Biochimica degli Alimenti (Iametti)

Biochimica degli alimenti

Lezione 1: Parametri che definiscono la qualità di un alimento

• Composizione
• Qualità nutrizionale: come le proteine vengono assorbite (proteasi), biodisponibilità e tipo di proteasi (pepsina, tripsina e chimotripsina).
• Aspetti di tipo culturale e soggettivo
• Funzioni catalitiche delle proteine
• Processo di trasformazione: causa modificazioni funzionali e strutturali alle proteine e può essere reversibile o irreversibile; ha lo scopo di conservare o sanitizzare l’alimento e tali processi sono raggruppati in base agli agenti:

• Denaturazioni dovute ad agenti fisici: termici e meccanici. Con il trattamento termico, la T denatura la membrana delle cellule intere provocando disquilibri osmotici, poi colpisce le piccole molecole, i polimeri strutturali e, poi, i polimeri non strutturali, infine le spore.
• Denaturazioni chimiche: isomerizzazione, formazione di nuovi composti e glicosilazione
• Denaturazioni enzimatiche: interazioni con enzimi che determinano una denaturazione

Quindi non è importante sapere quante proteine ci sono all'interno di un alimento, ma come queste sono organizzate e strutturate e come interagiscono con altri micro e macronutrienti.

Effetti del trattamento termico sulla struttura primaria

Modifica il valore nutrizionale e la digeribilità, causa la perdita del gruppo amminico di Glutammina e Asparagina, ottenendo Glutammato e Aspartato (si libera NH₃ e si modificano le qualità organolettiche) o la perdita del gruppo OH dell’Ala (si ottiene Deidroalanina, che reagisce con la Lys rendendola irriconoscibile dall’organismo), determina l’ossidazione dei composti aromatici (alcuni hanno potere cancerogeno e mutageno) e provoca la reazione di Maillard (reazione tra gruppi R di aa delle proteine con il gruppo carbonilico di zuccheri, aldosi o chetosi; i principali prodotti di conversione sono Fumosina e idrossimetil-furfurale e definiscono i parametri organolettici degli alimenti).

Lezione 2: Effetti del trattamento termico sulla struttura secondaria e terziaria

La proteina assume una struttura diversa da quella nativa, quindi viene denaturata e si ha una diversa interazione con il soluto, con le altre macromolecole e con il solvente (le interazioni all’interno della struttura più importanti sono legami H, idrofobiche ed elettrostatiche e il trattamento termico modifica solo le prime due).

Il dicroismo circolare è una tecnica spettroscopica che consente di vedere le modifiche della struttura: considerando la β-lattoglobulina (BLG), fino a 65° subisce modificazioni reversibili, al di sopra assume una struttura completamente diversa. Questa tecnica consente di valutare la struttura secondaria e terziaria.

La fluorescenza si basa sul fatto che alcune sostanze (residui aromatici: Trp, Tyr e Phe), se colpite dalla luce, la riassorbono e la riemettono con < E e > lunghezza d’onda. Questi residui sono indicatori di modificazioni strutturali perché, se cambiano posizione all’interno della proteina, si avrà una risposta diversa rispetto a quella nativa. Il residuo più utilizzato è il Trp perché la proteina ne contiene poco ed è molto idrofobico, quindi una sua modificazione è facilmente verificabile. Nella fluorescenza si misura l’E (E = hν) e l’intensità. Tale tecnica non è distruttiva, dà informazioni sulla struttura terziaria e permette di lavorare direttamente sul campione, ma non si può usare per matrici alimentari che assorbono la fluorescenza.

Un altro metodo indiretto consiste nello studiare la posizione della Cys nella proteina: la proteina conserva questo gruppo tramite S-S, quindi sono necessari almeno 2 residui di Cys. Es. la BLG ha 5 residui (2 ponti intra-proteici e un residuo –SH, all’interno del core idrofobico) e se la proteina viene denaturata il residuo viene esposto. Per vedere se la struttura della proteina è cambiata si aggiunge un reattivo in grado di legarsi al residuo –SH esposto e di creare un composto giallo (funziona solo se i residui –SH sono dispari).

La proteina mantiene i siti idrofobici il meno esposti possibile e, se viene denaturata, si ha un’esposizione parziale/totale di essi e la proteina non è più compatibile con l’ambiente, quindi tende a formare degli aggregati stabilizzati da interazioni idrofobiche o a reagire con altri componenti idrofobici (es. aromi). Le regioni idrofobiche sono, inoltre, in grado di stabilizzare i sistemi polifasici se, durante la trasformazione, la proteina ha una certa struttura e un’esposizione controllata di essi. Queste regioni idrofobiche sono studiate con la fluorescenza estrinseca, che aggiunge marcatori fluorescenti che diventano tali solo se riconoscono una zona idrofobica.

