Biochimica

Introduzione alla biochimica

Metabolismo energetico

Comprende tutte le reazioni che permettono la sopravvivenza dell’organismo, ottenendo e spendendo energia. Esistono quattro tipi di vie metaboliche che permettono di:

• Rendere disponibile l’energia attraverso gli alimenti
• Conservare molecole come riserva di energia (es. glicogeno, glicerolo + acidi grassi…)
• Sintetizzare sostanze necessarie non fornite dalla dieta
• Smaltire sostanze di scarto (catabolismo)

L’ambiente di queste reazioni è l’acqua, il solvente della vita, che costituisce circa il 60% del nostro organismo (uomo adulto normopeso, nel bambino è più alta, nell’anziano diminuisce, nella donna è minore a causa del maggiore tessuto adiposo). Dei 40 L medi, 25 sono di fluido intracellulare e 15 extra, di cui 5 L sangue, 10 L liquido interstiziale.

L'acqua è una molecola tetraedrica con ossigeno al centro, più due doppietti elettronici e due H con angolo di legame H-O-H schiacciato (di 104.5°) a causa della repulsione dei doppietti. Due dipoli causano O con δ e H con δ, trasformandola in una molecola polare con momento dipolare netto μ = 1.85 D verso O.

L’acqua interagisce con altre molecole di acqua e non (soprattutto proteine e acidi nucleici) con formazione di legami a idrogeno relativamente deboli (23 kJ/mol in H₂O), con legame tra accettore (di solito O o N) e donatore (un atomo elettronegativo) di idrogeno – interazione in parte covalente (10% per la sovrapposizione tra gli orbitali di legame) e in parte elettrostatica (90%, ha una direzionalità).

Ci sono due tipi diversi di legame a idrogeno (più o meno in asse = più o meno forte): quelli non in asse sono i più frequenti a temperatura ambiente, che sono inoltre molto labili a causa dell’agitazione termica (vita media di un ponte idrogeno = 1-20 ps), con formazione di labili flickering clusters (gruppi di molecole d’acqua allo stato liquido unite tra loro da ponti idrogeno) separati da H₂O monomerica non legata, e con aumento dell'entropia man mano che si aumenta la temperatura.

L’acqua allo stato liquido ha una densità maggiore del ghiaccio, che vi galleggia sopra, in quanto le sue molecole sono bloccate in una struttura ordinata (ponte H in asse). L’acqua ha inoltre elevati punti di fusione (0 °C) ed ebollizione (100 °C), calore di evaporazione (2.260 J/g) e valore di costante dielettrica, che ha un’efficace attività di schermatura delle interazioni elettrostatiche tra gli ioni disciolti in essa.

Effetto idrofobico = fenomeno per cui un composto apolare in un mezzo acquoso tende a minimizzare la superficie di contatto con l’acqua medesima avviene soprattutto nei composti anfipatici, che tendono a formare micelle con parte apolare dentro e polare fuori – processo favorito entropicamente perché minimizzando il numero di molecole ordinate d’acqua necessarie per circondare le porzioni idrofobiche delle molecole di soluto, si ottiene una maggiore stabilità termodinamica.

Elettroliti disciolti in acqua sono principalmente cationi come Na⁺ e K⁺ e anioni come Cl^-, HCO₃^- e fosfato inorganico, i cui livelli sono mantenuti in range fisiologici che garantiscano l’omeostasi grazie ai movimenti dell’acqua (cfr. osmosi).

A causa della bassissima costante di dissociazione dell’acqua ([OH^-] e [H⁺] sono circa 1x10^-7 M e K_w = 1.8x10^-16), il suo pH è praticamente = 7, mentre il pH sanguigno è compreso tra 7.44 e 7.36 e intracellulare tra 7.4 e 6.9 (intervalli di confidenza più ampi perché le reazioni avvengono nella cellula producendo acido). Il pH dei liquidi corporei è mantenuto costante grazie a sistemi tampone (acidi deboli + base coniugata) es. bicarbonato per il pH sangue con anidrasi carbonica che unisce la CO₂ nel sangue con l’acqua a formare H₂CO₃ (acido carbonico) che tampona H⁺ nel sangue:

• Quando H⁺ aumenta (es. in caso di esercizio fisico acido lattico nel muscolo) aumenta anche H₂CO₃, che a sua volta fa aumentare CO₂ nel sangue, aumentando la pressione parziale nei polmoni di CO₂ che viene poi espulsa con la respirazione.
• Quando invece H⁺ nel sangue diminuisce (es. in protonazione di NH₃ del catabolismo), più H₂CO₃ si dissocia in H⁺ e HCO₃^- e più CO₂ dai polmoni si dissolve nel plasma.

