Citologia

-ORGANIZZAZIONE GENERALE DELLE CELLULE, VARIETA’ DI FORME E DIMENSIONI

Le dimensioni e le forme delle cellule sono estremamente variabili. Alcuni batteri possono avere diametri

di appena 0,2 µm, mentre alcune cellule vegetali arrivano no a 150 µm, sebbene la maggior parte delle

cellule eucariotiche misuri tra 10 e 30 µm. La dimensione è strettamente legata alla capacità della cellula di

svolgere le proprie attività metaboliche, poiché un aumento di volume richiede scambi più ef cienti di

sostanze con l’ambiente tramite la membrana plasmatica. Il rapporto super cie/volume è quindi un fattore

limitante: forme sferiche grandi risultano energeticamente svantaggiose, per cui molte cellule adottano forme

allungate, stellate o lenticolari.

La forma delle cellule è determinata dalla membrana plasmatica e soprattutto dal citoscheletro. Negli

animali, le forme ri ettono la funzione: le cellule epiteliali sono polarizzate con una parte basale ancorata e

una parte apicale con ciglia o microvilli; i macrofagi cambiano forma per migrare; i linfociti sono sferici; le

cellule muscolari sono allungate per la contrazione, mentre le cellule nervose hanno prolungamenti

specializzati per la trasmissione dell’informazione.

Le cellule vegetali mostrano anch’esse grande varietà di forme (allungate, ovali, rotondeggianti o

rettangolari), ma la loro forma è in gran parte determinata dalla parete cellulare, composta da cellulosa

nelle piante, chitina nei funghi e peptidoglicani nei batteri. Inoltre, le cellule vegetali possiedono organelli

assenti negli animali, come i cloroplasti, responsabili della fotosintesi, e i vacuoli, che mantengono la

pressione osmotica e contengono pigmenti ed enzimi idrolitici.

PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI DI CELLULE E TESSUTI

Il prelievo e la conservazione dei campioni biologici sono passaggi critici che in uenzano direttamente

l’af dabilità dei risultati. La raccolta di organi, tessuti o cellule è regolata per legge e consentita solo a scopo

diagnostico, terapeutico o di ricerca scienti ca.

La modalità di prelievo dipende dal tipo di tessuto e dagli obiettivi dello studio. In generale, i campioni

devono essere estratti rapidamente e sottoposti a procedure di ssazione, per interrompere subito i

processi autolitici (dovuti a variazioni di temperatura, ossigeno, pH, ecc.), prevenire la crescita batterica e

preservare le strutture cellulari.

È importante distinguere tra ssazione e conservazione:

• La conservazione mira a mantenere inalterate le proprietà bio siche del tessuto, spesso mediante

metodi criogenici, per periodi più o meno lunghi.

• La ssazione, invece, ha lo scopo di stabilizzare in modo controllato componenti strutturali (soprattutto

proteine) e le loro interazioni all’interno delle cellule o dei tessuti, modi candone chimicamente le

caratteristiche per preservarli.

ALLESTIMENTO DEI PREPARATI PER LA MICROSCOPIA OTTICA (PER L’OSSERVAZIONE DI

CELLULE FISSATE E COLORATE O VIVE)

Per l’osservazione al microscopio ottico, i campioni biologici devono seguire diversi passaggi:

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1. Fissazione: arresta le funzioni biologiche e stabilizza le strutture cellulari senza alterarne

l’organizzazione.

2. Disidratazione: rimuove l’acqua dalla cellula, necessaria perché l’acqua interferisce con l’osservazione

microscopica.

3. Inclusione: sostituisce l’acqua con un mezzo solido che permette di mantenere la struttura durante il

taglio.

4. Taglio: il campione viene sezionato in fette sottili per essere osservato.

5. Colorazione: evidenzia le diverse strutture tissutali e cellulari, rendendole distinguibili al microscopio,

altrimenti invisibili.

-FISSAZIONE

La ssazione è il trattamento dei tessuti con agenti chimici o sici per bloccare l’autolisi cellulare e

preservare la morfologia originaria del campione.

Fissazione chimica:

• Prevede l’uso di agenti stabilizzanti che penetrano rapidamente nelle cellule e formano legami

trasversali tra le proteine, immobilizzando le strutture macromolecolari.

• La durata è generalmente 12-24 ore.

• Parametri importanti: dimensione del frammento, temperatura, pH, concentrazione e volume del

ssativo (tipicamente 10:1).

• Esistono diverse tipologie di ssativi:

• Coagulanti: etanolo, acido acetico, acido picrico.

• Non coagulanti: formalina neutra tamponata, liquido di Bouin, tetrossido di osmio, bicromato di

potassio.

• Procedure di ssazione:

• Immersione: il campione piccolo viene immerso nel ssativo.

• Perfusione: il ssativo viene veicolato attraverso il sistema circolatorio, utile per organi facilmente

degradabili come il cervello, ma applicabile principalmente in animali di piccola taglia.

Fissazione sica:

• Si effettua tramite congelamento in azoto liquido (-170°C).

• Mantiene meglio l’antigenicità dei tessuti e preserva i lipidi, che altrimenti verrebbero persi nei

successivi passaggi di processamento per l’inclusione in paraf na.

In sintesi, la ssazione stabilizza i tessuti, impedisce la degradazione e prepara il campione per le fasi

successive di osservazione e analisi.

-DISIDRATAZIONE E DIAFANIZZAZIONE

La disidratazione serve a rimuovere l’acqua dai tessuti, essenziale perché le cellule sono principalmente

acquose. Il processo avviene immergendo gradualmente il campione in alcol a concentrazione crescente, da

etanolo 50% no a 100%, evitando così il raggrinzimento cellulare.

