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26.10.2017

Allergeni vegetali

Le proteine che posseggono proprietà allergeniche appartengono ad almeno tre ruoli strutturali nella

cellula:

- Proteine di difesa

- Proteine aventi un ruolo metabolico o strutturale

- Proteine di deposito

Proteine di deposito

Sulla base della solubilità possiamo distinguerle in:

- Albumine 2S albumine, ricche in interazioni S-S

→ α-eliche,

- Globuline 7S (vicilline) e 11S (legumine)

- Prolamine (es. grano)

SI trovano in legumi e cereali, sono caratterizzati da motivi sequenziali/strutturali comuni, spesso

glicosilate.

Proteine aventi un ruolo metabolico o strutturale

I principali allergeni si trovano soprattutto nei cereali e sono inibitori di enzimi amilasi o proteasi. Queste

proteine sono i principali allergeni delle farine e sono responsabili delle malattie professionali degli

operatori nel settore.

Proteine di difesa

L’unica proteina di questa categoria è la Lipid Transfer Protein (LTP) che lega le cere, e costituisce una

barriera all’attacco degli infestanti. È una proteina molto piccola e molto compatta, presenta 12-13

residui di cisteina e si sviluppa in piena maturazione del frutto. Il 90% della proteina rappresenta regioni

epitopiche in grado di scatenare reazioni allergiche.

Si trova nella buccia di diversi alimenti, quali: frutti, frumento, arachide, nocciole, soia…

Nella soia vi sono diverse proteine appartenenti alle tre categorie di funzione, tutte in grado di indurre la

produzione di anticorpi e quindi allergia.

In arachidi, nocciole c’è una famiglia di proteine allergeniche, ovvero tante proteine in grado di causare

allergia. La distribuzione degli allergeni cambia con la varietà dell’alimento.

Anche nel frumento le proteine allergeniche sono molteplici ed hanno funzioni diverse (inibitori delle α-

amilasi…) ma vi sono anche alcune frazioni di gliadine e glutinine, ovvero le proteine coinvolte nella

celiachia.

La differenza sostanziale però è nelle regioni della proteina che determinano l’allergia o la celiachia: le

regioni epitopiche causa di allergia a gliadine/glutenine sono completamente diverse rispetto alle

sequenze correlate con la celiachia, anche se le proteine coinvolte sono le stesse.

18

Aspetti che condizionano la risposta di un allergene

La risposta di un allergene all’interno di un alimento è legata alle caratteristiche intrinseche

dell’alimento, ovvero:

Reazioni di cross-reattività alimento preparato con ingredienti che contengono proteine che

• →

hanno analogie di sequenza agli allergeni per l’individuo (es. una persona allergica alle mele può

essere allergico anche ad altri prodotti vegetali, poiché l’allergene della mela ha un’omologia di

sequenza molto elevata con proteine presenti in altri vegetali)

Quantità di allergene presente nell’alimento

• Preparazione e trasformazione dell’alimento la risposta a parità di quantità di allergene

• →

dipende da come viene presentato l’allergene stesso (es. emulsionato…)

Effetti del trattamento termico sulle caratteristiche allergeniche del materiale proteico

Buona parte degli alimenti non vengono consumati come tali, quindi il trattamento termico può avere

diversi effetti sull’allergenicità dell’alimento.

Il trattamento termico può avere molteplici effetti:

- Diminuisce/aumenta l’allergenicità causa la comparsa/scomparsa di epitopi conformazionali

- Induce la formazione di polimeri aumenta l’allergenicità della proteina, che in forma polimerica

è molto più allergenica

- Induce modificazioni covalenti a carico dei gruppi –R se la sequenza modificata è un epitopo

sequenziale, aumenta l’allergenicità (ad esempio modificazione per glicosilazione)

L’affinità di un anticorpo verso un allergene non è quantitativa ma dipende da come esso viene

riconosciuto. Nel gel infatti 36k è un dimero della proteina da 18k, molto più immunoreattiva.

Ruolo dei processi fisici

Ad esempio l’arachide è un alimento molto allergenico che spesso viene trattato fisicamente tramite

tostatura: l’affinità delle proteine allergeniche aumenta di più di 100 volte a seguito di tostatura.

Effetto matrice

Anche la formulazione influenza l’allergenicità: la presenza di una forma fisica (es. emulsione) può

variare la sua digeribilità o la sua capacità di valicare le barriere fisiologiche. Ad esempio nell’emulsione

la proteina fa da collante a due fasi diverse, esponendo regioni diverse e quindi modifica la risposta del

sistema immunitario; oppure le medesime proteine intatte o in forma omogeneizzata sono in grado di

indurre risposte diverse.

Effetti sinergici

La contemporanea assunzione di più molecole allergeniche può modificare le soglie di risposta.

Ad esempio una proteina alimentare ed una batterica: se una persona presenta un batterio contro cui il

sistema immunitario è attivo, in presenza di una proteina alimentare la risposta allergenica potrebbe

essere aumentata. Ciò rappresenta un problema soprattutto nelle persone immunodepresse, in cui la

risposta allergica può portare ad uno shock anafilattico. Infatti gli alimenti tali individui sono controllati

anche per la presenza di diamminoacidi, prodotti solo da batteri.

Aspetti legati all’individuo e all’ambiente

Ad esempio l’allergia alle noci/mandorle è molto diffusa nelle zone ricche di betulla a causa di cross-

reactivity; oppure l’allergia al pesce è più diffusa dove si ha un alto consumo di pesce (Norvegia,

Portogallo, Giappone). 19

Tra i fattori individuali entrano in gioco:

- Fattori genetici genotipo ed etnicità

- Età

- Fattori ambientali (alcol, fumo, esercizio fisico, sport)

- Abitudini alimentari fondamentale è il ruolo del microbioma che è in grado di influenzare lo

stato infiammatorio delle cellule intestinali

Come posso definire un alimento anallergico?

La direttiva 2000/13/EC definisce quali sono i principali alimenti allergenici e quali causa di

intolleranza.

È necessario però definire quanto di un determinato allergene deve essere presente per doverlo indicare

in etichetta.

La prima indicazione dice che è necessario indicare se è presente più del 2% ma non indicava se fosse

riferito alla proteina allergenica o all’alimento in sé (es. caseina o latte?). Attualmente l’etichettatura è

volontaria.

Inoltre nella definizione della quantità di allergene sono 4 gli step che devono essere fatti per definire la

quantità di un allergene in un alimento.

1. Risposta individuale

Ad esempio la LTP è una proteina molto allergenica; la proteina è stata idrolizzata in tanti peptidi e si è

valutato se i pazienti allergici alla LTP riconoscessero gli epitopi allo stesso modo oppure se la risposta

fosse diversa per ciascun epitopo. Alcuni peptidi non danno risposta (non contengono epitopi) mentre

quelle contenenti epitopi danno risposte differenti a seconda del soggetto, quindi la variabilità nella

quantità minima necessaria per avere una risposta è enorme.

2. Definizione di limite

Studi clinici hanno evidenziato che normalmente individui sensibili reagiscono a quantità di allergene

dell‘ordine dei microgrammi.

Si è andati a vedere su base statistica la quantità di allergene che non determina una risposta nel 90%

delle persone allergiche SOLO a quel determinato alimento, su almeno 29 pazienti.

Su base statistica si è definito che 1-10ppm di proteina allergenica è il livello massimo per proteggere il

90% dei pazienti.

Il limite che viene usato è il limite più basso osservato in grado di non causare reazione avverse (NOAEL)

sull’uomo.

Nel caso della soia ciascun paese ha definito un limite massimo di contaminazione da soia per gli altri

alimenti; in Italia è stato utilizzato lo “zero analitico” ovvero il valore zero determinato dal kit

commerciale più sensibile (non tiene però di eventuali falsi positivi o negativi). Il problema è che i diversi

kit hanno curve di quantificazione molto diverse: ad esempio un kit con una curva a sigmoide ha

un’incertezza molto più elevata nelle zone di misurazione critiche.

