Biochimica Prima Parte (prof. Bonomi)

PROTEINE E CATALISI ENZIMATICA

Concetto di catalisi I catalizzatori permettono che una reazione avvenga più velocemente; in una

reazione c’è sempre un’energia di attivazione anche se è spontanea: ci sono

barriere di attivazione in una reazione termodinamicamente possibile. Per

accelerare la reazione si crea una situazione in cui l’energia di attivazione è più

bassa; si passa quindi da una conformazione che possiede una certa energia di

attivazione a un’altra con energia diversa. Questa funzione è svolta dalle proteine,

ovvero degli enzimi in grado di catalizzare in modo specifico tipi diversi di reazioni

chimiche abbassando l’energia di attivazione senza modificarne gli equilibri; in un

sistema vivente ogni reazione ha una proteina che la catalizza: a una reazione

corrisponde un enzima. Gli enzimi catturano una molecola consentendole di

reagire con un’altra; ciò che serve è quindi un sito di riconoscimento a cui la

molecola si può collegare. Il meccanismo generale della catalisi prevede la

formazione di un complesso tra la molecola da trasformare e il catalizzatore. La

molecola a cui si può legare la proteina enzimatica è il substrato; si parla quindi del

complesso enzima-substrato. La proteina poi riarrangia la sua struttura e la

molecola diventa il prodotto della reazione. L’affinità della molecola proteica per il

prodotto è inferiore a quella che aveva per il substrato, il complesso enzima-

prodotto ha stabilità minore rispetto all’enzima-substrato; si entra in un circolo in cui il substrato si lega

diventa prodotto e si stacca e così via.

Ci sono diverse modalità con cui il processo di catalisi si realizza:

-siti rigidi modello chiave-serratura (a)

-adattamento indotto (b)

Perché un enzima possa funzionare occorre che in prossimità dello spazio ci sia un appropriato residuo

amminoacidico, il quale rappresenta il vero centro attivo dell’enzima; il singolo residuo non fa la reazione

se è in soluzione, ha bisogno che vicino nello spazio ci sono altri residui amminoacidici che aiutino a

svolgere la funzione di trasformazione del prodotto, di rottura dei legami. È necessario che ci sia una

contiguità fisica di ben precisi residui amminoacidi; l’enzima può funzionare ed essere attivo solo se

mantiene la sua struttura terziaria. La funzione degli amminoacidi comporta due azioni importanti: il

riconoscimento del substrato, in quanto esiste una specificità di riconoscimento dell’amminoacido, c’è una

precisa corrispondenza tra il sito di riconoscimento del substrato e il substrato stesso; ci deve essere il sito

attivo.

Nel processo di digestione degli alimenti intervengono due proteine: la tripsina e la chimotripsina; esse

sono secerne dal pancreas e differiscono nel sito di riconoscimento del substrato. La tripsina ha un sito che

in fondo presenta una carica negativa e che quindi attira amminoacidi con carica positiva (basici); mentre

la chimotripsina attira solo amminoacidi idrofobici. Ecco perché si chiama specificità di riconoscimento del

substrato. Sono due proteasi perché rompono il legame peptidico nel tratto digerente, catturano

particolari specie chimiche per convertirle in altre. Quando si mette un enzima in una

soluzione del suo substrato: il

substrato inizia a sparire e si converte

nel prodotto della reazione; questa

reazione dopo un certo tempo arriva

all’equilibrio e l’enzima non interviene.

La reazione che converte il glucosio in

fruttosio ha costante di equilibrio pari

a 0,4; alla fine di questa reazione si

avranno 40 molecole di fruttosio e 100

di glucosio.

Grazie all’enzima si accelera il

raggiungimento dell’equilibrio; un

catalizzatore non ha il poter di far

avvenire reazioni che non devono avvenire. Se si guarda il grafico si hanno curve e non delle linee perché

l’enzima per lavorare deve legare il suo substrato e questo dipende dalla concentrazione del substrato.

L’attività enzimatica di una proteina si misura definendo la velocità istantanea della reazione enzimatica

come la quantità di prodotto generato nell’unità di tempo:

v = dP/dt = -dS/dt e indica quindi quanto substrato viene consumato nell’unità di tempo.

La reazione base che descrive il processo di catalisi è:

E + S <-> ES <-> EP <-> E + P

L’enzima cattura il substrato e si forma il complesso enzima-substrato ES che a sua volte si trasforma in un

complesso enzima-prodotto EP; infine, dopo che il prodotto viene rilasciato, l’enzima può ritornare in

circolo. La specie che lavora in questo sistema è una sola: il complesso ES perché solo lui è in grado di

generare il prodotto. L’abilità di un enzima di convertire il substrato, una volta che l’ha legato, in prodotto è

espressa dalla costante catalitica dell’enzima: se è alta, l’enzima è molto abile come catalizzatore. Si ha

quindi che:

v = kcat [ES]

kcat esprime la velocità iniziale della conversione ES <-> EP quando tutto l’enzima è presente come [ES].

