Citologia e istologia

CITOLOGIA E ISTOLOGIA

Cellula tessuto organosistema o apparatoorganismo

La cellula è l’elemento biologico vivente più piccolo Cap

acità di poter crescere

La cellula è l’unità di base capace di vita propria Capacità di

movimento Cap

acità di riproduzione Cap

acità di adattamento all’a

mbiente

Divisione gerarchica di strutture biologiche:

• Molecole organiche piccole (es. nucleotidi, amminoacidi,

glucosio)

• Macromolecole ( DNA, proteine, cellulosa)

• Strutture sopra-molecolari (cromosoma, membrana, parete

cellulare)

• Organuli vari (nucleo, mitocondrio, cloroplasto)

• Cellula

Gli unici elementi chimici che sono compatibili con la vita sono:

H/O/N/C

Atomimolecolevirusbattericellule eucarioti

(dimensionalmente).

Queste strutture variano per composizione ma anche per

grandezza, per questo motivo sono utilizzati diversi strumenti a

seconda di cosa si vuole studiare.

Occhio umano: da poco meno di un millimetro a un kilometro

 Microscopio ottico: da poco meno di micrometro ( 10^-6) a

 poco più di un millimetro

Microscopio elettronico: da meno di un nanometro a circa 100

 micrometri Occhio umano

È una struttura “pari” che presenta

3 membrane: sclerotica ossia la

parte bianca con tessuto connettivo denso, fibroso e strutturale. La

coroidea e infine la retina, struttura trasparente dietro l’occhio. La

cornea presente davanti serve per far entrare la luce nell’occhio; la

cornea è un tessuto estremamente vascolarizzato e “nutre” la

retina con un pigmento che assorbe la luce. La retina percepisce la

luce grazie ai fotorecettori (coni e bastoncelli) che permettono

all’impulso nervoso di propagarsi trasformandosi in impulso

elettrico. Nella parte anteriore abbiamo la retina e la coroide che si

fondono e formano l’iride con la pupilla centrale. Il cristallino mette

a fuoco l’immagine cambiando la sua stessa forma. (concava-

lontano, piatta-vicino), la luce arriva infine nella fovea (e al nervo

ottico). Fotorecettori:

-coni= estremità più corta, sono necessari per la vista a colori, si

trovano al centro della retina

-bastoncelli= hanno una forma allungata, sono più sensibili alla luce

e la visione è in bianco e nero, sono presenti ai lati. Utili per la vista

al buio.

Il segmento esterno trasforma l’impulso visivo in elettrico. Il

segmento interno ha coni e bastoncelli come forma. Infine abbiamo

la sinapsi con i neurotrasmettitori (neuroni bipolari).

La retina rovesciata è la parte più sensibile all’interno dell’occhio.

Microscopio ottico: Presenta una struttura (detta corpo), un

tavolino di zona centrale (con i dischetti),

mosse da viti macrometriche e micrometriche

(movimenti lenti o veloci). Abbiamo poi una

sorgente luminosa da una lampadina, un

condensatore che focalizza il raggio luminoso,

il diaframma e gli obbiettivi (revolver, parte a

cui sono ancorati gli obbiettivi, detti a secco o

ad immersione a seconda di dove viene posta

la lente: aria o acqua/olio, quindi i primi non sono a “contatto

diretto” con una sostanza mentre i secondi si immergono nell’olio

aumentano la risoluzione.Il grado di risoluzione del microscopio è

definito da una formula ben precisa:

R= DELTA/ 2*n*senalfa. Il delta indica la lunghezza d’onda, l’n indica

l’indice di rifrazione (aumenta nel microscopio a immersione) e

infine l’angolo indica l’apertura angolare. Ci sono diversi tipi di

microscopio ottico:

- Microscopio a contrasto di fase (1930)= importante per la

biologia perché permette di osservare la cellula viva, le quali

“interferiscono” con la qualità dell’immagine solo per la

velocità di fase che causa un contrasto ottico.

- Microscopio a luce polarizzata=il fascio luminoso ha la luce

polarizzata (ossia i fasci migrano su piani paralleli tra di loro).

Presentano un polarizzatore ossia un filtro disposto in modo

parallelo che converge il flusso luminoso e infine un

analizzatore che è strutturalmente uguale ad un polarizzatore

ma disposto in modo perpendicolare ad esso.

- Microscopio a fluorescenza= utilizza la luce ultravioletta,

soprattutto nei composti fluorescenti (assorbe luce

nell’ultravioletto) ha una maggiore risoluzione perché sono

inferiori rispetto alla luce nel visibile. In natura esistono due

tipi di fluorescenza, una naturale come la vitamina A nei

cardiomiociti. L’altra artificiale, il DAPI che si lega al DNA e fa

vedere bene il nucleo. Oppure la GFP una proteina fluorescente

nel verde che si lega alla proteina da marcare.

