Citologia

MICROTUBULI

Appaiono come strutture cilindriche cave, dal diametro

di 25nm e dalla lunghezza variabile. È possibile

evidenziare la loro presenza mediante colorazione con

anticorpo antitubulina marcata con isotiocianato di

fluorescenza (FITC) nei confronti della proteina che

costituisce i microtubuli ovvero la tubulina.

La loro lunghezza è variabile nel senso che sono in grado di allungarsi e accorciarsi

cioè subiscono fenomeni di polimerizzazione

e di depolimerizzazione in zone differenti.

Essendo cilindri cavi hanno una parete formata

da 13 protofilamenti costituiti da eterodimeri

di tubulina, ossia tubulina alfa e beta legate tra

di loro che costituiscono un dimero, questi

legati tra loro vanno a costituire un

protofilamento.

I microtubuli sono strutture polarizzate, abbiamo un capo positivo e un capo negativo

poiché sono strutture dinamiche/con instabilità dinamica. L’estremità positiva è

caratterizzata da tubulina beta, prevale l’aggiunta di dimeri di tubulina. L’estremità

negativa è caratterizzata da tubulina alfa e prevale la dissociazione di dimeri di

tubulina.

Altre proteine costituenti i microtubuli sono la tubulina gamma e la MAPs

(microtubule associated proteins), queste sono delle proteine che si associano ai

microtubuli e in qualche modo regolano il funzionamento dei microtubuli.

I microtubuli si formano a livello dei cosiddetti centri organizzatori dei microtubuli

(MTOC), costituiti da centrosoma ovvero da centrioli associati a microtubuli e

proteine.

Possiamo avere microtubuli labili, ovvero sparsi nel citoplasma come quelli del fuso

mitotico che si trovano solo durante la divisione cellulare e microtubuli stabili, ovvero

quelli che vanno a costituire il centriolo o diplosoma, le ciglia vibratili e il flagello dello

spermatozoo.

Per quanto riguarda le funzioni i microtubuli sono in grado di veicolare le vescicole e

gli organuli all’interno della cellula (li dobbiamo immaginare come se fossero dei

binari/sistemi guida a cui si legano delle proteine che poi si legano a vescicole o

organuli permettendo così il movimento), sono implicati nella secrezione e nella

divisione cellulare, costituiscono le ciglia vibratili (costituite da un assonema e da

un corpuscolo basale) il cui movimento crea delle correnti di tipo extracellulare e in

fine i microtubuli determinano il movimento cellulare (es. spermatozoo, macrofago e

leucociti).

FILAMENTI INTERMEDI

Per intermedi si intende che il loro diametro (10nm) è intermedio tra quello dei

microtubuli e quello dei microfilamenti, sono strutture proteiche filamentose sparse

all’interno del citoplasma e vanno a costituire un reticolato intracellulare.

Dal punto di vista chimico i filamenti intermedi sono costituiti da proteine fibrose

(N.B. sulla slide c’è scritto “tessuto specifiche” perché le cellule di un determinato tipo

di tessuto contengono uno specifico filamento intermedio) e da proteine accessorie.

Possiamo classificare i filamenti intermedi in 4 classi: a livello degli epiteli ricordiamo i

filamenti di cheratine (chiamate anche citocheratine), i filamenti di vimentina per

quanto riguarda le cellule di origine mesenchimale, per le cellule muscolari i filamenti

di desmina, i filamenti di proteina fibrillare gliale acida (GFAP) per le cellule che

troviamo nel tessuto nervoso annesse ai neuroni (come gli astrociti, oligodendrociti,

cellule di Schwann), i neurofilamenti tipici delle cellule nervose e le lamìne nucleari

che non sono altro che filamenti intermedi che si trovano al di sotto della membrana

interna del nucleo.

I filamenti intermedi hanno funzione strutturale, di sostegno, intervengono nella

regolazione della flessibilità, e intervengono nella resistenza alle sollecitazioni

meccaniche e alle forze di trazione a cui può essere sottoposta la cellula.

MICROFILAMENTI (FILAMENTI DI ACTINA)

Passiamo all’ultima categoria di strutture che appartengono al citoscheletro ovvero i

microfilamenti o filamenti di actina, essi per essere visibili vengono colorati mediante

l’anticorpo antiactina marcato con FITC, poiché non visibili al microscopio ottico.

I microfilamenti hanno lunghezza variabile per via dell’instabilità dinamica proprio

come i microtubuli quindi abbiamo ad una estremità fenomeni di polimerizzazione e

all’altra estremità di depolimerizzazione, dal punto di vista chimico sono costituiti dal

monomero G-ACTINA (G sta per globulare) che legandosi tra loro costituiscono la F-

ACTINA (actina filamentosa) che è una struttura filamentosa la quale è costituita da un

doppio filamento avvolto a elica con instabilità dinamica quindi polarizzato. Le

proteine di actina sono associate ad altre numerose proteine (ABP= actin binding

protein)

Le funzioni dei microfilamenti sono molteplici ovvero essi determinano la forma delle

cellule, sono

impegnati nel

movimento di

organuli e vescicole

all’interno della

cellula, intervengono

nella migrazione

delle cellule e nella

formazione di

protrusioni

citoplasmatiche,

costituiscono i

microvilli, formano i

sistemi di giunzione

intercellulari e danno

viscosità al citosol

(più una zona è

piena di

microfilamenti più è

viscosa invece se c’è

polimerizzazione

sarà meno viscosa).