La velocità di formazione del prodotto dipende dall’abilità dell’enzima di convertire il substrato in

prodotto; tuttavia, non sempre l’enzima è presente nella forma in cui porta con sé il substrato. Esiste un

secondo parametro, ovvero l’abilità dell’enzima di recuperare il substrato dalla soluzione e quindi la

facilità con cui si forma il complesso ES. Si prende in considerazione la formazione del complesso ES che è

governata dalla costante di equilibrio della formazione del complesso espressa numericamente da 1/Kd

(Kd bassa= affinità alta); è necessario catturare il substrato e trasformalo in prodotto in base abilità

catalitica dell’enzima. Il risultato è l’equazione che descrive la catalisi enzimatica, ovvero l’equazione di

Michaelis-Menten; la velocità dipende da quattro fattori: da quanto enzima è presente [E], dall’abilità

catalitica dell’enzima kcat, dal termine di Michaelis-Menten che esprime quanto substrato è presente in

soluzione [S] e quanto l’enzima capace di catturalo:

v= [E] kcat [S]/([S] + Kd)

dove Kd è la costante di dissociazione del complesso Kd = [S][E]/[ES]

Se l’enzima è assente [E] = 0, la velocità è nulla; se non c’è substrato [S], la velocità è nulla; al crescere della

concentrazione del substrato [S], il termine di Micheaelis-Menten tende all’unità. La velocità massima

vmax dipende da quanto enzima c’è e dalla sua capacità di catturare substrato: v = Vmax [ S]/([S] + Km)

Dove Vmax è la velocità di formazione di P quando l’enzima è tutto presente come ES.

L’enzima perfetto è quello che ha elevata kcat e costante di dissociazione Kd più bassa possibile;

l’efficacia/efficienza catalitica di un enzima è quindi espressa dal rapporto kcat/Kd. Quado [S] = Kd il

rapporto diventa ½ e l’attività dell’enzima è metà di quella che si può avere al massimo.

Il grafico di Michealis-

Menten (Km) esprime la

relazione tra la velocità v di

una reazione catalizzata con

la concentrazione di

substrato [S]; la velocità

dipende dalla disponibilità di

substrato: se la

concentrazione è alta la

velocità è elevata, se la

concentrazione è bassa la velocità è ridotta. A concentrazione infinita [S]→∞ di substrato si raggiunge il

livello teorico massimo di velocità; se si prende il punto in cui la velocità è metà di quella massima si trova

che la concentrazione di substrato [S] = Kd (costante termodinamica) = Km. Km è una costante

fenomenologica. Questo parametro può essere modificato, non è fisso. Si possono variare tre parametri:

quantità enzima, valore Km, Kcat: -La velocità di una reazione enzimatica dipende linearmente da

[E] presente nel sistema; questo vale anche per concentrazioni

non saturanti di substrato, è indipendente dalla concentrazione

del substrato. La velocità è sempre e comunque funzione lineare

della quantità di enzima presente.

-Gli enzimi con diversi valori di kcat o km hanno capacità catalitiche molto diverse: le curve di velocità

cambiano molto; si può modificare la struttura degli enzimi intervenendo sulla vicinanza tra i residui

amminoacidici coinvolti nei processi e sulla struttura delle proteine. Ad esempio, si può modulare l’attività

di un enzima cambiando la capacità di catturare il prodotto da km=2 a una capacità maggiore km=10.

Questa è quello che vale per l’affinità dell’emoglobina all’ossigeno.

Nei sistemi biologici:

Le concentrazioni delle specie chimiche in un sistema vivente sono regolate dalla velocità con cui un

composto si trasforma in un altro; in un sistema biologico la velocità con cui avvengono le reazioni

condiziona le concentrazioni delle specie chimiche presenti. La velocità delle reazioni chimiche dipende da

come funzionano gli enzimi che le catalizzano. Una macro-reazione è di norma suddivisa in una serie

intricata di reazioni intermedie; ciascuna di queste tappe metaboliche ha un enzima che ne consente la

realizzazione e ne determina la velocità.

Sono necessarie tante tappe perché in ciascuna si prende il prodotto e lo si utilizza per fare un’altra

reazione, gli intermedi sono molto utili; ad esempio, se si prende un composto che brucia non è facile

gestire l’energia liberata, se invece il sistema è regolato e suddiviso è possibile recuperare l’eventuale

energia associata a ciascuno di questi passaggi. Si ha l’inter-conversione di diverse forme di energia; se per

ogni reazione si ha un enzima si ha la possibilità di regolare ciascuna delle tappe della sequenza di reazioni.

Un composto ha la possibilità di diventare più

prodotti: dipende dalla velocità degli enzimi

nel determinare gli esiti di una reazione nella

cellula, dall’attività dell’enzima preposto a fare

trasformazioni. Ci sono possibili ramificazioni:

se si ferma l’attività di un enzima, alcuni

composti sono esclusi e non si possono

formare ma se ne formano altri, con un

accumulo dei prodotti favoriti. Si parla di

controllo cinetico determinato dall’attività

degli enzimi. Ad esempio, un rallentamento

dell’attività dell’enzima “2” porta: ad un

accumulo di B, X, Y ad una carenza di C, D, E e dei loro derivati (metaboliti) Z, W,