Biochimica degli Alimenti

Controllo delle modificazioni strutturali e funzionali in proteine e biopolimeri

Per studiare le modificazioni strutturali e funzionali delle proteine che sono strutturalmente presenti in un alimento, possiamo identificare: che effetto ha una modificazione proteica indotta da un trattamento? Come posso indirizzare queste modificazioni?

Modificazioni strutturali in alimenti contenenti proteine

• Proteine strutturali (es. actina/miosina, nel muscolo)
• Proteine di riserva (es. semi, uovo)
• Secreti proteici (es. latte)

Le proteine vengono modificate per alterarne la texture e renderle appetibili, ad esempio nella soia che come tale non è masticabile ma viene modificata per ottenere prodotti (es. tofu).

Importanza del controllo delle modificazioni strutturali delle proteine

Il controllo delle modificazioni strutturali delle proteine è importante perché:

• Permette il controllo dell'interazione tra le proteine e altri componenti (ioni, polisaccaridi, lipidi). Sono interazioni deboli legate al fatto che la proteina ha una certa struttura.
• Le proteine hanno capacità di interagire con il solvente acqua: la capacità di legare l'acqua è alla base della definizione della texture di molti alimenti e rende l'acqua più o meno disponibile per reazioni enzimatiche o reazioni da parte dei microorganismi.
• Fungono da marker diretti e indiretti di trattamento. Una modificazione strutturale è anche indice di sicurezza per un alimento. Ad esempio, nelle carni contaminate da BSE, il prione è sempre presente nella carne, ma solo se la sua conformazione viene modificata in β-foglietto diventa patogeno per il consumatore.

Modificazioni funzionali e strutturali

Un altro aspetto importante sono le modificazioni funzionali legate alle modificazioni strutturali di:

• Proteine enzimatiche naturalmente presenti
• Proteine aggiunte per trasformazione

Tali modificazioni sono utili per diversi scopi:

• Controllo della funzione (attività enzimatica)
• Markers diretti e indiretti di trattamento (indicatori di processo)
• Impieghi analitici
• Determinazione della presenza di metaboliti, ad esempio le ammine biogeniche prodotte da reazioni enzimatiche, in cui l'enzima può anche non essere più presente.

Denaturazione proteica

La denaturazione è un intervento che modifica la struttura nativa della proteina. I tre agenti principali che vengono utilizzati in tecnologia alimentare per indurre la denaturazione delle proteine sono:

• Agenti fisici (trattamento al calore)
• Agenti meccanici (omogeneizzazione, emulsioni)
• Agenti enzimatici (proteolisi, decarbossilazione)

Le modificazioni chimiche sono reazioni catalizzate da azioni termiche o da azioni enzimatiche, quindi rientrano nelle precedenti categorie.

Trattamento termico

Un trattamento termico ha un effetto sull'alimento che dipende dalla sua intensità: in base all'intensità i bersagli all'interno dell'alimento sono diversi.

L'obiettivo principale di un trattamento termico è quello di sanificare e quindi agire sulle cellule intere, che vengono colpite per prime. All'aumentare dell'intensità, il trattamento va ad agire prima sulle piccole molecole (vitamine), poi sui polimeri strutturali (proteine ed acidi nucleici), sui polimeri non strutturali (polisaccaridi e lipidi), ed infine spore e cellulosa.

Quindi in base all'intensità del trattamento abbiamo un diverso coinvolgimento dei componenti dell'alimento: un trattamento blando non è detto che modifichi altri componenti oltre alle cellule.