20

3. Metodi analitici appropriati

I metodi utilizzabili sono di due tipi:

Fisici

• Spettrometria di massa problemi di effetto matrice

o →

Real time PCR-per allergene DNA è molto sensibile e permette di individuare il DNA ma

o →

non identifica la presenza di allergene (proteina); inoltre non è attuabile su elementi

trattati (es. alimenti essiccati in cui il DNA è degradato)

Immunologici

• Immunoblotting

o ELISA l’unico utilizzabile sull’alimento, in cui l’allergene non è isolato. Tuttavia è

o →

necessario che tutti utilizzino il medesimo anticorpo per riconoscere l’allergene e che il

metodo utilizzato sia quantitativo e conforme per tutti (es. alimento integro o proteina

isolata). Ad oggi l’unico validato è quello per le nocciole.

4. Standard affidabili

Da definire

Ad oggi sono ancora numerose le questioni da risolvere in ambito di diagnostica di allergia al cibo:

allergeni crudi o cotti, cross-reattività antigenica, stabilità degli allergeni, intolleranze non

immunologiche… 30.01.2017

Alimenti anallergici

Per produrre alimenti anallergici vi un’unica possibilità, ovvero la rimozione delle proteine o degli

epitopi causa di allergia.

Ci sono tre strategie per produrre un alimento anallergico:

Le vie sono tre:

1. Alterazione biotecnologica ingegneria genetica utilizzata per rimuovere le regioni epitopiche.

Tuttavia ad esempio se rimuovo una proteina essenziale per lo sviluppo del vegetale, il vegetale

reagisce o bloccando la crescita oppure crea una proteina analoga

2. Rimozione fisica se l’allergene è compartimentato in una regione ben definita della proteina, è

possibile rimuovere la regione intervenendo con dei passaggi che selettivamente precipitano o

permettono di rimuovere le proteine allergiche.

3. Modificazione enzimatica

Rimozione fisica

Se l’allergene è compartimentato in una regione ben definita della proteina, è possibile rimuovere la

regione intervenendo con dei passaggi che selettivamente precipitano o permettono di rimuovere le

proteine allergiche. Questo viene fatto su tre categorie di alimenti:

- Oli vegetali la raffinazione comporta la diminuzione di 100 volte del contenuto proteico

- Sciroppi il processo di produzione comporta la rimozione della maggior parte delle proteine

presenti comprese quelle responsabili di allergie ed intolleranze, mediante trattamenti di

ultrafiltrazione

- Frutta l’allergene di molti frutti si trova nella buccia per cui mediante trattamenti opportuni è

possibile la rimozione delle proteine allergeniche (LTP) in modo da ottenere una purea

anallergica 21

Modificazione enzimatica

In tutti gli altri casi è necessario un intervento enzimatico.

Un esempio è la produzione di latte anallergico (definito latte a diversa tollerabilità, ovvero risponde alle

diverse soglie di tollerabilità). È latte in cui le proteine responsabili dell’allergenicità sono state più o

meno idrolizzate.

Il latte anallergico è costituito solo da sieroproteina, la principale è la -lattoglobulina, fortemente

β

compatta e resistente all’azione enzimatica.

Per prima cosa è necessario rimuovere gli epitopi utilizzando un enzima proteolitico che andrà ad

idrolizzare le diverse sequenze epitopiche distruggendole. Per la scelta della proteasi è necessario

considerare cosa si conosce degli epitopi (se hanno residui basici o acidi, idrofobici o idrofilici…).

Nel caso della BLG, gli epitopi sono 6 e tutti hanno un residuo basico (Arg) quindi viene utilizzata la

tripsina in grado di idrolizzare gli amminoacidi basici. Tuttavia essendo la struttura molto compatta,

l’idrolisi diretta con tripsina risulta molto difficile, soprattutto per i due epitopi localizzati all’interno del

core idrofobico: si preferisce quindi eseguire un primo trattamento termico non troppo intenso (60-65°C,

non deve causare la formazione di polimeri) ma necessario a denaturare la proteina prima di attuare

l’idrolisi.

Viene quindi eseguito un trattamento di idrolisi alle temperature ottimali per l’enzima (37°C).

A seguito dell’idrolisi avrò quindi un po’ di proteina nativa e vari peptidi contenenti anche le regioni

epitopiche.

Segue un trattamento ad alte temperature (80-90°C) necessario ad inattivare l’enzima (oltre che

sanificare l’alimento); l’alta temperatura però causa la formazione di polimeri insolubili di BLG non

completamente idrolizzata che precipitano.

Nella scelta delle temperature è necessario:

- Evitare la formazione di polimeri proteici insolubili, in quanto sono:

- Più immunoreattivi delle singole proteine

- Più resistenti all’azione di proteasi

- Evitare la formazione di proteine modificate (reazione di Maillard)

- Evitare l’idrolisi elevata con formazione di piccoli peptidi (sapore amaro)

A seguito del trattamento termico si ha quindi una miscela costituita da proteina nativa non idrolizzata,

peptidi solubili e polimeri insolubili. È necessario quindi separare dalla miscela tutti i peptidi

immunoreattivi da quelli non immunoreattivi mediante ultrafiltrazione utilizzando una membrana con

un cut-off di 5000Da, poiché tendenzialmente i peptidi con peso molecolare inferiore a 5000Da non sono

più immunoreattivi.

Valutazione di immunoreattività

Viene eseguita in due passaggi:

Test in vitro valutare mediante metodi immunochimici se utilizzando anticorpi opportuni, i

• →

peptidi sono immunoreattivi. I metodi utilizzati sono:

ELISA

o Dot blotting

o

Come primo screening vengono utilizzati IgG prodotti in animali (e non IgE) immunizzati con

l’allergene. Una volta selezionati i campioni probabilmente non immunogenici, viene ripetuto il

test utilizzando le IgE di pazienti allergici (in genere con sensibilità diversa)

22

Test in vivo viene eseguito in ospedale da volontari, e consiste in due livelli:

• →

Contatto cutaneo

o Ingestione alimento l’alimento viene sottoposto a contatto sublinguale e si valuta la

o →

comparsa di shock anafilattico

alimentari

Intolleranze

Vengono definite intolleranze le reazioni del sistema immunitario ad un composto di varia natura che

non prevedono la produzione di IgE (il composto coinvolto non deve essere necessariamente una

proteina es. lattosio, SO …).

2

Un altro elemento che entra in gioco nelle intolleranze è il microbiota.

Ad esempio l’intolleranza al lattosio è dovuta alla non espressione della lattasi o all’espressione di

un’isoforma inefficiente dell’enzima.

Celiachia

La celiachia non è un’allergia e non va confusa con l’intolleranza al glutine. La celiachia è una malattia

autoimmune.

Si stima una prevalenza di 1:200 in Europa, tuttavia sono dati approssimativi in quanto è una malattia

silente e può essere diagnosticata in maniera certa solo attraverso biopsia intestinale.

La celiachia comporta la scomparsa dei villi intestinali causando una diminuzione dell’assorbimento

intestinale e quindi sintomi comuni alla malnutrizione. La modificazione è tuttavia reversibile seguendo

una dieta gluten-free. La celiachia è infatti una malattia da auto-accumulo, ovvero la distruzione della

membrana avviene a causa del glutine accumulato nel tempo.

I due fattori scatenanti e coesistenti sono:

Consumo di cereali contenenti proteine tossiche

Le proteine tossiche sono presenti nel glutine: queste proteine sono presenti in tutti i cereali ma non in

tutti i casi sono tossiche, a determinare la tossicità è la sequenza amminoacidica della proteina. Quindi

tutti i cereali contengono glutine, ma solo alcuni contengono glutine tossico.