Effetti del trattamento termico sulla struttura secondaria e terziaria

Il trattamento termico porta alla formazione di aggregati stabilizzati da interazioni idrofobiche o allo scambio di disolfuro: il gruppo –SH, una volta esposto, si scambia con uno dei residui impegnati nel ponte S-S e si forma quindi un legame S-S costituito dal residuo –SH e un altro residuo S-S precedentemente impegnato ne lega un altro. L’S-S che era intra-catena è diventato inter-catena. Ciò può avere degli effetti positivi (es. albume) o negativi (es. BLG) per la digeribilità.

Per stabilire se il latte pastorizzato o UHT ha subito più cicli di pastorizzazione si separano le caseine e le sieroproteine, sfruttando la diversa solubilità al punto isoelettrico (4.6 caseine e 5.6 sieroproteine). Le sieroproteine in un latte non trattato rimangono perfettamente solubili ma, se trattate termicamente e portate a pH 4.6, la solubilità diminuisce. Infatti, un latte più volte pastorizzato o UHT a pH 4.6 non presenta sieroproteine solubili, mentre a pH normale sono comunque solubili. Da qui la normativa che ha definito un limite di sieroproteine solubili:

• Pastorizzato: sieroproteine almeno 11% delle proteine totali e modificazioni strutturali minime
• Fresco pastorizzato e microfiltrato fresco pastorizzato: sieroproteine almeno 14%
• Fresco pastorizzato HQ: almeno il 15,5% di sieroproteine e almeno il 3,5% di grassi
• UHT: in confezioni che riportano la dicitura “Da consumarsi preferibilmente entro” con un termine max di 90 giorni a temperatura ambiente
• Sterilizzato: in confezioni che riportano la dicitura “Da consumarsi preferibilmente entro” con un termine max di 180 giorni a temperatura ambiente

Lezione 3: Denaturazione meccanica

La denaturazione meccanica ha gli stessi principi della precedente denaturazione termica. I processi fondamentali di modificazione delle proteine sono: impastamento, eventi legati alla formazione di emulsioni ed esclusione.

La pasta secca è costituita per il 18% da H₂O, il 10-15% da proteine (80% di riserva: gliadine e glutenine e 20% citoplasmatiche: albumine e globuline) e per il resto da amido. Con la gelatinizzazione (55-60°C) e l’impastamento le proteine si denaturano, espongono le zone più polari e formano un reticolo proteico e ordinato (gliadine e glutenine), stabilizzato da interazioni idrofobiche e legami disolfuro intercatena. Il glutine è fondamentale per una rete compatta e regolare. L’essiccamento consiste nella graduale migrazione dell’H₂O e quindi in un’ulteriore denaturazione delle proteine (con le alte T si può verificare la reazione di Maillard tra Lys e zucchero, infatti vengono fissati dei limiti di furosina); influenza anche l’organizzazione strutturale. Per fare la pasta col grano tenero si possono aggiungere agenti reticolanti (albume), o utilizzare T maggiori per avere un reticolo che trattenga meglio l’amido.

Nelle paste ultraproteiche le proteine aggiunte formano una pasta collosa, per evitare ciò si possono aggiungere proteine sotto forma di peptidi/parzialmente idrolizzate in modo che vengano inglobate nel reticolo, aggiungere idrocolloidi per facilitare la compattezza del reticolo o usare l’albume che contiene proteine in più e facilita la formazione del reticolo.

La pasta integrale/arricchita fatica a formare il reticolo, perché la fibra assorbe H₂O e quindi bisogna aggiungerne di più. Per analizzare il reticolo della pasta bisogna prendere ad esempio lo spaghetto, farne una polvere ed estrarre le proteine che partecipano al reticolo, solubilizzando in un tampone fosfato con un po’ di sale. Nelle interazioni del reticolo i legami possono essere idrofobici o S-S; per solubilizzare le proteine associate solo idrofobicamente si aggiunge un denaturante e per sapere quali interazioni sono stabilizzate sia idrofobicamente che da S-S si fa un’estrazione in presenza di un riducente (che rompe i ponti disolfuro). Nei trattamenti a basse T si ha una maggiore quantità di interazioni idrofobiche, un reticolo meno compatto e una maggiore penetrazione di H₂O. Più la pasta è trattata termicamente e più sarà bassa la qualità nutrizionale.

