Biochimica alimentare

BIOCHIMICA

La biochimica si occupa, tra le altre cose, di:

● controllare le interazioni tra i diversi componenti​ :

○ proteina-ambiente (modalità di conservazione)

○ proteina-proteina (impasti)

○ lipidi-proteina (burro)

○ amido-proteina (paste)

○ amido-lipidi (pane)

● controllare le modificazioni strutturali in proteine e biopolimeri​ :

​

○ modificazioni strutturali :

■ proteine strutturali degli alimenti (actina e miosina): ad esempio per la conversione

del muscolo in carne.

■ proteine di riserva (tipiche di semi e uova): ad esempio, in preparazione di impasti,

meringhe e maionesi.

■ secreti proteici (tipici del latte): ad esempio nella produzione di latte e formaggio.

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○ modificazioni funzionali :

■ enzimi (che ricordiamo essere proteine): nei metodi di conservazione.

■ impiego di enzimi in specifici processi.

● definizione e quantificazione delle modificazioni:

○ strutturali: usate negli impieghi analitici.

○ funzionali:

■ impieghi analitici.

■ markers diretti ed indiretti di trattamento.

■ determinazione della presenza di metaboliti. 1

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Proprietà delle proteine di un alimento

● Interazioni acqua-proteina​ : solubilità.

● Interazione con micromolecole​ : legame e rilascio controllato di aromi e nutrienti.

● Interazioni interfacciali​ :

○ formazione e stabilizzazione di schiume.

○ formazione e stabilizzazione di emulsioni.

● Interazioni macromolecolari​ : formazione e stabilizzazione di gel.

Fattori che influenzano la solubilità

● Ambiente:

○ forza ionica (fenomeni di salting in e salting out).

○ pH (punto isoelettrico)

○ ruolo dei metalli

● Caratteristiche della struttura proteica:

○ nativa: solubile.

○ denaturata: insolubile. 3

Fenomeni di salting in e salting out 4

pH 5

Variazione della solubilità associata alla modificazione di una struttura

● ioni e del pH​ hanno un ruolo nel modificare la solubilità di una proteina SENZA una modificazione

della sua struttura nativa. Fenomeni di salting in o salting out modificano la solubilità delle proteine

mantenendone la struttura nativa.

NB:

Definizione dei processi di salting in e salting out: una bassa concentrazione di sale porta ad un

aumento della solubilità delle proteine (salting in), viceversa un’alta concentrazione ne fa diminuire

la solubilità (salting out). Ciò è dovuto alla bassa forza ionica del sale che contribuisce ad

​

abbassare quella della soluzione .

​

● Alcuni sali modificano la solubilità con variazione di struttura.

● Trattamenti di processo​ che modificano la struttura nativa della proteina.

Alcuni sali o trattamenti tecnologici possono fare acquisire alle proteine una struttura denaturata meno

solubile rispetto alla proteina nativa.

Variazione di solubilità

Alcuni sali hanno la proprietà di modificare la struttura con conseguente variazione di solubilità.

Come faccio ad individuare questi sali?

Classificazione dei sali:

● Structuring salts​ (sali con funzione strutturante) stabilizzano la struttura di una proteina. Si tratta di

Sali che hanno una sfera di solvatazione molto estesa, che vanno a schermare le cariche superficiali

delle proteine con un effetto stabilizzante.

Questi sali vengono definiti sali liofilici (Cs+; SO42-; HPO42-)

Nella figura sottostante siamo in presenza di fenomeni di salting in (aumento della solubilità) o di

salting out (decremento della solubilità).

● De-structuring salts​ (sali con funzione destrutturante): che sono in grado di modificare la struttura di

una proteina nativa facendogli assumere una struttura denaturata: sono caratterizzati da una modesta

solvatazione e possono penetrare nella struttura proteica andando a interferire sulle interazioni

elettrostatiche tra due residui amminoacidici carichi. Questo porta a una denaturazione della proteina.

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Questi Sali sono definiti sali lipofilici (es. Li+; CLO4-; SCN-).

Nella figura sottostante viene rappresentato il fatto che la proteina denaturata, in base alla forza

ionica del sale, può essere solubile o insolubile.

Applicazioni pratiche di variazioni della solubilità di proteine in alimenti

In alcuni alimenti una variazione di solubilità delle proteine rappresenta la modificazione principale per la

loro produzione.

Ci sono diversi agenti che possono portare a una modifica della solubilità:

● pH​ : la variazione di pH che modifica la solubilità della caseina, è alla base della produzione di

yogurt.