Dopo la disidratazione, il tessuto viene trattato con xilolo, un solvente organico che si miscela sia con l’alcol

sia con la paraf na. Lo xilolo agisce come diafanizzante, rendendo il tessuto trasparente e pronto per

l’in ltrazione con la paraf na.

In sintesi, questi passaggi preparano il campione alla successiva inclusione, garantendo una buona

conservazione della struttura cellulare e consentendo un’osservazione ottimale al microscopio.

-INCLUSIONE

Dopo la disidratazione e la diafanizzazione, il tessuto viene immerso in paraf na fusa (50-60 °C), che

agisce come mezzo di inclusione. Una volta solidi cata a temperatura ambiente, la paraf na fornisce

supporto meccanico al campione, permettendo di sezionarlo con il microtomo in fette sottili di 5-10 µm. La

paraf na è molto pratica perché può essere facilmente rimossa con solventi organici durante le fasi

successive di colorazione.

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-TAGLIO

Per ottenere sezioni sottili dei campioni, si utilizzano diversi strumenti di taglio, ciascuno con caratteristiche

speci che:

• Microtomo: il più diffuso; il blocchetto di paraf na contenente il tessuto viene fatto avanzare verso una

lama per ottenere sezioni di 5–110 µm. Le sezioni vengono distese in acqua distillata, trasferite su vetrini

adesivi e fatte asciugare. La paraf na viene poi rimossa tramite reidratazione prima della colorazione.

• Microtomo congelatore e criostato: utilizzati per tessuti ssati tramite congelamento. Il microtomo

congelatore mantiene -30 °C, mentre il criostato arriva a -50 °C, permettendo di tagliare direttamente il

tessuto congelato. Le sezioni, più spesse (≈10 µm), non richiedono disidratazione né reidratazione, utile

per tessuti sensibili allo xilene, come il tessuto adiposo, e consente un notevole risparmio di tempo.

• Vibratomo: taglia a temperatura ambiente tessuti già ssati, senza particolari accorgimenti.

Nell’istologia, una competenza chiave è interpretare le immagini bidimensionali al microscopio per ricostruire

mentalmente la struttura tridimensionale del tessuto. Le sezioni seriali facilitano questa ricostruzione,

permettendo di visualizzare correttamente la morfologia complessa degli organi o dei tessuti.

-ALTRE TECNICHE DI PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

Esistono altre tecniche di preparazione dei campioni, diverse dalla classica ssazione, disidratazione e

inclusione in paraf na:

• Congelamento-essicamento (freeze drying): il tessuto viene subito congelato in azoto liquido a -170 °C

per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio, poi posto sottovuoto a -40 °C per far sublimare il ghiaccio

e disidratare il campione. Successivamente il tessuto fragile viene in ltrato in paraf na e sezionato al

microtomo. Questo metodo permette di preservare la morfologia senza agenti chimici.

• Apposizione e strisci di sangue: per campioni liquidi (sangue, lavaggi bronchiali o pleurici, ago-aspirati)

non serve l’inclusione. Si riduce lo spessore del campione premendo il vetrino sul tessuto fresco

(apposizione) o strisciando le cellule (striscio di sangue). Dopo asciugatura, i campioni vengono colorati

per evidenziare tipi cellulari o alterazioni, utili in diagnostica clinica.

• Preparati per erosione: applicati a tessuto osseo compatto non decalci cato. Dopo il taglio in sezioni di

1 mm, il campione viene assottigliato mediante abrasione con carta smeriglio rotante a bassa velocità,

ottenendo sezioni di osso calci cato di circa 20 µm di spessore.

Queste tecniche sono scelte in base al tipo di tessuto e allo scopo dell’osservazione.

-COLORAZIONE E MONTAGGIO

Dopo il taglio, le sezioni in paraf na vengono messe su vetrini e colorate per distinguere le varie parti della

cellula.

Poiché i coloranti sono idrosolubili, bisogna togliere la paraf na prima della colorazione:

1. Si immerge il vetrino nello xilolo (che scioglie la paraf na).

2. Poi si elimina lo xilolo con etanolo assoluto.

3. In ne si idrata il campione passando per alcoli a concentrazione decrescente no all’acqua.

A questo punto si può procedere con la colorazione, oppure con trattamenti speciali (enzimi, anticorpi,

ecc.).

Dopo aver lavato il vetrino per togliere il colore in eccesso, si passa al montaggio:

• Si mette una goccia di resina sintetica trasparente (Eukitt) sopra la sezione.

• Si applica il coprioggetto, che aderisce grazie alla resina. → →

• La resina richiede di nuovo la disidratazione (alcoli crescenti etanolo assoluto xilolo).

Il coprioggetto serve sia a proteggere il tessuto sia a migliorare l’osservazione al microscopio.

Tipi di preparati

I preparati per striscio, apposizione, erosione o da tessuto congelato non hanno bisogno di questi

passaggi e possono essere colorati subito.

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Perché si colora

I tessuti ssati sono quasi trasparenti al microscopio ottico, quindi serve la colorazione per ottenere un

buon contrasto e vedere le strutture cellulari e tissutali.

Coloranti istologici

I coloranti hanno:

• un cromoforo (dà il colore),

• un auxocromo (determina se il colorante è acido o basico).

A seconda della loro natura, si dividono in:

→ →

1. Coloranti acidi si legano a parti basiche del tessuto a