Il pane ha un maggior contenuto di acqua rispetto alla pasta e può essere di grano duro o di grano tenero. Per la preparazione è necessaria la fase di lievitazione, che comporta la produzione di CO₂ e durante la cottura si ha la gelatinizzazione dell’amido, in cui l’acqua migra dalle proteine all’amido e le proteine si denaturano, stabilizzando il reticolo. Il pane integrale ha tempi di evaporazione molto più lunghi perché la fibra assorbe tanta acqua. Possono essere addizionati dei grassi per farlo durare di più.

Lezione 4: Omogeneizzazione

L’omogeneizzazione è un trattamento meccanico che rende i composti macromolecolari di un alimento (nel latte le caseine e i globuli di grasso) più piccoli e tutti uguali.

Il latte è costituito da un sistema di caseine, un mezzo acquoso, in cui sono disperse le sieroproteine, e un’emulsione di grasso; il globulo di grasso è costituito a sua volta da un core lipidico idrofobico e una membrana fosfolipidica, contenente proteine integrali (all’interno della membrana), proteine che attraversano la membrana e proteine sulla superficie di essa. Molte proteine di superficie hanno attaccati carboidrati o gruppi inorganici (Ser e Thr), che rendono la proteina polare, facilitando l'interazione del sistema con l’ambiente acquoso e consentendo al globulo di grasso di creare una fase continua con l’ambiente idrofilico.

I componenti del latte hanno una diversa densità: le caseine tendono a precipitare e i globuli di grasso ad affiorare, quindi la soluzione tende spontaneamente a separarsi e l’omogeneizzazione ha l’obiettivo di evitare ciò. Grazie alla forza meccanica e al cambiamento di P, si ha la rottura del globulo di grasso in globuli più piccoli con una membrana mista (frammenti della membrana iniziale + caseine).

Conseguenze dell’omogeneizzazione:

• La struttura che si ottiene non è adatta per la caseificazione
• L’accessibilità alle lipasi è modificata
• Quando avviene la rottura del globulo per pochi secondi si ha l’esposizione del core idrofobico, che determina un’idrolisi dei TG e ciò deve essere limitato per evitare l’odore sgradevole
• Le caseine hanno una struttura diversa rispetto a quella di partenza

L’omogeneizzazione viene effettuata anche sulla panna. Con la separazione elettroforetica è stato verificato che nella panna cruda, se sottoposta ad omogeneizzazione, si hanno anche le caseine e nella panna pastorizzata e omogeneizzata compaiono anche le sieroproteine.

L’azione di una proteasi sulla proteina determina la rottura del legame peptidico e quindi modifica l’organizzazione nella struttura tridimensionale. Gli enzimi aggiunti hanno l’obiettivo di agire sulla sequenza della proteina (es. proteasi), di idrolizzare una macromolecola complessa (es. lattasi idrolizza il lattosio) o idrolizzare i TG.

I principali gruppi di caseine sono: α-caseina, β-caseina e κ-caseina. Hanno tutte una struttura secondaria intrinsecamente disordinata e quindi sono più facilmente idrolizzabili, hanno una distribuzione abbastanza omogenea delle zone idrofobiche e idrofiliche (tranne la κ-caseina) e quindi si pongono all’interfaccia e stabilizzano la fase idrofilica e idrofobica. Contengono residui di Ser, che possono essere fosforilati, e quindi sono proteine coniugate con il gruppo fosfato (ciò comporta la presenza di zone cariche negativamente che possono interagire con il gruppo carico positivamente di un’altra proteina o con un catione).

Le caseine nell’ambiente idrofilico si associano tra di loro a formare delle micelle di caseina per ridurre la parte idrofobica esposta, tali micelle sono costituite da submicelle associate grazie a interazioni idrofobiche (sulle quali agisce l’omogeneizzazione) e ioniche (Ca e gruppo fosfato). La κ-caseina è orientata (ha una zona molto idrofobica e una molto idrofilica) e quindi stabilizza le micelle ed è l’unica che possiede 2 residui di Cys, che formano un ponte S-S e fanno uno scambio di disolfuro con un residuo SH della β-lattoglobulina, si ottiene così una micella di caseina modificata. Il numero di ponti misti dipende dall’intensità del trattamento termico.