● calore​ : la variazione della struttura nativa delle due sieroproteine beta-lattoglobulina e

alfa-lattoalbumina è alla base della produzione di ricotta. Lo stesso agente denatura l’ovoalbumina

nell’uovo sodo e il collagene nella gelatina.

● ioni metallici​ : una variazione di proteine della soia, indotte da ioni bivalenti, è alla base della

produzione del tofu.

● enzimi​ : l’azione dell’enzima chimosina su k-caseina porta a una variazione della struttura della

micella e della solubilità della caseina con formazione macroscopica alla base della produzione di

formaggio.

Classificazione delle proteine dei cereali sulla base della solubilità

● albumine e globuline sono solubili in soluzioni acquose:

○ albumine in assenza di sali.

○ globuline in presenza di sali.

● prolamine (gliadine nel frumento) sono solubili in soluzione acquosa.

● gluteline (glutenine nel frumento) sono solubili in soluzioni debolmente alcaline o acide

(NB: gliadine e glutenine costituiscono il complesso proteico del glutine).

Outline

Metodo analitico per la distinzione di latte pastorizzato da latte UHT su variazione della solubilità delle

proteine presenti nel latte.

Le caseine hanno un punto isoelettrico pari a pH 4.6.

A pH 4.6:

● le caseine sono insolubili (precipitano).

● le sieroproteine (che hanno punto isoelettrico diverso) sono solubili.

● le sieroproteine denaturate sono insolubili. 7

Il dosaggio delle proteine per il monitoraggio di processi produttivi

La legge per differenziare il latte pastorizzato da quello UHT è basata sulla determinazione della quantità di

sieroproteine solubili al punto isoelettrico delle caseine (pH 4.6).

Se è avvenuto un trattamento termico le sieroproteine saranno denaturate. Il numero di proteine denaturate

sarà proporzionale quindi alla lunghezza del trattamento termico.

(Ricorda che a pH 4.6 le sieroproteine denaturate sono insolubili, mentre solitamente sono solubili).

Maggiore è la denaturazione e minore sarà la quantità di sieroproteine solubili a pH 4.6.

Su questo principio è stata è basata la legge per distinguere latte pastorizzato da UHT, o formaggi fatti con

latte pastorizzato rispetto all’impiego di latte in polvere.

Esempio dell’applicazione di variazioni della solubilità negli alimenti: gels proteici

Gel: sistema solido dove sono presenti grandi quantità di solvente.

La formazione di gels proteici a livello molecolare è determinata da una variazione della solubilità delle

proteine. ​

La base di partenza sono gli arrangiamenti spaziali degli aggregati​ (come interagiscono fra loro le proteine)

che hanno un impatto sulle proprietà reologiche (deformazione e viscosità), sensoriali e sulla capacità di

trattenere acqua.

Caratterizzazione dei gels in base ai legami che li stabilizzano

Gelatina proteina collagene: Gel stabilizzato da legami a idrogeno

E’ l’unico gel reversibile:

● con il riscaldamento le proteine si solubilizzano in acqua e si rompono i legami a idrogeno,

permangono i legami covalenti del collagene.

● con il raffreddamento si formano i legami a idrogeno intermolecolari che generano una struttura

reticolare con l’acqua intrappolata.

Il numero di legami covalenti tra i filamenti di tropocollagene serve a dare rigidità e cresce con età e peso

del soggetto. 8

Colla di pesce vs colla d’osso

Perchè sono diverse?

La colla di pesce avrà molta meno rigidità rispetto a quella d’osso, il pesce infatti ha bisogno di uno

scheletro molto meno forte rispetto a quello di un animale che vive sulla terraferma.

Per quali preparazioni alimentari si usano?

Mentre la colla d’ossa non viene utilizzata nell’ambito alimentare ma, generalmente, viene utilizzata per la

riparazione di mobili di legno, la colla di pesce viene usata per preparazioni quali semifreddi, bavaresi,

gelatine e pannacotta.

Gel stabilizzato da interazioni elettrostatiche (intese come tra molecole o ioni negativi e positivi)

Gel irreversibile (proteine della soia, ricche in amminoacidi acidi): le proteine della soia come tali non hanno

texture, ma interessanti proprietà nutrizionali.

