei terreni nutritivi, la durata dei prelievi è solitamente breve in presenza di alte cariche microbiche, è possibile la sottostima del rischio biologico per fenomeni di aggregazione microbica sulla piastra. I contaminanti che vengono presi in considerazione sono batteri e muffe campionate in case o in ambienti non industriali. Campionamento attivo: in Italia, Dacarro e collaboratori hanno proposto un altro tipo di approccio per la valutazione della carica batterica e fungina ambientale da correlare ad un giudizio sulla qualità dell'aria. Appunto tale approccio si

Il testo fornito riguarda l'utilizzo di specifici indici di contaminazione microbica. Sono stati statistimati diversi indici:

• Indice Globale Di Contaminazione Microbica: valutazione della contaminazione che tiene conto della crescita a 37 °C (diffusione di microrganismi dall'uomo o animali), tiene conto della carica batterica a 20 °C (m.opsicrofili), e poi la carica di miceti ossia lieviti e muffe.
• Indice Di Contaminazione Mesofila: rapporto della carica batterica a 30 °C e della carica batterica a 20 °C.
• Indici Di Amplificazione: Rapporto tra indice globale di contaminazione microbica all'interno della struttura e l'indice globale di contaminazione microbica all'esterno della struttura. Indica quanto la qualità dell'aria interna può impattare su quella esterna.

CONTROLLO MICROBICO DELLE SUPERFICI

Qualsiasi superficie che viene a contatto con il prodotto alimentare o che possa avere un impatto sulla sicurezza laboratorio ed è consumatore: piano di lavoro, piani di appoggio,

ripiani, tubazioni, valvole, utensili e serbatoi ecc... MOCA: materiali e oggetti a contatto con gli alimenti. Non sono disponibili testi normativi specifici per il controllo microbiologico ambientale per quanto riguarda la superficie, per quanto riguarda i limiti di accettabilità, né sono stati reperiti lavori in cui siano proposti valori indicativi o indici di riferimento analogamente a quelli proposti per la valutazione della qualità dell'aria indoor. La maggior parte dei lavori riportati in letteratura, inoltre, riporta valori finalizzati a valutare l'efficacia delle azioni di sanificazione condotte. Alcune norme tecniche e documenti di organismi scientifici possono costituire una base di riferimento anche per ambienti di lavoro in generale. Gli ambienti su cui maggiormente ci si confronta a livello nazionale e internazionale riguardano le analisi microbiologiche sulle superfici del settore sanitario-farmaceutico e quello alimentare. Tecniche di campionamento di

La contact Plate sono da 60 mm contengono terreno agarizzato con superficie convessa e consentono di determinare il valore di unità formanti colonia riferito all'area di contatto della piastra con la superficie interessata dal prelievo (almeno 10 secondi di contatto con peso costante 500g). Si possono usare per superfici piano oppure per campionare gli indumenti da lavoro.

La contact-slide sono costituite da un tubo sterile trasparente con all'interno, solidale con il tappo a vite, una paletta di plastica con una striscia di agar su entrambi i lati, anche con combinazioni terreni diversi. Dopo aver campionato con entrambi i lati, le piastre e le slide vengono poste nell'incubatore alla temperatura e tempo necessario. Appunto una stima della contaminazione superficiale si ottiene contando il numero di colonie sviluppate sulla superficie tamponata della slide (10 cm²).

Tamponi: diffusi per tamponare piccole superfici all'interno di una cornice per

delimitare la zona da campionare o per zone poco accessibili (esempio tubature, scoli).
Spugne sterile un sacchetto (sponge-bag): utili per superficie ampia e (maggiore di 100 cm²) lisce, ma anche non piane, punti difficilmente raggiungibili. La spugna viene aumentata con soluzione sterile estrisciata uniformemente sulla superficie da esaminare. Dopo il prelievo, la spugna va riposta in un sacchetto sterile con l'aggiunta di diluente, da cui, dopo un passaggio in Stomacher, verrà prelevata un'aliquota da inoculare in piastra Petri.
ISO 18593: 2004
Indicati i principi di questi quattro metodi, descritte tutti gli utensili appena parlato, inoltre viene descritto come poter andare a campionare nel caso in cui si sospetti che sulla superficie analizzata ci possano essere dei residui di disinfettante che possono andare a impattare sulla vita dei microrganismi che vogliamo andare a rilevare, pertanto vengono utilizzati degli agenti neutralizzanti che vanno aneutralizzazione dei residui di disinfettante presenti. Dopo aver risospeso il tampone o la spugna nel proprio diluente, si prelevano 1 ml dalla prima diluizione e poi si allestiscono diluizioni seriali per poter essere seminate nei depositi su appositi terreni di coltura. In base al terreno utilizzato (rosa bengala, PCA, ecc.), si decide se fare una semina per incorporamento o per spatolamento. Espressione dei risultati: sia con tampone che con il metodo della spugna, si applica la seguente formula: N = numero di UFC in 1 ml di liquido diluente F = quantità di diluente aggiunto A = superficie campionata D = reciproco della diluizione usata RIEPILOGO controllo microbiologico delle superfici (VEDI SLIDE) KIT RAPIDI: BIOLUMINESCENZA La tecnica della bioluminescenza è un test diretto che si basa sul foto-rilevamento. Si tratta di una tecnica semplice e molto utilizzata per monitorare lo stato di pulizia delle superfici nei vari settori lavorativi, in particolare nel campo dell'HACCP.possibilità di ottenere dati validi in pochi minuti, a differenza dei giorni necessari per l'esecuzione di test microbiologici che si basano sulla coltivazione. La tecnica si basa sul rilevamento dell'ATP, molecola presente sia nelle cellule procarioti che eucarioti e che fornisce l'energia necessaria per l'attività cellulare, pertanto la misura della presenza di cellule metabolicamente attive. La reazione utilizzata si basa sull'attività dell'enzima luciferasi, che in presenza di substrato luciferina emette fotoni, dunque luce, in maniera direttamente proporzionale alla quantità di ATP a disposizione attraverso la reazione di ossidazione a livello del gruppo prostetico della luciferina.
Bioluminometro: soluzione di enzima luciferasi, substrato luciferina e ioni Ca nel mezzo acquoso, debidamente isolata da una guaina sempre materiale plastico, che verrà rotta dalla pressione esercitata sul tampone inserito nella provetta.
Enzima

luciferasi: enzima redox; si usano più frequentemente quella di insetto e quella di batteri punt