La fonte luminosa arriva dalle onde elettromagnetiche o dai

raggi UV; il filtro di sbarramento accetta solo le onde che

possono eccitare il GFP, il campione verrà quindi eccitato

attraverso un altro filtro che fa passare solo la fluorescenza.

L’immunofluorescenza si trova ad esempio negli anticorpi che

riconoscono gli antigeni così si sono marcati gli anticorpi per

vedere come funzionano. L’anticorpo secondario riconosce la

regione costante di quello primario e si lega ad una cosa

fluorescente.

- Microscopio confocale= è a fluorescenza (diversi tanti quanti

sono i piani della sezione), inizialmente bidimensionale e poi

tridimensionale. Di solito questi campioni sono morti ma in

questo caso si sfrutta la tecnica del “photoblocking” ossia c’è

un prolungamento della fluorescenza fino alla perdita della sua

capacità di “illuminarsi”. Tecnica FRET: ossia utilizzo di due

fotocromi (GFP modificato) eccitati a lunghezze d’onda diverse,

molto vicini tra loro per illuminare cose diverse.

Microscopi elettronici:

I microscopi elettronici utilizzano il fascio di elettroni e non una fase

di luce diretta. Le lenti sono campi magnetici con un senalfa minore

di 90° e il potere di risoluzione è molto basso. Il fascio di elettroni

attraversa il tessuto e vengono illuminate le parti elettrodense delle

cellule, che non fanno passare gli elettroni.

Microscopio elettronico TEM

Viene utilizzato per analizzare l'ultrastruttura cellulare, invisibile al

microscopio ottico. Il principio di funzionamento si basa sull'uso di

un fascio di elettroni e una serie di lenti da elettromagneti. Il potere

risolutivo del TEM è 0,2 nm che è circa 10 volte maggiore di quello

del SEM. Gli elettroni emessi dal catodo vengono accelerati dalla

differenza di potenziale tra catodo e anodo e il fascio viene

convogliato da una lente elettromagnetica sul campione biologico.

Gli elettroni attraversano tutto il tubo cavo, in cui è applicato il

vuoto, e raggiunto il preparato vengono in parte assorbiti (zone

elettrondense), in parte deviati e in parte trasmessi, continuando

poi il loro percorso attraverso le lenti (obiettivo e intermedia) che

ingrandiscono l’immagine. Questa viene proiettata e ulteriormente

ingrandita dalla lente proiettiva sullo schermo. È possibile osservare

l’immagine direttamente attraverso una finestra di osservazione o

utilizzarla per impressionare una lastra fotografica. Il TEM fornisce le

immagini in bianco e nero, ma spesso le immagini ottenute

vengono successivamente colorate per essere più chiare e

comprensibili. I raggi elettronici sono dotati di scarso potere di

penetrazione, pertanto è necessario che il materiale da osservare

sia fissato, disidratato e ridotto in sezioni estremamente sottili (50-

80 nm di spessore).

microscopio a scansione SEM

Il è impiegato più che altro per

studiare la superficie esterna delle cellule, delineandone una

morfologia tridimensionale. Ha un potere risolutivo di circa 20 nm.

Si basa sul principio di un’immagine riflessa che deriva dal rimbalzo

degli elettroni sulla superficie del campione. Il pezzo di tessuto,

trattato con vapori di platino, o metalli pesanti in genere (per

renderlo riflettente agli elettroni) e non sezionato, viene sottoposto

ad un fascio molto sottile di elettroni, detti primari. Questo fascio

viene focalizzato su una piccola area e deflesso su tutta la

superficie. Gli elettroni riflessi, detti secondari, vengono raccolti da

un rivelatore di elettroni. Questo emette segnali che vengono poi

amplificati con un amplificatore elettronico. Il fascio colpisce infine

uno schermo televisivo fornendo un’immagine ingrandita e

tridimensionale dell’oggetto.

Preparazione dei campioni

I campioni si preparano in modo specifico:

Prelevazione dell’organo

 Fissaggio (per bloccare il processo degenerativo). Può essere

 fisica quando il campione subisce shock termico per più volte,

denaturando le proteine ed è poco usata perché si rischia di

rovinare il tessuto: oppure chimica con sostanze che creano

legami (detto cross-link) tra le molecole. Tipo formaldeide.