Le colorazioni possono essere di diverso tipo: progressive, regressive o

metacromatiche, quando però si parla di metacromasia c’è un problema se non si

conosce bene questo tipo di colorazione perché ci potrebbe essere un colore diverso

rispetto a quello del colorante, se invece rispecchia il colore si parla di ortocromasia

FASI DELLA COLORAZIONE

Abbiamo fatto i blocchetti, sono stati tagliati e abbiamo ottenuto i preparati, questi

devono essere colorati per essere osservabili al microscopio ottico, però i coloranti

sono soluzioni acquose e i nostri campioni sono in paraffina, quindi bisogna toglierla e

idratare i campioni, ovvero si fa l’operazione opposta a quella già effettuata, cioè si

sparaffina il preparato, lo si idrata in una scala a concentrazione decrescente di

alcol, fino ad arrivare all’acqua distillata, le colorazioni poi vengono effettuate in

vaschette di Hellendal che sono provviste di scanalature in cui mettiamo i preparati

con le soluzioni, gli step sono:

sparaffinatura

- con solvente organico

idratazione

- con l’etanolo

colorazione

-

una volta preparati i vetrini bisogna conservarli, per renderli permanenti bisogna

effettuare:

disidratazione

- rimuovendo l’acqua per ridurre la rifrangenza al microscopio ottico

chiarificazione

- per rendere le soluzioni traslucide e più facilmente attraversabili dal

fascio di luce

montaggio

- che viene effettuato mettendo il vetrino coprioggetto sul vetrino

portaoggetto e si aggiunge il montante (resina), attualmente si usano resine sintetiche

particolarmente tossiche

Un fattore importante è che il montante non deve con il tempo alterarsi, quindi deve

rimanere trasparente, non modificare la composizione chimica e non deve variare il

suo indice di rifrazione

TIPI DI COLORAZIONE:

1. Istomorfologiche

2. Istochimiche

3. Immunoistochimiche

4. Istoenzimatiche

istomorfologiche

Le colorazioni servono per vedere la struttura morfologia del tessuto,

se vogliamo valutare la presenza di determinate strutture chimiche dobbiamo

istochimiche,

effettuare le colorazioni se vogliamo analizzare un singolo antigene

immunoistochimiche,

usiamo le colorazioni se voglio individuare un enzima tipico di

istoenzimatica

una determinata cellula lo posso evidenziare con la colorazione (ad

esempio si usa nella valutazione delle diverse tipologie di carne il cui colore dipende

dal numero di mitocondri presenti e dalla presenza di determinati enzimi, così noi

possiamo risalire al tipo di fibra muscolare facendo una reazione con la succinico

deidrogenasi tipica dei mitocondri per colorare le fibre più lente, quelle con un

metabolismo ossidativo più accentuato si colorano in blu, le altre non si colorano)

1. COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE:

Ce ne sono diversi tipi, le più importanti sono:

Colorazione ematossilina-eosina:



L’ematossilina serve a colorare gli acidi nucleici ed

il nucleo (che sono strutture basofile), quindi è un

colorante basico che si lega a molecole acide.

L’eosina è un colorante acido che colora in rosso

arancio le sostanze basiche, ad esempio il

citoplasma di cellule senza ribosomi o RER e le

fibre collagene.

Colorazione tricromica (tre coloranti), quella più usata è quella di Azan-

 Mallory:

l’azocarminio colora in rosso i nuclei e la cromatina

e in rosa pallido il citoplasma è un colorante basico.

La miscela Mallory contiene il blu di anilina o il blu

di metilene che colora intensamente di blu le fibre

collagene e di azzurro le mucine. Contiene anche

l’orange G, che colora di arancio le cellule del

sangue e le fibre muscolari.

(quando c’è un colorante blu molto esteso di solito è

una colorazione tricromica).

2. COLORAZIONI ISTOCHIMICHE:

Servono per mettere in evidenza determinati gruppi molecolari, per esempio le

proteine gli acidi nucleici, i lipidi, i carboidrati, ecc., ovviamente a seconda del tipo di

sostanza o gruppo chimico da analizzare farò reazioni particolari.

Noi studieremo in particolare le colorazioni per

i glicoconiugati (=carboidrati legati ad un’altra molecola).

I glicoconiugati possono essere neutri come l’N-acetilgalattosamina o acidi (non

solforati come l’acido sialico o solforati come l’Nacetilgalattosamina-6-solfato)

Si dividono dunque in:

neutri

 acidi che, a loro volta, possono essere:

 (con gruppo solfato)

solforati

solforati (con gruppo carbossilico)

non

Possiamo mettere in evidenza lo zucchero neutro con una colorazione rossa-> questo

metodo PAS,

è il mentre i glicoconiugati acidi possono essere messi in evidenza con un

colorante Alcian blu, ma si può usare anche una colorazione specifica per i

glicoconiugati solfonati.

COLORAZIONE GLICOCONIUGATI NEUTRI :

Pas (Acido Periodico-Reattivo di Schiff):

Gli zuccheri sono dei polialcol che ossidati formano il gruppo

carbonilico, se mettiamo una base di Schiff si lega e si forma

una colorazione rosso-magenta.

Meccanismo d’azione: l’acido periodico ossida i gruppi OH

vicinali dello zucchero e va a costituire le aldeidi, queste poi

vengono fatte reagire con il reattivo di Schiff formando un

composto insolubile di una colorazione rosso-magenta.

Questi sono gli adenomeri di una ghiandola intestinale nel