Allo scopo di migliorarne la «texture» ed il consumo, le proteine isolate sono trattate con soluzioni di

idrossido di calcio. In questo modo i residui carichi di due proteine: aspartato e glutammato interagiscono

con gli ioni calcio (vedi schema) e formano una rete proteica all’interno della quale è trattenuta l’acqua. Si

forma così un alimento con una «texture» che ne favorisce il consumo. Si utilizzano ioni bivalenti in quanto

solo in questi ioni possono generare un reticolo proteico .

Gel stabilizzato da interazioni S-S intercatena

Questi gel sono stabilizzati da interazioni covalenti inter proteina tipo S-S (disolfuro) dovuti all’interazione

tra i residui SH (tiolici) dell’amminoacido cisteina. Per questo motivo i gel irreversibili sono possibili solo

dopo la denaturazione di proteine ricche in residui di cisteina.

Queste interazioni S-S inter proteina si generano in seguito a fenomeni di scambio (disulphide exchange): la

proteina, in seguito ad un trattamento, assume una struttura denaturata che la porta ad esporre un residuo

SH-cisteina, che nella struttura nativa era all’interno, non esposto al solvente.

Questo residuo può ora interagire con un gruppo cisteinico coinvolto in un legame S-S intracatena. Si

verifica quindi una scambio di disolfuri cioè si forma un legame S-S interproteina (sono coinvolti il gruppo

SH esposto e uno dei gruppi SH coinvolti nel precedente legame intraproteina) e un gruppo SH libero (l’altro

residuo cisteinico precedentemente coinvolto nel legame intraproteina).

ATTENZIONE: il numero di residui SH liberi e di interazioni S-S NON CAMBIANO, cambia solo la loro

posizione spaziale. 9

L’esempio più noto è rappresentato dalla denaturazione termica (cottura dell’albume), dove l’albume da una

forma liquida diventa un gel

Ovoalbumina è un monomero di massa pari a 45000 dalton. La proteina che cristallizza come tetramero,

contiene 16 residui di cisteina.

Gel di caseina stabilizzato da interazioni idrofobiche ed elettrostatiche

Con il termine caseina si intende una famiglia di proteine quali: as1-caseina; as2-caseina; beta caseina;

k-caseina.

La sequenza delle diverse caseine è caratterizzata dalla presenza di numerosi residui di prolina, residui

idrofobici, e presentano alcuni residui (serina o treonina) fosforilati. Solo la k-caseina presenta due residui di

cisteina coinvolti in un legame S-S intracatena.

Queste proteine si associano in una super struttura quaternaria: MICELLA.

La struttura della micella non è chiara, vengono proposti vari modelli; il più accreditato prevede che essa sia

costituita da submicelle associate tra loro, di interazioni idrofobiche ed elettrostatiche tra alcuni residui

fosforilati della proteina e lo ione calcio.

Ogni submicella è costituita dalla associazione idrofobica delle diverse caseine, in modo da minimizzare

l’esposizione delle zone idrofobiche.

La k-caseina si associa nella submicella in modo da esporre al solvente la zona idrofilica C-terminale.

Gel caratterizzato da interazioni elettrostatiche ed idrofobiche, per esempio il formaggio.

E’ un gel irreversibile formato da caseina idrolizzata. 10

Il formaggio viene prodotto per idrolisi dell’enzima chimosina che agisce sul residuo PHE-MET della K

caseina.

Questa azione enzimatica comporta una destabilizzazione delle micelle che si trovano quindi con zone

idrofobiche esposte al solvente e cercano quindi di raggiungere la stabilità termodinamica associandosi

idrofobicamente tra micelle in modo ordinato formando quindi un reticolo proteico ordinato che trattiene

acqua e lipidi (coagulo).

Gel di sieroproteine stabilizzato da interazioni idrofobiche e elettrostatiche

La ricotta è costituita da un gel di sieroproteine (beta lattoglobulina e alfa-lattoalbumina) che assumono una

struttura denaturata in seguito a trattamento termico.

Questa struttura denaturata comporta un’ associazione tra sieroproteine stabilizzata da interazioni

elettrostatiche ed idrofobiche. Si forma così una rete proteica ordinata al cui interno viene inglobata l’acqua.

PROPRIETA’ DELLE PROTEINE DI UN ALIMENTO

Legame tra proteine e micromolecole

Come esempio prendiamo aromi, vitamine e polifenoli.

​

In queste interazioni la struttura tridimensionale​ della proteina gioca un ruolo fondamentale. Modificazioni

della struttura tridimensionale, infatti, possono facilitare o precludere tali interazioni.

L’interazione tra proteine e micromolecole:

● è stabilizzata da legami deboli, in particolare interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche.