I processi in cui il principale agente è una denaturazione termica sono:

• Cottura
• Sanitizzazione
• Essiccamento a caldo

Il primo effetto del trattamento al calore è la modificazione della struttura:

• Proteine globulari: si ha una rottura dei ponti idrogeno, lo scambio S-S e l'esposizione di siti idrofobici. La conseguenza è la formazione di gel (es. ovoalbumina) o di aggregati più o meno insolubili; ne deriva che la proteina diventa più o meno aggredibile dalle proteasi e quindi più o meno digeribile; se la proteina è un allergene, in forma polimerica è molto più immunogenica.
• Collageno: l'effetto del trattamento termico determina la solubilizzazione della proteina e la formazione di gel, dovuta alla rottura di legami H.
• Gliadine/gluteline: il trattamento termico modifica l'esposizione delle regioni idrofobiche. I legami coinvolti nella modificazione conformazionale sono i legami idrogeno, ovvero legami geometrici che vengono perturbati da modificazioni dell'acqua; il trattamento termico infatti non modifica interazioni di tipo covalente, non rompe legami peptidici!

La modificazione strutturale determina l'acquisizione di una struttura diversa, che può essere reversibile o irreversibile. Quindi durante la fase di raffreddamento la proteina può assumere:

• La struttura nativa: la modificazione è definita reversibile, le proprietà ritornano uguali a quelle dell'alimento nativo.
• Una struttura diversa da quella nativa, che può essere uguale a quella durante il trattamento o ulteriormente modificata, struttura irreversibilmente denaturata che dipende dall'intensità del trattamento; ha delle proprietà diverse rispetto a quelle che aveva prima del trattamento, quindi una diversa capacità di interagire con altre proteine o composti.

Con il termine modificazione transiente si intende la modificazione della proteina durante il trattamento: tale modificazione può poi ritornare alla conformazione originaria o mantenersi come tali.

Parametri termodinamici e cinetici del trattamento

Un altro parametro importante è l'aspetto termodinamico e cinetico relativi al trattamento: quanto tempo? Quanto calore viene fornito?

Le modificazioni proteiche sono difficili da studiare in quanto prevedono lo studio di alimenti complessi che contengono anche altri componenti (lipidi, oligosaccaridi).

Effetto del trattamento termico sulla struttura proteica

La struttura tridimensionale di una proteina è il risultato di 4 livelli di organizzazione strutturale, ovvero il risultato della conformazione termodinamicamente più stabile.

Struttura primaria

Il trattamento termico non rompe i legami peptidici tra gli amminoacidi, poiché sono legami covalenti che possono essere rotti solo da agenti enzimatici. Tuttavia, il trattamento termico può modificare i gruppi R degli amminoacidi, ovvero portare alla formazione di amminoacidi non naturali.

Il primo effetto infatti è la modifica della digeribilità e del valore nutrizionale dell'alimento, poiché gli enzimi digestivi sono in grado di agire su specifici residui e gruppi, che se modificati diventano indisponibili all'enzima. Inoltre, la presenza di gruppi non naturali determina l'innescarsi di cicli metabolici di eliminazione che prevedono una serie di reazioni che possono portare a danno cellulare.

Modificazione covalente delle catene laterali degli amminoacidi

Le principali modifiche consistono in:

• Desulfurazione dei residui di cisteina e cistina, con liberazione di solfuro di idrogeno (H₂S) che conferisce la classica puzza d'uovo.
• Deammidazione di glutammina ed asparagina con risultante formazione di NH₄⁺. La glutammina viene trasformata in acido glutammico e si ha la formazione di ammoniaca.
• Disidratazione per β-eliminazione, con formazione di deidro-alanina (DHA). La molecola DHA è reattiva in una reazione spontanea con un residuo di lisina e determina la formazione di lisinoalanina (LAL) che diventa quindi indisponibile.
• Ossidazione del gruppo R di amminoacidi aromatici indotta per azione chimica (specie alle alte temperature) formazione di composti ad azione mutagena, ad esempio i derivati del triptofano: questi composti si formano durante la cottura delle carni alla griglia, quando la temperatura dell'alimento supera i 200°C.
• Reazione di Maillard interessa gli alimenti che contengono zuccheri, principalmente gli aldosi ed in particolare il glucosio. La reazione può essere suddivisa in tre fasi e porta alla formazione di composti più o meno bruni in base all'intensità del trattamento. Da queste reazioni si forma il composto furosina. La cui quantità è alla base della classificazione di molti alimenti.