Lavaggio

 Disidratazione. Avviene con alcool via a via sempre più forti

 Chiarificazione (eliminazione della componente lipidica)

 Inclusione in paraffina (per i microscopio ottico) o in resine

 (microscopio elettronico)

Taglio al microtomo del campione in fette sottilissime

 Reidratazione (poiché la maggioranza di campioni colorati

 sono solubili in acqua)

Colorazione. Può essere diretta o indiretta. Queste possono

 essere poi semplici ossia con un'unica colorazione (es.

colorazione silver) o combinate (tricomiche)

Si mette il campione sul vetrino



Nei microscopi elettronici ci sono alcune differenze come

l’inclusione in resina e l’utilizzo di retine per permettere il passaggio

dei fasci di elettroni, il vetro ne assorbirebbe i fasci. Inoltre il taglio

viene fatto con il ultramicrotomo per tagli più sottili.

Studio specifico delle proteine: elettroforesi in gel di

poliocrilammide, lo studio avviene in base al peso delle stesse. Si

prendono le proteine e si fanno correre su un campo elettrico, la

divisione avviene per grandezza (migra sempre verso il polo +

perché trattate da detergenti che riempiono le proteine da cariche

negative) Le proteine più piccole saranno più veloci rispetto a quelle

grandi

Scala di grandezza crescente: atomi, molecole, virus, batteri,

cellula eucariote. Ad influire sono i legami ( singoli, doppi o tripli)

createsi tra gli atomi che formeranno a loro volta molecole (polari o

apolari). Importante per la biologia è il legame a idrogeno: si crea

quando un atomo di idrogeno si trova vicino ad atomi che

attraggono elettroni ( ossigeno o azoto), è un legame debole. Altri

tipi di legami deboli sono le forze d Van de waals, legami

elettrostatici tra atomi: a breve distanza due atomi interagiscono

debolmente tra loro grazie alla fluttuazione delle cariche elettriche (

dipoli temporanei) MA quando gli atomi si avvicinano troppo allora

si respingono. Questo tipo di forza è il principale potere limitante

delle conformazioni tra macromolecole.

La maggior parte delle cellule è composta d’acqua, tanto che molte

reazioni avvengono in ambiente acquoso ricco di Sali minerali.

Sebbene le cellule differiscano per grandezze e funzioni sono tutte

composte dai medesimi atomi e dalle stesse molecole. L’acqua

“interagisce” nelle forze, si notano infatti le forze idrofobiche ossia

l’acqua spinge i composti idrofobici (coloro che sono insolubili in

acqua) ad appaiarsi per limitare la rotture dei legami ad idrogeno

presenti tra le molecole d’acqua. Non si parla di veri e propri

legami, ma queste interazioni sono fondamentali nella cellula (es.

fosfolipidi nella membrana)

Mentre per i composti idrofili è facile sciogliersi in acqua essendo

quest’ultima un composto polare, quindi un ottimo solvente per la

maggior parte di sostanze.

Molecole organiche

Monomeri

Polimeri

Monosaccaridi

o Carboidrati

Acidi grassi

o Lipidi

Amminoacidi

o Proteine

Nucleotidi

o Acidi nucleici

Le reazioni che permettono di creare o distruggere i legami tra

monomeri per creare polimeri sono rispettivamente

CONDENSAZIONE e IDROLISI.

Zuccheri Triosi (3) Pentosi (5) Carbosi (6)

Aldosi gliceraldeide Ribosio Glucosio

Chetosi diidrossiaceton Ribulosio Fruttosio

e

Tuttavia in soluzione acquosa le catene carboniose tendono a

chiudersi ad anello, facendo reagire i gruppi chetonici o aldeidici

della molecola con un gruppo ossidrilico della stessa catena. Gli

isomeri del glucosio sono l’alfa-D-glucosio e il beta-D-glucosio, in cui

varia la posizione dell’idrogeno e dell’ossidrile del carbonio 1.

I monosaccaridi (glucosio e fruttosio) creano i disaccaridi ( maltosio,

glucosio+glucosio, lattosio, glucosio+galattosio, saccarosio ,

fruttosio+glucosio)e i polisaccaridi ( cellulosa, glicogeno e amido)

con reazioni di condensazione che creano legami glucosidici o a

idrogeno. Ci sono anche gli oligosaccaridi, composti da meno di 20

monosaccaridi.

Il glicogeno mantiene i suoi gruppi ossidrilici all’interno della

struttura circolare per evitare spreco di energia

Lipidi = Sono formati da acidi grassi: hanno una testa carbossilica

idrofila e una lunga catena carboniosa idrofoba.

Quest’ultima può presentare legami singoli o doppi tra

i diversi atomi di carbonio, e a seconda di questo la

catena sarà SATURA o INSATURA. I legami doppi

rendono la molecola in quel punto rigida, mentre nei legami singoli

le molecole ruotano intorno agli atomi di carbonio. Il glicerolo

esterificato è composto da OH-COOH.