Le proteine tossiche sono presenti nell’intera famiglia delle Triticaes (frumento, orzo, segale, farro,

kamut…); i cereali non coinvolti sono riso, sorgo, mais e teff. L’avena in sé non è tossica ma è in genere

cross-contaminata da frumento. Gli pseudocereali non contengono glutine quindi non sono tossici

(amaranto, grano saraceno, quinoa).

Responsabile dell’insorgere della celiachia è una sequenza di 33aa, caratterizzata da un motivo

ripetitivo di 5aa contenente prolina (P), glutammina (G) ed un amminoacido idrofobico. Queste sequenze

vengono riconosciute dalle T cell.

Le sequenze sono presenti in glutenine e gliadine (nel caso del frumento), quindi in entrambe le proteine

che costituiscono il glutine.

*queste sequenze non hanno nulla a che vedere con ciò che determina l’allergia!!!

Il fatto di avere tutte queste sequenze ripetitive conferisce le proprietà specifiche del glutine, quindi negli

anni si sono selezionate le varie specie più ricche di tali sequenze!

Predisposizione genetica

È legata al MHC-II della lamina propria del piccolo intestino, e dipende dalla HLA di tale complesso: DQ2

e DQ8 predispongono allo sviluppo della patologia. 23

I residui di prolina impediscono l’azione della tripsina a livello gastrico: infatti l’azione di tripsina,

chimotripsina viene rallentata in presenza di prolina vicino all’aa bersaglio, quindi si formano tanti

peptidi contenenti proprio le sequenze causative della celiachia. Alcuni peptidi inoltre sono in grado di

attraversare la barriera intestinale (ad esempio in presenza di uno stato infiammatorio).

Inoltre la transglutaminasi tissutale agisce mediante una deamminazione di un residuo di glutammina

generando glutammato + NH : questo determina una diversa distribuzione di cariche sul peptide (la

3

glutammina non è carica mentre il glutammato è carico negativamente) e rappresenta la condizione

ideale poiché il peptide sia riconosciuto dal MHC-II delle cellule della lamina propria, che viene quindi

riconosciuto dai CD4+.

Il riconoscimento del peptide determina la produzione di:

- Citochine pro-infiammatorie

- Anticorpi IgA contro la transglutaminasi

- Anticorpi IgA contro i pepidi deaminati

- Anticorpi IgA contro le cellule intestinali necrosi intestinale

→ 2.11.17

Alternative alla dieta gluten-free

I due possibili interventi alternativi alla dieta gluten-free sono:

Pillola contenente endoprolinasi endoproteasi che hanno come amminoacido bersaglio un

• →

residuo di Pro specialmente al C-terminale. Queste proteasi hanno origine:

Batterica in alcuni microorganismi lattici che sono utilizzati durante la fermentazione

o →

acida nella produzione di pane (sour-dough)

Vegetali cereali, in particolare frumento, durante la germinazione

o →

Inibitori della transgutaminasi (tTGasi) inibisce la formazione di peptidi tossici

• →

Oppure è possibile utilizzare peptidi che mimano le sequenze della proteina riconosciute dalle T cell che

presentano il peptide deamminato alle cellule DQ2/8.

Esistono degli studi in cui sono stati individuati individui celiaci DQ2/8 nei quali si manifesta la celiachia

in seguito al consumo di mais: si è quindi valutato se all’interno delle proteine del mais esistevano

sequenze specifiche del glutine o fenomeni di cross-contaminazione; nel mais in effetti vi sono sequenze

che possono sovrapporsi per identità di sequenza.

Alimenti gluten-free

Un alimento gluten-free viene definito sapendo quant’è la quantità massima di glutine assumibile

quotidianamente e quindi tenendo conto quanto di questo alimento viene consumato giornalmente.

Da studi è emerso che l’intake giornaliero massimo di glutine è di 15-20g.

La legge che afferma quindi che la dicitura senza glutine è consentita solo laddove il glutine dell’alimento

venduto al consumatore non sia superiore a 20mg/kg di alimento.

L’avena deve essere specialmente prodotta per presentare la dicitura “senza glutine”, al fine di evitare

una contaminazione da altri cereali.

Determinazione di glutine in alimenti gluten-free

La determinazione di glutine viene fornita generalmente in gliadina poichè la curva standard è fatta su

materiale certificato di gliadina. Quindi la quantità di glutine di un alimento è uguale al contenuto di

gliadina determinato moltiplicato per due (10mg/kg di gliadina = 20mg/kg di glutine).

L’unico metodo che determina questi livelli su matrice alimentare è l’ELISA.

24

Per la determinazione del glutine esistono due metodi ELISA diversi utilizzati per prodotti diversi:

Sandwich ELISA adeso al pozzetto vi è un anticorpo contro il peptide R5, al

• →

pozzetto viene aggiunto il campione: se nel campione è contenuta la

sequenza, si forma un complesso anticorpo-antigene. Viena poi aggiunta una

soluzione contenente un anticorpo diretto contro R5 coniugato ad un enzima

(in genere perossidasi) in grado di dare una reazione colorimetrica.

Il campione standard di controllo utilizzato è la gliadina proveniente da una

miscela di frumento rappresentativa delle maggiori varietà utilizzate, poiché

la gliadina è facilmente separabile in maniera sistematica dal frumento.

Il problema legato a questo metodo è che buona parte dei prodotti che

utilizzo per determinare il glutine è costituito da materiale solido, quindi una

fase essenziale è l’estrazione, una fase delicatissima poiché il glutine non è una proteina solubile;

viene quindi eseguita un’estrazione in condizioni drastiche denaturanti e riducenti. L’estrazione è

necessaria poiché altrimenti il test risulta negativo!

Viene utilizzato in prodotti nei quali non vi sono interventi enzimatici, ovvero nei quali le due

proteine del glutine sono integre.

Inoltre in molti prodotti contenenti glutine sono presenti interferenze quali:

- Matrice zuccherina sciroppo di glucosio/maltosio, va allontanata mediante ultrafiltrazione

- Matrice lipidica in salumi, formaggi a crosta fiorita

Competitive ELISA viene utilizzato per quegli alimenti sottoposti ad azione enzimatica in cui le

• →

proteine sono idrolizzate a peptidi, per i quali non è possibile utilizzare il sandwich poiché se un

peptide si lega all’anticorpo primario non potrà poi legarsi all’anticorpo secondario. Viene quindi

utilizzato per prodotti quali: birra, yogurt di malto…

Nel pozzetto viene attaccato l’antigene da determinare, in questo

caso viene quindi adeso il peptide R5; contemporaneamente nel

pozzetto aggiungo l’anticorpo anti-R5 ed il campione: l’anticorpo in

soluzione potrà legarsi a R5 legato al pozzetto o all’eventuale R5

presente nel campione, quindi vi è una competizione tra i due

antigeni R5.

Si rileva poi la formazione del complesso antigene-anticorpo

formatosi con l’antigene legato al pozzetto: più glutine è presente nel

campione, meno anticorpo si legherà all’antigene legato al pozzetto, la correlazione è quindi

inversamente proporzionale.

Come campione standard viene utilizzato il peptide tossico; come posso quindi trasferire la

quantità di peptide in quantità di gliadina? Il trasferimento avviene scegliendo l’origine dello

standard utilizzato come peptide: si è presa della gliadina e la si è idrolizzata in condizioni tali per

il quale siano presenti solo peptidi tossici, ed uso questo come standard (quindi ad esempio so che

1mg di gliadina, ha una OD% di 70).

Questo metodo non può essere utilizzato con alimenti in cui le proteine non sono idrolizzate

poiché gli anticorpi non resisterebbero al metodo di estrazione necessario a isolare le proteine

dall’alimento; per questi campioni invece si utilizza una normale estrazione in etanolo per isolare i

peptidi. 25

Sono entrambi metodi quantitativi, prevedono l’utilizzo di un anticorpo monoclonale che quantifica

quanto del peptide R5 (sequenza tossica) è presente nell’alimento.