Gli effetti della reazione di Maillard sulle proteine sono molteplici:

• Effetti sui caratteri organolettici: off-flavour e colore. Durante i processi di conservazione si cerca di evitare che la reazione si verifichi.
• Effetti anti nutrizionali: minor disponibilità di amminoacidi essenziali, in particolare lisina.

La quantità con cui si formano questi composti varia a seconda dell'intensità del trattamento.

Struttura secondaria e terziaria

Il calore modifica fortemente la struttura secondaria, dovuta ad interazioni idrogeno molto sensibili, e la struttura terziaria, caratterizzata da interazioni deboli idrofobiche, idrogeno o elettrostatiche.

Le interazioni idrogeno ed idrofobiche sono sensibili al calore, mentre le reazioni elettrostatiche possono essere modificate in maniera indiretta dalla modificazione della struttura proteica.

Il primo effetto è la formazione di una struttura secondaria/terziaria diversa da quella originaria. Poiché il primo bersaglio di un trattamento termico sono sempre le proteine e l'acqua stabilizzate da legami idrogeno, i principali effetti del calore sono la modificazione di interazioni:

• Proteina-proteina
• Proteina-acqua
• Proteina-soluto

Dovute al cambiamento di idrofobicità della molecola. Una stessa proteina infatti in forma polimerica è in genere meno aggredibile da parte di enzimi digestivi, ma più immunogenica.

Esempio BLG

La β-lattoglobulina (BLG) è presente nel siero di latte di quasi tutti i mammiferi, assente nel latte umano. È una lipocalina poiché ha una struttura con un calice idrofobico ed una caratteristica β-foglietto α-elica. Non si conosce la sua funzione, è ritenuto uno dei principali allergeni del latte, ed è difficilmente digeribile. Le lipocaline sono proteine che legano composti idrofobici, tra cui il retinolo ed acidi.

Per evidenziare le modificazioni strutturali a cui va incontro questa proteina è possibile utilizzare diversi metodi, sia sulla proteina isolata che sulla proteina ancora contenuta all'interno dell'alimento.

Tecniche che studiano la proteina nell'alimento

1. Fluorimetria

Il primo metodo prevede la misurazione del posizionamento all'interno della struttura proteica di alcuni particolari residui amminoacidici a seguito del trattamento rispetto alla struttura nativa. I residui target devono avere proprietà spettroscopiche e non devono essere numerosi all'interno della proteina, altrimenti potrebbero essere fuorvianti. Normalmente vengono impiegati i residui di triptofano poiché sono solo due all'interno della molecola e sono altamente idrofobici, quindi posizionati nelle regioni più interne della molecola. I residui di triptofano sono residui fluorescenti. La fluorescenza è l'abilità di emettere radiazioni a seguito di eccitazione da parte di una luce. La luce emessa ha proprietà diverse a seconda della posizione spaziale del fluoroforo.

La luce è dotata di due proprietà:

• Energia, legata alla frequenza (inverso della λ)
• Intensità

Di questi due parametri viene considerata la frequenza, poiché l'intensità può essere modificata dalla presenza di altri amminoacidi adiacenti al triptofano in grado di assorbire la luce.

Se osserviamo gli spettri di fluorescenza intrinseca di BLG, possiamo vedere come all'aumento della temperatura, la lunghezza d'onda della luce emessa varia. Ciò avviene poiché i triptofano hanno modificato posizione e quindi la proteina si è modificata. A variare però è anche l'intensità dovuta all'assorbimento di intensità da parte di altri gruppi R, o altri componenti proteici o non proteici che possono assorbire l'intensità ma non influenzano l'energia con cui la luce è emessa.