Il gruppo ossidrilico della testa carboniosa si esterifica ( con

eliminazione d’acqua) con un alcool, il glicerolo, formando una

catena monoglicerida. Si possono creare anche digliceridi e

trigliceridi con rispettivamente due o tre catene di acidi grassi e

rispettivi gliceroli.

Nei lipidi semplici troviamo: trigliceridi e colesterolo.

Nei lipidi complessi troviamo: fosfolipidi, glicolipidi, steroidi

-Sono fondamentali, poiché compongono le membrane nucleari.

-Sono formate da due catene di acidi grassi, glicerolo, fosfato e

colina

-Sono anfipatici ( formati cioè da una parte idrofoba e una idrofila) e

formano i acqua i liposomi, diposizioni a sfera cava con teste

all’esterno e code all’interno.

Il colesterolo permette una scarsa idrofibilità. Nel caso i lipidi siano

legati allo zucchero si chiamano glicolipidi (es. definiscono i gruppi

sanguigni)

Proteine = polimeri di amminoacidi. I monomeri delle proteine sono

gli amminoacidi, composti da un carbonio alfa

centrale, un gruppo carbossilico, un gruppo

amminico, un idrogeno e una catena laterale che

cambia. Di queste ne esistono 20, una diversa per

ogni amminoacido, infatti gli amminoacidi essenziali sono 20 e sono

detti tali perché non sono sintetizzati dal nostro corpo ma dobbiamo

integrarli col cibo. Il legame avviene a livello delle ammine ed è

detto peptidico ed è molto flessibile.

Questa catena inoltre stabilisce se la molecola sarà polare ( ma non

carica) , apolare, basica o acida per questo sono detti anfoteri.

Tuttavia una caratteristica fondamentale per riconoscere degli

amminoacidi specifici è il ph isoelettrico, definito dalla coesistenza

del gruppo carbossilico (base) e dal gruppo amminico (acido).

Si descrivono con tre lettere anche se con l’avvento dei computer e

della classificazione genetica è risultato più semplice definirli con

una sola lettera.

Gli amminoacidi, monomeri, si legano per condensazione con

eliminazione di una molecola d’acqua e la catena è detta

polarizzata. Per rompere il legame tra amminoacidi si utilizzano gli

enzimi che tagliano i legami, successivamente si studia il PH tipico

di ogni amminoacido per riconoscerli.

Amminoacidi e proteine sono sostanze anfotere. Gli amminoacidi

possono essere polari, apolari, acidi e basici. I legami peptidici si

creano per condensazione con eliminazione d’acqua. La catena

proteica è detta polarizzata. Possono formarsi diverse strutture

Struttura primaria: sequenza lineare di amminoacidi

 Struttura secondaria: disposizione degli atomi nello spazio

 ( alfa elica o beta foglietto)

Struttura terziaria: disposizione ripiegata ( a gomitolo); legami

 disolfuro che si rompono in condizioni riducenti e si creano

invece in ambiente ossidante.

Struttura quaternaria: più catene peptidiche si accoppiano tra

 loro a formare un tetramero. Es. emoglobina.

Funzioni

Strutturali: forniscono supporto meccanico alla cellula e ai

 tessuti. ( collagene, elastina, tubulina, actina, cheratina alfa)

Trasporto: devono portare piccole molecole e ioni

 (sieroalbumina, emoglobina, transferrina, proteina vettore del

glucosio)

Recettori: captano i segnali che arrivano alle cellule per poi

 inviarle a chi di competenza (rodopsina, recettore dell’insulina

ecc…)

Segnali: trasferiscono segnali da una cellula all’altra ( insulina,

 fattore di crescita)

Accumulo: immagazzinano piccole cellule e ioni (caseina,

 ferritina)

Motrici : generano movimento nelle cellule e nei tessuti

 (miosina ecc…)

Regolatrici di geni: si legano al DNA per regolare i geni

 Enzimi: abbassano l’energia di attivazione velocizzando le

 reazioni chimiche.

Nucleotidi e acidi nucleici

Costituiti dai nucleotidi che sono i loro monomeri. Questi sono a

loro volta formati da uno zucchero ( ribosio, nel carbonio 2-primo

c’è un gruppo ossidrile, o desossiribosio nel carbonio 2-primo c’è un

idrogeno), base azotata ( adenina, guanina, citosina, timina, uracile)

e acido fosforico. I nucleoSidi sono invece l’insieme di base azotata

e lo zucchero.

Le basi azotate sono divisibili in pirimidine che sono singole

( uracile, citosina, timina) e purine che sono doppie (guanina e

adenina). L’appaiamento è sempre tra una pirimidina e una p