● sono sfruttate in diversi processi dell’industria alimentare quali: legame/rilascio controllato di aromi;

chiarifica di bevande.

● condiziona anche la biodisponibilità di piccole molecole es. vitamine.

● condiziona anche la biodisponibilità della proteina coinvolta nell’interazione (es proteine/polifenoli).

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La BSA (sieroalbumina) è una proteina impiegata in alcuni alimenti per mantenere la presenza di alcune

molecole idrofobiche, come gli aromi, che sono anche composti volatili. La presenza di proteine per legare

questi tipi di composti è fondamentale per mantenere la loro presenza durante la conservazione del prodotto.

Nella tasca idrofobica possono anche legarsi lipidi. In questo caso è possibile che due fasi (polare e apolare)

coesistano.

La BSA (fig.1) e le sieroproteine (fig.2 betalattoglobulina) sono particolarmente adatte a tale scopo.

NB: questa proprietà può essere svolta solo se la proteina presenta la struttura nativa. L’acquisizione di una

struttura denaturata modifica l’interazione tra proteine e micromolecole.

Interazione proteine polifenoli

I polifenoli possono associarsi a specifiche regioni delle proteine. Queste associazioni sono stabilizzate da

interazioni non covalenti dipendenti dai gruppi coinvolti nell’interazione. Questa proprietà è legata alla

struttura tridimensionale delle proteine. Solo alcune di esse hanno questa proprietà.

Esempio: chiarifica vino

In passato si usavano come proteine l'albume BSA. La caratteristica principale che devono avere le proteine

per la chiarifica di un vino è quella di associarsi preferibilmente con la componente polifenolica responsabile

della torbidità e dell'astringenza (difetti), lasciando presente la componente fenolica responsabile dell’aroma.

Attualmente si stanno selezionando proteine alternative di origine vegetale. Un criterio nella scelta è di

valutare quali proteine sono adatte a legare componente polifenolica in vino.

Interazione tra i polifenoli di interesse (catechine, proantocianidine) e proteina comporta un decremento

dell’idrofobicità superficiale. Isolati proteici di soia e pisello sono quelli più interessanti. 12

Azione di chiarifica

● CHIARIFICA: vino A, poco torbido

Isolati di pisello e lenticchia sono quelli più efficaci (diminuzione di 3 volte della torbidità); isolati

glutine e soia decremento della torbità del 50% rispetto a quella iniziale.

● CHIARIFICA: vino B, molto torbido

Tutti isolati proteici sono efficaci (e comportano una diminuzione di 5 volte della torbidità).

Effetto sulla componente aromatica

Nella scelta dell’isolato occorre tener presente l’effetto complessivo sulla componente aromatica.

L’isolato scelto è un buon compromesso tra la sua capacità di rimuovere la componente polifenolica

responsabile dei difetti del vino e una modesta riduzione della componente aromatica. Questo duplice

aspetto dipende, oltre che dalle proprietà dell’isolato proteico, dalla matrice vino di interesse.

Sono mostrati di seguito due esempi:

● vino bianco

La perdita della componente aromatica è modesta per tutti gli isolati tranne la soia. 13

● vino rosso

La perdita della componente aromatica nei vini trattati con isolati proteici è inferiore rispetto a quello

non chiarificato.

In un vino non trattato naturalmente i composti polifenolici che sono presenti in grande abbondanza

tendono a polimerizzare e a precipitare. Questo evento si applica soprattutto a dei composti quali i

tannini etc che sono responsabili di sapori astringenti e di una serie di difetti del vino. Nella loro

polimerizzazione e precipitazione questi composti inglobano anche altri polifenoli che sono

responsabili della componente aromatica.

Per questo motivo viene introdotto il processo di chiarifica che ha lo scopo di allontanare soprattutto

i composti che hanno effetti negativi, minimizzando l’allontanamento di quelli responsabili della

componente aromatica.

Riassunto proprietà delle proteine con micromolecole

Legame e rilascio controllato di aromi, legame con sostanze colorate, legame con componenti idrofobici di

alimenti

Composizione bilanciata con abbondanza di siti idrofobici superficiali o con siti specifici ad alta affinità

Solubilità non strettamente necessaria

Denaturazione può variare caratteristiche di legame 14

Ruolo delle proteine nella stabilizzazione di interazioni interfacciali

Descrizione dei diversi sistemi nei quali le proteine hanno un ruolo fondamentale nella stabilizzazione di due

sistemi che non potrebbero co-esistere.

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Le proteine per le loro