2. Metodo spettroscopico

È basato sul fatto che i residui cisteinici nella struttura proteica devono essere protetti dall'ossigeno, in quanto il gruppo –SH è facilmente ossidabile dall'ossigeno. Nelle proteine generalmente i residui –SH formano ponti disolfuro, tuttavia se questi sono presenti in numero dispari, le proteine si organizzano per posizionare il residuo cisteinico in una zona idrofobica. La BLG ha 5 residui –SH, di cui due ponti ed un residuo libero localizzato in una zona idrofobica: se la proteina si denatura, il residuo viene esposto. Posso utilizzare diversi marcatori che hanno un grosso gruppo idrofobico ed un residuo –SH, in grado di legarsi al residuo –SH della proteina e produrre un reattivo di colore giallo.

Tuttavia i marcatori sono molto grossi, quindi non riescono ad entrare nella struttura nativa della proteina e raggiungere il gruppo –SH. I marcatori quindi forniscono due tipi di informazione:

• Se la proteina è stata scaldata
• Permettono di seguire le modificazioni della proteina durante il trattamento

Questo metodo può essere utilizzato solo per lo studio di proteine che presentano residui –SH liberi e non impegnati in ponti disolfuro.

3. Misurazione delle regioni idrofobiche superficiali

La proteina viene scaldata, subisce una modificazione conformazionale che determina una maggiore esposizione dei residui idrofobici. Quindi al momento del raffreddamento, la proteina cercherà una nuova conformazione oppure tenderà ad associarsi con altre proteine formando aggregati proteici più o meno solubili. Vengono utilizzati marcatori che vanno a legarsi alle regioni idrofobiche della proteina, ed una volta legati cambiano la fluorescenza (blu → rosso). I marker sono diversi e si differenziano per l'ingombro sterico e quindi la loro abilità di penetrare nella struttura proteica.

Negli alimenti si usano infatti sieroproteine che presentano regioni idrofobiche in grado di legare i lipidi e quindi servono a stabilizzare e a legare e permettono l'aggiunta di tipi di grassi che non sarebbero possibili altrimenti.

Struttura quaternaria

Proteine caratterizzate dall'associazione più o meno covalente di più proteine. Le associazioni proteiche possono essere indotte dal trattamento termico:

• A seguito di esposizione di porzioni idrofobiche
• Scambio di disolfuri: se la proteina possiede un gruppo –SH all'interno della catena peptidica che viene esposto, questo può diventare estremamente reattivo nei confronti di un'interazione S-S presente in un'altra proteina. Il gruppo –SH va a rompere il legame S-S e scambiarsi con uno dei residui –S e a formare un legame intercatena; si formano quindi polimeri di proteina, uniti dai gruppi S-S. Il numero dei gruppi –SH non varia, non è una reazione redox.

Lo scambio di disolfuri può avvenire ad esempio tra il gruppo –SH libero della BLG e la K-caseina. Modificazioni complessive della struttura possono comportare una modifica della solubilità delle proteine nell'alimento: in genere una proteina denaturata è meno solubile della struttura nativa.

È stato osservato che le proteine del latte, quando hanno una struttura denaturata, possono cambiare la loro solubilità. Se il latte crudo viene posto al punto isoelettrico delle caseine (pH 4.6), la solubilità delle proteine varia, le caseine precipitano ed in soluzione rimangono solo le sieroproteine. Più il latte è trattato termicamente, meno sono le sieroproteine in soluzione a pH 4.6, poiché la struttura denaturata delle proteine le rende meno solubili.

Questa osservazione ha indotto la promulgazione di una legge per la valutazione del latte (pastorizzato, trattato UHT) sulla base della presenza di sieroproteine. Questa stessa valutazione viene utilizzata per identificare l'eventuale aggiunta di latte in polvere in un formaggio.

Esempi di applicazione della denaturazione controllata nella trasformazione del materiale alimentare

Classificazione delle proteine dei cereali sulla base della solubilità

Le proteine dei cereali sono divise in due grosse categorie:

• Proteine di riserva: costituiscono il glutine durante la formazione di un impasto, sono costituite da due famiglie di proteine classificate in base alla loro solubilità. Sono costituite da sequenze ripetitive fondamentali per la formazione dell'impasto e caratterizzate da residui idrofobici.