Strategie di intervento per la produzione di alimenti

Le strategie di intervento sui cereali contenenti glutine prevedono la rimozione delle sequenze tossiche

mediante:

- Intervento biotecnologico ad esempio creazione di alimenti a partire da farina trattata con

endoprolinasi che portano ad avere la quantità massima di glutine accettabile nel prodotto finito,

tuttavia la farina può essere difficilmente utilizzata per le normali trasformazioni d’uso (es. pasta).

Altri interventi prevedono la modificazione delle proteine in modo che la glutamminasi non possa

più agire sulla proteina.

- Preparazioni a base di ingredienti gluten-free utilizzo di pseudocereali o cereali alternativi (riso

e mais) trattati fisicamente o enzimaticamente per modificarne le proteine con l’obiettivo di

modificarne la struttura rendendole più adatte a formare un reticolo proteico. Il vantaggio

dell’utilizzo di pseudocereali è il loro contenuto di fibra.

Questi cereali possiedono infatti proteine non adatte alla formazione di un reticolo proteico.

Ad esempio il grano saraceno è stato trattato termicamente mediante soffiatura (P) o tostatura

(D); le proteine contenute sono state solubilizzate in diversi solventi (buffer, +urea, +urea, DTT) e

si è valutata l’organizzazione complessiva delle proteine. La soffiatura ha fatto diminuire la

quantità di proteine idrolizzate, ovvero ha causato la formazione di polimeri meno solubili. Questo

può essere utilizzato per produrre un pane con una % maggiore di grano saraceno, aumentando

quindi la quantità di proteine e fibre nel prodotto finale.

La stessa tecnica sull’amaranto non può essere utilizzata, quindi per facilitare la formazione di un

reticolo proteico con la farina di amaranto è necessario pre-trattare la miscela.

- Proteolisi mirata ad opera di batteri lattici o Aspergillus niger. Viene utilizzata per far acquisire

alle proteine le caratteristiche desiderate; un esempio sono le proteine dei legumi che hanno una

struttura molto compatta, quindi viene utilizzata l’idrolisi per far aprire la proteina parzialmente.

Oppure viene utilizzata anche per il sorgo in cui i granuli di amido sono rivestiti da una pellicola

proteica (40% di glutenine non tossiche) che impedisce la gelatinizzazione dell’amido che quindi

rimane indigeribile: per questo motivo il sorgo viene generalmente sottoposto a fermentazione

che rende gelatinizzabile l’amido. Tuttavia la germinazione attiva tutti gli enzimi, quindi

proteolizza la pellicola proteica ma in parte anche l’amido.

26 6.11.17

Nutrigenomica

Effetto di nutrienti sulla regolazione della funzione genica (trascrizione, traduzione) e metabolismo.

Interazione dieta gene

La nutrigenetica studia invece Impatto della variazione genetica individuale sulla richiesta nutrizionale

ottimale per quel singolo individuo (nutrizione personalizzata).

Interazione gene dieta

Con la nutrigenomica si studia quindi il ruolo di un nutriente che può attraversare la membrana cellulare

e nucleare ed andare ad interagire con il DNA, condizionando la trascrizione.

Oppure il nutriente non può passare la membrana cellule ma esplica la sua funzione attraverso

l’interazione con recettori di membrana scatenando una serie di segnali che seguono il medesimo iter.

L’effetto del nutriente sull’espressione genica può essere studiato dividendo in:

Trascrittomica come un composto influenza la trascrizione, quindi come modifica l’mRNA

• →

Proteomica come un composto influenza la traduzione di proteine e le relative modificazioni

• →

post-traduzionali

Metabolomica e genomica funzionale come la proteina agisce (attività enzimatica, ruolo

• →

strutturale…)

Un nutriente può quindi intervenire a diversi livelli nel processo di espressione genica ma può anche

avere contemporaneamente un effetto diretto sull’espressione genica e sul metabolismo, ad esempio può

bloccare una via metabolica che quindi a sua volta condiziona altri eventi connessi.

Quando consideriamo la regolazione genica di un nutriente dobbiamo tenere presente:

- Differenza tra genoma e proteoma

- Non tutti i geni sono utilizzati con la medesima frequenza e tempi per la sintesi di proteine

- Molte proteine possono essere modificate dopo la sintesi

- Non tutte le proteine hanno gli stessi tempi di emivita

Il passaggio da gene a trascritto primario avviene nel nucleo; l’mRNA poi viene trasferito nel citoplasma

dove può essere tradotto a proteina.

Tutti i passaggi coinvolti possono essere influenzati da un nutriente.

È importante ricordare che la modalità di regolazione dell’espressione genica in Eucarioti ed il ruolo di

componenti alimentari:

- Non è un fenomeno “tutto o niente” come nei procarioti

- Si può esercitare a diversi livelli nel corso dell’espressione genica complessiva

- Spesso viene esercitata in modo concertato con altre modalità di regolazione

- Può riguardare livelli diversi del flusso complessivo di informazione

Esempi di nutrienti che hanno effetto sul controllo dell’espressione genica

- Colesterolo - Ferro

- Acidi grassi - Zinco

- Glucosio - Vitamine A e D

27

Molti di questi composti hanno un controllo sulla trascrizione, mentre ad esempio il ferro interviene

sull’mRNA.

Trascrizione

Come può un nutriente influenzare la produzione del trascritto primario?

- Il DNA deve essere accessibile alla trascrizione correlato alla organizzazione complessiva del

materiale genetica

- Presenza/assenza di fattori che potenziano o rallentano la trascrizione di specifici geni correlato

all’organizzazione del materiale genetico e alla formazione ed attività del complesso di

trascrizione; importante è il ruolo dei co-regolatori.

Un meccanismo che modifica l’accessibilità del DNA è la

modificazione covalente degli istoni per acetilazione, regolata dalle

HAT (Histone Acetil Transferare) e HDAC (Histone Deacetilase) che

modificano i gruppi di lisina sugli istoni e provocano un

riarrangiamento della cromatina:

- HAT apertura della cromatina

- HDAC chiusura della cromatina

Alcuni componenti alimentari sono noti influenzare – direttamente o indirettamente – l’attività di queste

proteine.

Un altro meccanismo che modifica l’accessibilità del DNA è la metilazione del DNA a carico del C5 della

citosina ad opera delle metiltransferasi.

Geni costitutivamente inattivi sono molto metilati, mentre geni frequentemente trascritti sono poco

metilati.

Alcuni nutrienti invece intervengono sulla trascrizione attraverso la modificazione del materiale genetico

oppure intervenendo sui fattori di trascrizione.

Ogni gene presenta una regione promotrice non trascritta che regola la trascrizione; vi sono due

meccanismi con cui il nutriente può intervenire:

- cis il componente agisce direttamente sul promotore

- trans il componente agisce nella zona di regolazione di un gene e determina la sintesi di mRNA

e proteine che a loro volta controllano la trascrizione del gene target

I promotori genici sono costituiti da 4 sequenze:

- Enhancer sono tessuto-specifici

- Silencer sono tessuto-specifici

- MRE (Metabolic Responsive Element) sequenze bersaglio di componenti che devono essere

chelati o compartimentati

- TATA box sequenza precedente l’inizio del trascritto

I composti agiscono sulle prime 3 sequenze. 28

Che caratteristiche hanno le proteine che legano il DNA?

- Il controllo del singolo gene avviene grazie alla cooperazione di molte proteine

- Il controllo dell’espressione si esercita su gruppi di geni che condividono elementi regolatori

- Sono proteine che contengono elementi strutturali comuni

Helix-turn-helix

o Zinc finger

o Leucine zipper

o

Il legame proteina – DNA è determinato da:

- Ioni metallici

- Fosforilazione/defosforilazione

- Legame con proteine inibitrici

- Localizzazione subcellulare

- Legame con effettori

Esempi – Ruolo di ioni metallici

Ad esempio il rame Cu non si trova libero in soluzione, ma viene chelato dalla metallotioneina che può

+

legare fino a 8 atomi di Cu+ per mole.