La stabilità delle micelle di caseina può essere modificata tramite acidificazione (se si porta il pH della caseina a 4.6 si ha la completa precipitazione di essa) o utilizzando degli enzimi: o una proteasi gastrica, che forma tanti piccoli peptidi e aa, o la chimosina, che idrolizza solo i residui 105 e 106 (Phe e Met) e destabilizza la micella senza distruggerla (con l’idrolisi la micella si riorganizza formando un reticolo di micelle associate utilizzato nei processi di caseificazione).

Lezione 5: Bioinformatica

La bioinformatica è una disciplina che raggruppa strumenti e algoritmi informatici e le loro applicazioni, utilizzate nelle ricerche di base, di biologia e di medicina e nasce come disciplina in concomitanza con i progetti di sequenziamento del genoma. Principalmente si occupa di sviluppare modelli statistici per l’interpretazione di dati biologici raccolti in database e di generare modelli e strumenti matematici che ci permettano di analizzare le sequenze di DNA, RNA e proteine. Gli ambiti di cui si occupa la bioinformatica sono vastissimi e includono allineamento di sequenze proteiche, espressione genica, interazione tra proteine…

È preferibile riferirsi a questa disciplina come biologia computazionale, che racchiude tutti i vari aspetti di analisi informatica di sequenze e definizione di strutture di molecole biologiche.

Scopi:

• Analisi di sequenze: ricerca di sequenze omologhe. Si analizza a cosa assomiglia una sequenza per capire la sua funzione e se c’è un’omologia tra i diversi organismi
• Identificare i geni e localizzare gli elementi di codifica
• Simulazione di strutture sulla base delle sequenze disponibili. Si può predire quale potrebbe essere la struttura di una sequenza proteica
• Predire la patogenicità di alcune variabili genetiche
• Trovare proteine comuni a diversi organismi e costruire alberi filogenetici di diverse specie

Tutte le ipotesi che vengono fatte sulla base degli strumenti bioinformatici vanno verificate successivamente in vitro e in vivo. Le banche dati si dividono in primarie (raccolgono sequenze di basi azotate o di aa) e secondarie (racchiudono singoli genomi, strutture proteiche e materiale utile per la biologia molecolare). In parallelo alle banche dati sono stati sviluppati diversi software per rendere la ricerca più veloce, confrontare sequenze, predire tagli proteolitici o strutture secondarie delle proteine, fare PCR, effettuare analisi filogenetiche e ultimamente sono stati sviluppati software basati su intelligenze artificiali, utilizzati per l’analisi di sistemi complessi. I database si parlano tra di loro e vengono aggiornati simultaneamente.

ExPASy: portale di bioinformatica a cui gli utenti possono accedere e hanno a disposizione una vastissima gamma di risorse. Considerando, ad esempio, questo portale dà informazioni su: nome della proteina, del gene e dell’organismo, funzione, allergenicità, struttura, modificazioni amminoacidiche, da che cosa è sintetizzata, PM, punto isoelettrico (teorico, viene calcolato solamente sulla base delle cariche dei singoli aa), residui idrofobici e idrofilici.

La spettrometria di massa consente di analizzare e ricostruire delle sequenze di proteine, che vengono tagliate con la tripsina.

Lezione 6: Livelli di studio degli esseri viventi

Il primo livello di studio degli esseri viventi è il livello genomico. Il DNA è uguale in tutti gli organismi e si analizza sempre allo stesso modo. Il genoma è stabile nel tempo. Il secondo livello è il trascrittoma, ossia l’insieme, in un particolare momento e in determinate condizioni di vita della cellula/tessuto, di tutti i trascritti (mRNA) presenti in quella cellula/tessuto. Cambia in base al momento perché il nostro organismo reagisce agli stimoli ambientali.

I livelli di regolazione metabolica che una cellula mette in atto per reagire a uno stimolo sono due: uno riguarda le molecole funzionali già presenti nella cellula (enzimi e proteine) ed è il più veloce, ma non attuabile e l’altro riguarda la produzione di qualcosa di nuovo. Il proteoma è l’insieme di tutte le proteine in un dato tessuto e in un determinato momento, è un sistema dinamico e non stabile. La presenza di proteine comporta attività enzimatiche e quindi la trasformazione di substrati in prodotti. Il metaboloma è l’insieme di tutte le molecole a basso PM che derivano dall’azione di enzimi cellulari (ormoni, acidi organici, molecole organiche, polisaccaridi). Le macromolecole informazionali sono le molecole per la cui sintesi è necessaria un’informazione, come le proteine, l’RNA e il DNA. La tecnica più utilizzata per lo studio del genoma è la PCR, che serve ad amplificare segmenti specifici del DNA.