La metallotioneina viene sintetizzata al bisogno, ovvero la sua trascrizione viene modulata dalla

concentrazione di Cu+: la trascrizione viene regolata dalla proteina ACE che si trova normalmente nel

citoplasma; all’aumento della concentrazione di Cu+, questo si lega ad ACE che migra nel nucleo e si

associa all’elemento che lega ACE sul DNA inducendo la trascrizione del gene che codifica per la

metallotioneina.

Esempio – Molecole effettrici

Un segnale determina la comparsa di una proteina legante il DNA che attraversa la membrana nucleare e

si lega agli enhancer inducendo la trascrizione genica. La proteine viene resa inattiva poiché ad esempio

può essere associata ad un inibitore, a cui rimane legata fino a che non giunge il segnale; oppure la

proteina può essere fosforilata e resa inattiva.

Questo effetto può essere mediato anche da più proteine:

CRE è un sensore di risposta al cAMP, ovvero è sensibile alla concentrazione di

cAMP: in presenza di cAMP vengono attivate delle proteine in grado di

associarsi a CRE.

Le proteine coinvolte sono:

- CREB è l’elemento sensibile alla concentrazione di cAMP, in grado di

legarsi a CRE a seguito di associazione con CBP

- CBP (CREB Binding Protein) lega CREB

A seguito di un aumento della concentrazione di cAMP si ha l’attivazione di

protein chinasi cAMP-dipendente (PKA) che fosforilano CREB inducendone

l’associazione con CBP; il complesse proteico formatosi è quindi in grado di associarsi a CRE.

Il complesso CBP/CREB ha un ruolo centrale in molti sistemi di attivazione genica in risposta a stimoli

molto diversi: insulina, interleuchina, estrogeni, TNF…

29

In altri casi il controllo ormonale dell’espressione genica viene esercitato con meccanismi indiretti in cui

CRE ha un ruolo centrale. Le due principali famiglie di proteine coinvolte sono:

- MAPK attivate segnali di stress e fattori crescita

- CREB attivata da glucagone, adrenalina, vasopressina, LH

Fattori nutrizionali in grado di mediare l’interazione tra nutrienti e fattori di trascrizione

Nutriente Recettore/Fattore di trascrizione

Acidi grassi PPAR, SREBP, LXR, HNF4, ChoREBP

Colesterolo SREBP, LXR, FXR

Glucosio SREBP, ChoREBP

Vit A RAR, RXR

Vita D VDR

Vit E PXR

Calcio Calcineurina

Ferro IREBP1, IREBP2

Zinco MTF

Maturazione e traduzione dell’mRNA

Il prodotto di trascrizione è un pre-mRNA, trasportato dal nucleo al citosol. La quantità di mRNA

processato e disponibile per la traduzione determina quanta proteina verrà prodotta.

Nella maturazione del pre-mRNA possono intervenire due eventi che possono a loro volta essere

condizionati da ormoni o componenti alimentari. Vi sono poi modificazioni che possono avvenire dopo

che l’mRNA è passato nel citoplasma.

Le modificazioni del pre-mRNA possono essere regolate a diversi livelli, di cui 3 nel nucleo e 2 nel citosol:

1. Modificazione dell’estremità 3’ e 5’ 5’capping, poliadenilazione al 3’ (il tipo di segnale

utilizzato per la poliadenilazione può formare diversi mRNA diversi tessuto-specifici)

2. Splicing formazione del mRNA maturo mediante eliminazione degli introni ad opera degli

spliceosomi, complessi di pre-mRNA, proteine ed RNA. Solo gli mRNA che hanno subito un

corretto splicing possono raggiungere il citosol. È anche possibile produzione di proteine

differenti mediante splicing alternativo.

3. Trasporto

4. Stabilità l’mRNA trascritto può non essere tradotto poiché viene degradato; non tutti gli

mRNA hanno la stessa emivita. La stabilità di un mRNA può essere determinata da elementi

che agiscono in cis o trans

5. Inizio della traduzione l’mRNA maturo può non essere tradotto poiché può essere

silenziato da fattori che impediscono il riconoscimento della tripletta di inizio AUG da parte del

ribosoma. Se il filamento di mRNA presenta diverse triplette AUG è possibile la produzione di

proteine con diversi N-terminali a partire dallo stesso mRNA. Se un codone è utilizzato come

iniziatore oppure no dipende dal contesto della sequenza. Se l’ambiente intorno alla sequenza

non è favorevole per l’inizio, l’inizio avviene in un codone AUG seguente

miRNA

Sono RNA non codificanti che regolano l’espressione genica attraverso la regolazione della traduzione

dell’mRNA. Fattori alimentari o nutrizionali possono influenzare diverse patologie (diabete tipo 2,

cancro, obesità) mediante la modulazione dei miRNA.

30 8.11.2017

Intervento di ormoni e nutrienti nella regolazione a livello dell’espressione

Un esempio di regolazione, maggiormente studiato e noto, è quello degli ormoni. Molti nutrienti si

comportano come gli ormoni.

Possiamo avere due gruppi principali, in base a come trasmettono

l’informazione, a come si comportano:

- Ormoni che legano recettori intracellulari androgeni ed

estrogeni, glucocorticoidi e mineralcorticoidi, tiroidei,

calcitriolo, retinoico

- Ormoni che interagiscono con recettori di membrana non

possono entrare nella cellula e per trasmettere il messaggio

impiegano i secondi messaggeri quali cAMP, cGMP, Ca e

2+

PIP.

Ormoni che legano recettori intracellulari

Comprendono steroidi, retinoidi ed ormoni tiroidei, i quali influenzano l’espressione genica utilizzando

direttamente i recettori intracellulari. Fattori di crescita e ormoni peptidici invece non entrano nella

cellula, ma si fermano a livello della membrana.

Tali ormoni entrano nel citoplasma attraverso un trasportatore specifico e si associano a recettori

nucleari attivando diversi meccanismi (regolare la trascrizione, intervenire nella fase di traduzione del

DNA...); la caratteristica è quella di interagire con il DNA.

L’interazione può essere diretta (acetilazione, metilazione) o può avvenire attraverso la sintesi di proteine

(complessi di trascrizione).

Ormoni che interagiscono con recettori posti sulla membrana cellulare

Non possono entrare nella cellula e per trasmettere il messaggio

impiegano i secondi messaggeri: interagiscono con recettori di

membrana cellulare e producono i secondi messaggeri.

Il secondo messaggero può intervenire sulla permeabilità di

membrana, modificare l’attività di enzimi oppure regolare

trascrizione del DNA e quindi la sintesi proteica.

I principali ormoni possono essere classificati attraverso il tipo di

secondo messaggero prodotto.

cAMP

Gli ormoni coinvolti sono:

- Catecolamine adrenergiche

- ACTH

- LH,FSH,CRH

- Glucagone

- Somastatina

L’AMP ciclico è il secondo messaggero più noto ed interviene anche nel controllo del metabolismo del

glicogeno. Gli ormoni che inducono la produzione di cAMP legano recettori associati ad una proteina G a

tre subunità (α, γ, β). 31

L’attività della proteina G è GTP-dipendente, ovvero può essere fosforilata, in particolare la subunità α,

grazie all’energia fornita dal GTP. Inoltre la proteina ha attività GTPasica propria.

Quando l’ormone si lega al recettore, la proteina G viene

fosforilata ed il complesso proteico subisce una

modificazione conformazionale: la componente α si dissocia

dal complesso poichè assume una differente conformazione;

la subunità dissociata ha affinità per l’adenilato ciclasi.

α

A seguito del legame con la subunità l’adenilato ciclasi

α,

sintetizza cAMP.

Si ha quindi l’idrolisi del GTP e la dissociazione della subunità

che si riassocia alle subunità e

α β γ.

Il cAMP è in grado di attivare una PKA, formata da due subunità regolatrici e catalitiche: a seguito del

legame con cAMP, le subunità regolatrici si staccano e permettono quindi l’attivazione delle due subunità

catalitiche.

La PKA è in grado di fosforilare vari bersagli, diversi a seconda dell’ormone di partenza.

Questo stesso sistema può agire anche da inibitore di varie attività con lo stesso meccanismo, mediante

l’attivazione di altri recettori inibitori.

Cascata chinasica

In questo caso il secondo messaggero è una cascata chinasica.

Gli ormoni che agiscono attraverso questo sistema sono:

- Insulina

- GH

- NGF, EGF, FGF, IGF, PDGF

- Eritropoietina

- Prolattina

- Somatostatina

Tali ormoni non entrano nel citoplasma ma attivano chinasi attraverso il loro recettore di membrana.

Il recettore è un complesso multiproteico formato da

due o più subunità: in assenza di ligando le subunità

sono dissociate, e si associano a seguito del legame con

il ligando.

Da lato citoplasmatico ciascuna subunità è associata ad

una JAK chinasi: a seguito del legame con il ligando le

due subunità si autofosforilano su specifici residui di

Tyr o Ser; la fosforilazione causa un cambiamento

conformazionale della subunità recettoriale che diventa

in grado di associare STAT2.

Le proteine STAT si associano al recettore e vengono a

loro volta fosforilate dalle JAK chinasi: la fosforilazione

induce l’associazione delle due STAT a formare un

dimero che si dissocia dal recettore e migra nel nucleo.

Il dimero STAT è un grado di agire da fattore di

trascrizione e quindi attivare la trascrizione del DNA.

32

IP , Ca , DAG

2+

3

Altri ormoni agiscono attivando uno o più secondi messaggeri tra:

- Inositolo trifosfato (IP3)

- Calcio (Ca )

2+

- Diacilglicerolo (DAG)

Gli ormoni che agiscono mediante questo

meccanismo comprendono:

- Acetilcolina

- Catecolammine adrenergiche

α1

- Angiotensina II

- Vasopressina

- Colecistochinina

- Gastrina

- Ossitocina

- TRH/GnRH

I trigliceridi fosforilati possono essere idrolizzati da diversi tipi di fosfolipasi: PLA1 idrolizza l’acido

grasso in posizione 1, PLA2 idrolizza il secondo acido grasso; la PLC invece produce DAG e IP3.

I secondi messaggeri sono prodotti solo da PLA2 e PLC .

In questo caso l’ormone si lega al recettore di membrana, il quale è associato una proteina G in grado di

associare la PLC. Quando la subunità si associa alla fosfolipasi, questa viene attivata; non appena si ha

α

l’idrolisi del GTP, la subunità si dissocia e la PLC viene disattivata.

α

La PLC produce due messaggeri:

DAG è in grado di attivare una chinasi PKC DAG-dipendente

• →

IP3 una serie di associazioni con proteine che si traduce in un aumento della

• →innesca

permeabilità al Ca . Il calcio può essere si quello extracellulare ma soprattutto quello del RER. Il

2+

calcio è in grado di attivare attiva chinasi calcio-dipendenti.

Questo stesso sistema è usato anche per regolare le concentrazioni di calcio durante la contrazione

muscolare e per regolare la proliferazione cellulare (il fattore di crescita è regolato da più fattori) o

la degranulazione a livello dei mastociti in una reazione allergica.

La fosfolipasi hanno un ruolo anche nelle allergie: l’allergene si lega alla IgE sulla membrana del

mastocita e attiva, attraverso proteina G, una PLC che produce DAG e IP3.

Il DAG attiva una chinasi e contemporaneamente IP3 aumenta la quantità di Ca libero nel citoplasma

2+

(sempre chelato alla proteina che lo trasporta). Contemporaneamente, la presenza dell’allergene

comporta l’attivazione della PLA2 che produce DAG-fosfato ed acido arachidonico, precursore di

leucotrieni e prostaglandine. Il DAG-fosfato va a stimolare i canali del calcio, determinando un aumento

della permeabilità al calcio. Il calcio va ad attivare chinasi Ca -dipendenti.

2+

Il risultato finale è la degranulazione ed il rilascio dei vari componenti prodotti.

La PLA2 è implicata anche nei processi di infiammazione, con lo stesso meccanismo visto sopra.

33

Altri tipi di secondo messaggero sono:

cGMP questi ormoni seguono lo stesso meccanismo del gruppo di composti che usano cAMP,

• →

varia solo il recettore, la cui proteina G è GMP-dipendente.

Fattore natriuretico atriale (ANF) piccolo peptide utilizzato per trasmettere i segnali

• →

all’interno dei mitocondri ed impiegato per innestare i fenomeni di morte cellulare.

NO non necessita di un trasportatore, è in grado di passare la membrana cellulare; può essere

• →

prodotto in un tessuto/cellula e colpire un altro tessuto o cellula: è impiegato moltissimo per la

comunicazione tra cellule, a differenza degli altri messaggeri che non escono dalla cellula.

Agisce su tre sistemi importanti: sistema immunitario, trasmissione impulsi nervosi, controllo

pressione arteriosa. Viene prodotto a partire dall’arginina attraverso una reazione di

ossidoriduzione NADPH-dipendente ad opera dell’enzima NO sintetasi (NOS).

La NO sintetasi è un enzima costitutivo di alcuni tessuti (endotelio, cervello) mentre in altri tessuti

è inducibile (monociti) e viene attivato durante l’infiammazione.

Eccessi di arginina nella dieta possono comportare iperproduzione di NO.

La produzione di NO è attivata per la trasmissione sinaptica, mentre nel sistema immunitario

viene prodotto dai macrofagi per colpire le cellule target.

A livello dell’endotelio il NO prodotto è necessario non tanto per la cellula stessa ma per agire su

altri tessuti, tra cui la cellula muscolare liscia. 9.11.2017

Modificazione delle proteine

I composti alimentari generalmente interagiscono con le proteine a funzione enzimatica, di cui possono

regolare l’attività direttamente o indirettamente.

L’intensità del segnale indotto dal nutriente varia con la composizione dell’alimento e la frequenza di

assunzione.

L’attività del composto può avere diversi effetti sul metabolismo:

- Effetto sulle vie metaboliche primarie e secondarie controlla l’attività di enzimi chiave (effetto

diretto)

- Ruolo di enzimi nella variazione di concentrazione di composti che possono svolgere ruolo di

intermedi, substrati, prodotti il composto può ad esempio reprimere il prodotto di un’attività

enzimatica, ma se il prodotto è substrato di altre reazioni questo condiziona tutto ciò che è a

monte (effetto indiretto)

Modalità di controllo del metabolismo: il controllo fine dell’attività enzimatica

Nei sistemi biologici, le macroreazioni sono suddivise in tante tappe in cui ogni tappa ha un suo specifico

enzima, permettendo la regolazione indipendente di ogni singola tappa.

Inoltre questo consente di ottenere una serie di intermedi che possono essere substrato di altre

tappe/reazioni.

I diversi composti possono quindi agire regolando le diverse tappe.

Vi è inoltre una regolazione cinetica: non tutte le reazioni avvengono con la stessa velocità, ma dipende

dalle caratteristiche di ogni enzima; il prodotto finale è influenzato dall’enzima più lento. Un composto

alimentare può intervenire regolando l’attività di conversione degli enzimi.

34

Modalità di regolazione dell’attività enzimatica

1. Quantità di enzima presente controllo genico sulla sintesi dell’enzima

Espressione della proteina in forma attiva

o Conversione di zimogeni spesso gli enzimi sono prodotti in sotto forma di zimogeni

• →

inattivi (soprattutto le proteasi), ovvero presentano una parte finale che viene

idrolizzata quando è necessaria l’attivazione dell’enzima.

Inserzione di cofattori molti enzimi invece vengono prodotti privi del loro cofattore

• →

(Apo-enzima); l’inserzione del cofattore avviene a livello post-traduzionale nel RE o nel

mitocondrio. Ad esempio l’inserzione corretta del FAD richiede due enzimi: è stato visto

che una supplementazione di FAD nella dieta può aumentare la quantità di enzima

funzionante (oloenzima = enzima contenente FAD correttamente).

Bilancio tra produzione–folding e degradazione produzione e degradazione sono controllate

o →

dall’attività di specifiche proteine regolate da eventi di modificazione covalente (es.

ubiquitinazione)

2. Localizzazione dell’enzima la localizzazione errata di enzimi determina importanti segnali per la

cellula (es. tutti i composti che determinano una produzione eccessiva di radicali possono indurre un

danneggiamento della membrana mitocondriale, e quindi un rilascio di cytC e quindi apoptosi)

Presenza dell’enzima nello stesso compartimento del substrato alcuni enzimi si trovano

o →

compartimentati in diversi compartimenti rispetto al substrato (es. enzimi ossidativi nei

vegetali compartimentati nei lisosomi)

Localizzazione dell’enzima in membrana o in soluzione

o Condizioni appropriate nel comparto cellulare di riferimento (pH, ioni…) es. se il composto

o →

determina una variazione di pH o una concentrazione anomala ioni, può alterare l’attività

enzimatica

3. Controllo cinetico al sito attivo

Concentrazione del substrato

o pH e presenza di ioni accessori

o Inibizione da inibitori competitivi (incluso prodotto di reazione)

o

4. Controllo cinetico di tipo allosterico gli enzimi allosterici presentano un ruolo chiave nel

controllo del metabolismo, ed hanno uno/due siti di controllo dell’attività che sono generalmente

distinti dal sito catalitico. I siti allosterici legano diverse molecole definite effettori, che possono

essere positivi o negativi (≠ da inibitore che agisce sul sito catalitico, di qualsiasi enzima).

Legame non covalente la comparsa di un effettore positivo/negativo modifica la struttura

o →

tridimensionale terziaria/quaternaria dell’enzima (es. cAMP e PKA).

Un altro esempio è l’aspartato transcarbamilasi (ATC) che è costituita da catene regolatrici e

catene catalitiche: in questo caso l’effettore induce una modifica strutturale delle subunità

regolatrici che determina una modificazione dell’intera struttura che rende il sito catalitico

accessibile al substrato; se l’effettore positivo “sparisce” si ha la richiusura dell’enzima.

35

Legame covalente (non proteolitico) modificazioni in cui la sequenza proteica rimane come

o →

tale ma viene legata covalentemente da un composto. L’aggiunta covalente richiede l’azione di

un enzima specifico: sono quindi presenti enzimi diversi per l’attivazione e la disattivazione.

Un esempio è la fosforilazione di residui di Ser/Thr/Tyr ad opera di chinasi e la

defosforilazione ad opera di fosfatasi. Ad esempio la fosforilazione della pompa Na /K induce

+ +

un cambiamento conformazionale che permette il trasferimento di una molecola di potassio

dall’esterno all’interno; la defosforilazione invece permette il trasferimento di due molecole di

Na+ verso l’esterno.

Esempi di enzimi la cui attività dipende da fosforilazione/defosforilazione sono: glicogeno

sintasi, glicogeno fosforilasi, Acetil-coA carbossilasi, piruvato deidrogenasi, HMG-CoA

riduttasi…

Altri esempi sono:

Adenilazione modifica carica ed interazioni. Ad esempio la glutammina sintasi

• →

aggiunge un gruppo amminico al glutammato producendo glutammina; l’enzima è

attivo in presenza di un residuo di adenina.

Acilazione aggiunta di composti a corta catena (acetile, CH3CO) o composti a lunga

• →

catena (palmitato, acido miristico, steroli. Ad esempio l’acetile si lega sui gruppi NH3+

(lisina) modificando la carica della proteina e quindi l’interazione che l’enzima ha con

altre proteine e quindi la trasduzione del segnale.

L’aggiunta di composti a lunga catena invece ne modifica la localizzazione: ad esempio

viene utilizzata per legare la proteina ad una membrana o determinare il distacco della

proteina dalla membrana. Tale modifica avviene:

- Sulla Gly di proteine che hanno Gly al C-terminale

- Sul gruppo R di una Cys anche in mezzo alla proteina. In genere la palmitoilazione

avviene sul gruppo R della Cys e viene utilizzato come sistema di ancoraggio della

proteina integrale alla membrana. La miristoilazione invece viene utilizzata per far

aderire una proteina alla membrana, che a seguito della rimozione dell’acido

miristico può migrare nel citoplasma.

Esempio – HMG-CoA Reduttasi

L’enzima è coinvolto nella sintesi del colesterolo; la proteina è legata covalentemente al reticolo

endoplasmatico tramite la porzione N-terminale che contiene un dominio sensibile agli steroli

importante per la stabilità.

La porzione C-terminale contiene l’attività catalitica.

I livelli di regolazione dell’enzima sono:

1. Modulazione dell’attività catalitica tramite inibizione da prodotto in presenza di mevalonato o

statine (analogia di substrato)

2. Modificazione covalente tramite fosforilazione/defosforilazione ad opera di una chinasi AMP-

dipendente: la forma non fosforilata è più attiva, la forma fosforilata è meno attiva (la

concentrazione di AMP dipende dalla quantità di ATP – ATP/AMP=50); un calo di ATP infatti

inibisce la sintesi di colesterolo e acidi grassi

3. Modulazione dei livelli proteici tramite degradazione e biosintesi via principale di regolazione.

Regolata dai livelli cellulari di colesterolo tramite le “proteine sensore” di colesterolo SREPB

(Sterol Regulatory Element Binding Protein) a livello del RE.

Queste proteine legano le sequenze SRE (Sterol Regulatory Element) presenti nel promotore di

geni coinvolti nella biosintesi di acidi grassi e colesterolo: SRE-BP1c e SRE-BP2.

Anche la degradazione dell’enzima è controllato mediante proteolisi controllata.

36 20.11.2017

Radicali e stress ossidativo

Lo stress ossidativo è una condizione causata dalla rottura dell’equilibrio fra la produzione e

l’eliminazione di specie chimiche ossidanti.

I proossidanti sono agenti che stimolano un trasferimento aberrante di elettroni nei sistemi biologici

causando stress ossidativo. I proossidanti vengono suddivisi in:

Molecole attive (ROS)

• Specie radicaliche (es. OH*, O )

2*-

o Specie non radicaliche (es. acqua ossigenata, perossidi organici)

o

Molecole reattive dell’azoto (RNS)

Queste specie reattive sono in grado di agire su diversi bersagli:

- DNA formazione di basi anomale

- Proteine modificazioni a carico di Phe, Tyr, Met

- Lipidi perossidazione e quindi alterazione delle membrane biologiche

La formazione di specie proossidanti avviene continuamente nella vita della cellula, la quale possiede

diversi meccanismi di difesa; tuttavia se le specie sono presenti in quantità abnormi, vanno ad alterare le

diverse macromolecole.

Da dove arrivano queste specie radicaliche?

Sicuramente vengono prodotte dalla cellula (da cui poi sono neutralizzate) ma derivano anche da fattori

ambientali, quali: inquinamento, raggi UV, raggi X ma anche in seguito a stati patologici o fisiologici

alterati (infiammazione…).

ROS

Comprendono:

Specie radicaliche

• - Superossido O * ha un elettrone spaiato, specie estremamente reattiva

2 →

- Radicale idrossilico *OH→ un elettrone spaiato

- Radicali alcossilici RO*

- Radicale perossiilco ROO*

- Ossido nitrico NO*

Specie non radicaliche

• - Perossido di idrogeno H O - Ipoclorito OCl

-

2 2

- Ossigeno singoletto O - Ozono O

1 2 3

- Idroperossido ROOH - Perossinitrito ONOO

-

- Alchilperossinitrito ROONO - Nitrito NO

- 2-

- Disolfuro RSSR - Solfenato RSO

-

- Solfinato RSO

2- 37

Natura chimica

La principale fonte di questi radicali sono alcuni metalli che possono avere due stati di ossidazione

(ossidato e ridotto); quelli più comunemente ritenuti responsabili sono:

Ferro il Fe può essere ossidato dall’acqua ossigenata con formazione di Fe e radicale

2+ 3+

• →

idrossilico; il Fe può anche reagire con ossigeno a dare Fe3+ e radicale superossido

2+

Fe + H O Fe + OH + OH* (radicale idrossile)

2+ 3+ -

2 2

Fe + O Fe + O * (radicale superossido)

2+ 3+ -

2 2

Rame

• Cu* + H O Cu + OH + OH* (radicale idrossile)

2+ -

2 2

Cu* + O Cu + OH* (radicale superossido)

2+ -

2

Infatti questi metalli nell’organismo sono sempre chelati da proteine specifiche (ferritina e

ceruloplasmina).

Ruolo fisiologico e produzione

Questi radicali vengono fisiologicamente prodotti dalle cellule nei mitocondri per regolare diversi pattern

metabolici, quali:

- Ipossia

- Apoptosi

- Segnali cellulari o fisiologici ad esempio durante l’infiammazione si ha una iperproduzione di

ROS

Le specie radicaliche sono anche normalmente prodotte attraverso la catena di trasporto degli elettroni.

La catena di trasporto degli elettroni coinvolge il succinato che viene utilizzato per ridurre il FAD a

FADH2, una reazione bielettronica che avviene mediante un

passaggio attraverso una forma radicalica FMNH*, utilizzata

dai mitocondri per innescare una serie di segnali.

Gli elettroni fluiscono poi dal complesso II al complesso III

dove sono presenti proteine che catalizzano reazioni

monoelettroniche: per passare ad una reazione

monoelettronica interviene il coenzima Q che presenta un

gruppo funzionale in grado di prendere 2 elettroni (Q→QH )

2

passando attraverso una forma radicalica QH*.

Un altro meccanismo di produzione di ROS avviene in cellule specializzate, ovvero cellule di difesa (es.

macrofagi). Queste cellule sono in grado di produrre specie reattive a livello extracellulare, in particolare

radicali superossido o acqua ossigenata, che fungono da difesa contro patogeni extracellulari.

Gli enzimi deputati alla produzione di questi radicali si trovano a livello della membrana cellulare al fine

di produrre le specie radicaliche verso l’esterno della cellula.

Questa stessa reazione può avvenire anche verso il citosol ad opera di lipoossigenasi: in questo caso la

reazione è necessaria per la regolazione cellulare. In presenza di ossigeno, le lipoossigenasi producono

ione superossido necessario alla regolazione di pattern intracellulari. Le lipoossigenasi sono in grado di

produrre radicali poiché possiedono il Fe come cofattore, in grado di ridurre O a radicale superossido

2+ 2

che viene immediatamente legato dall’acido linoleico.

La formazione del radicale viene quindi controllata grazie alla presenza di uno ione ferro coordinato

all’enzima; l’enzima si trova a livello delle membrane biologiche (sia cellulare ma anche di altri organelli).

38

Gli enzimi deputati alla produzione di ROS a partire dall’ossigeno sono le ossidasi (flaviniche o metallo-

flaviniche), in particolare:

Xantina ossidasi ossidoreduttasi contenente i cofattori FAD e molibdeno e due centri ferro-

• →

zolfo; interviene nella produzione di acido urico, che porta alla produzione di acqua ossigenata e

ione radicale superossido. Questo enzima è presente in quantità significative nel globulo di grasso

del latte, infatti viene spesso sfruttato per una sanitizzazione del latte nei paesi poveri (in quanto

produce acqua ossigenata)

D-amminoacido ossidasi (DAAO) catalizza la deidrogenazione di amminoacidi a dare il

• →

corrispondente chetoacido, ammoniaca e acqua ossigenata; costituisce il 90% degli enzimi

presenti nel rene. La sua attività è necessaria per la produzione di mediatori cerebrali.

Esiste in due isoforme, uno agisce sugli L-amminoacidi ed uno sui D-amminoacidi.

Monoammino ossidasi

Azione dei radicali

Le specie radicaliche possono agire a livello del DNA dove modificano la struttura delle basi. Questo

avviene anche nei normali processi di invecchiamento, in cui l’efficienza del sistema endogeno di

riparazione diminuisce.

I radicali agiscono anche a livello dei lipidi, su cui generano radicali lipidici con una struttura diversa

rispetto ai lipidi non perossidati, quindi alterano la struttura della membrana.

La formazione di specie radicaliche accelera anche il processo di apoptosi, alterando quindi la

programmazione cellulare.

L’apoptosi – o morte programmata delle cellule – è un avvenimento normale per lo sviluppo e per la

salute di un organismo multicellulare. Le cellule muoiono in risposta ad una varietà di stimoli e durante

l’apoptosi esse lo fanno in modo strettamente controllato e regolato.

Il processo di apoptosi ha inizio a livello della membrana: in presenza di un eccesso di ROS (che vengono

normalmente prodotti per regolare la morte cellulare) si ha l’innesco della catena che conduce alla morte

cellulare. Un eccesso di ROS determina un aumento della permeabilità del mitocondrio al cyt C: la

liberazione del cyt C, che si trova esclusivamente a livello della membrana interna dei mitocondri, a

livello del citosol innesca una serie di sintesi a livello nucleare e l’attivazione di caspasi in grado di

innescare la morte per apoptosi.

ROS e infiammazione/invecchiamento

Infiammazione ed invecchiamento sono fasi in cui si ha una produzione anomala di ROS.

La produzione di ROS va a controllare il complesso di trascrizione PARP1 che a sua volta regola la

produzione di una serie di segnali legati ad uno stato infiammatorio, tra cui una serie di enzimi che

portano all’ossidazione di NAD+.

Il NAD è un cofattore che interviene in reazione catalizzate da enzimi redox: i ROS facilitano

+

l’ossidazione di NAD e quindi riducono la capacità della cellula di rispondere alla produzione di ROS

+

(poiché il NAD non è più in grado di ridursi a NADH).

+

Durante l’invecchiamento quindi si ha l’induzione di PARP1 che lavora favorendo il mantenimento dei

ROS, poiché a livello metabolico si ha un aumento della concentrazione di NAD ossidato, quindi ho meno

+

NADH che può essere utilizzato per neutralizzare i ROS.

39

PARP1 va anche ad attivare il fattore di trascrizione NF-kB che induce la produzione di interleuchine,

mediatori infiammatori.

PARP1 interviene anche nella riparazione del DNA in due modi:

- Low level damage PARP1 non si associa facilita la riparazione del DNA cell recovery

→ → →

- High level damage PARP1 si associa facilita il danneggiamento del DNA e l’attivazione delle

→ →

caspasi apoptosi

→ -

Controllo dei livelli intracellulari di ROS

La cellula possiede enzimi in grado di convertire i ROS in entità meno tossiche, tra cui:

- Superossido reduttasi

- Catalasi

- Glutatione perossidasi

- Peroxiredossina

Questi enzimi catalizzano reazioni redox, ovvero agiscono riducendo i ROS attraverso l’ossidazione del

glutatione. È necessario quindi che sia presente una grande quantità di glutatione in forma ridotta: la

cellula possiede infatti anche un sistema di rigenerazione del glutatione attraverso l’enzima GSSG-

reduttasi.

Il glutatione è un importate substrato per la neutralizzazione dei ROS, infatti lo stato ossidativo della

cellula può essere valutato misurando il rapporto


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_ariiel

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in alimentazione e nutrizione umana (Facoltà d'Agraria e di Medicina)
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher _ariiel di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica degli alimenti, della nutrizione e delle malattie metaboliche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Iametti Stefania.

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