Amminoacidi & struttura delle proteine

Le proteine sono polimeri di L-α-amminoacidi: α perché C_α è il carbonio centrale (centro chirale) a cui sono legati i quattro gruppi amminico (H₃N⁺), acido (COO^-), H e R. Le molecole chirali hanno una struttura tetramerica, dette L perché hanno una struttura analoga a L-gliceraldeide con H a destra (convenzione di Fischer valida solo per amminoacidi perché gli era andata di "culo" – quella seria è la RS). Sono tutti chirali tranne la glicina perché R = H. Rappresentazione standard a pH fisiologico con gruppo carbossilico deprotonato e amminico protonato = forma zwitterionica a carica netta neutra.

Arrivando ad un valore di pH pari al valore della pK_a del gruppo amminico si ha l’inizio della deprotonazione anche del secondo gruppo fino a raggiungere una carica netta negativa. Gli aa sono identificabili da due codici: a una o tre lettere.

Per cariche e pH bisogna considerare anche le catene laterali degli amminoacidi, che possono essere classificate in vario modo, in base a:

• Carica: amminoacidi carichi (basici o acidi) o neutri
• Polarità: amminoacidi polari (normali o ammidici) o apolari (con catene alifatiche o aromatiche)
• Caratteristiche della catena laterale: amminoacidi ramificati, con zolfo, con gruppo alcolico, ciclico (prolina)

Catena laterale alifatica: sono tutti apolari tranne la glicina

• Glicina (Gly, G): unico aa per cui il carbonio α non è stereocentro perché R = H ha due sostituenti uguali – amminoacido più piccolo in assoluto che “tappa i buchi”
• Alanina (Ala, A) R = CH₃, ha praticamente il doppio di ingombro della glicina
• Valina (Val, V): catena ramificata
• Leucina (Leu, L)
• Isoleucina (Ile, I)

Catena laterale aromatica: tutti apolari

• Fenilalanina (Phe, F)
• Tirosina (Tyr, Y)
• Triptofano (Trp, W): aa più ingombrante con anelli a 5 e 6 atomi di carbonio

Catena laterale alifatica con gruppi idrossilici:

• Serina (Ser, S)
• Treonina (Thr, T)

Catena laterale con solfuri:

• Cisteina (Cys, C): catena laterale molto piccola = CH₂–SH, analogo della serina ma con S al posto di O, SH può reagire deprotonandosi e unendosi con un’altra cisteina adiacente formando una molecola di cistina tramite legame disolfuro
• Metionina (Met, M): zolfo bloccato nella catena non in grado di reagire

Catena laterale con acidi e derivati:

• Aspartato (Asp, D)
• Glutammato (Glu, E)
• Asparagina (Asn, N): ammide dell’aspartato, con O sostituito da NH₂
• Glutammina (Gln, Q): ammide del glutammato, con O sostituito da NH₂

Catena laterale con basi (carica positivamente):

• Lisina (Lys, K): catena con 4C + NH₂ al termine
• Arginina (Arg, R): 2 atomi di azoto nel mezzo della catena laterale
• Istidina (Hys, H): ha un anello imidazolico (imidazolo = composto eterociclico con due atomi di azoto separati da un CH all'interno di un anello a cinque termini)

Mentre lisina e arginina hanno pK_a alte (si deprotonano a pH alto), l’istidina ha una pK_a bassa, per cui a pH fisiologico non è completamente deprotonata.

I “bimbi speciali”:

• Prolina (Pro, P): la catena laterale si lega con il gruppo amminico e non ha un gran margine di rotazione, viene inserita solo in certe strutture particolari, è poco presente
• Selenocisteina: il ventunesimo amminoacido, scoperto abbastanza di recente (1988…) = cisteina con selenio al posto dello zolfo, poco nota ma per niente inutile – infatti se si fa un knock-out del gene che codifica per il tRNA che lega la selenocisteina si ha una mutazione letale. L’amminoacil-tRNA su cui si lega la selenocisteina ha inoltre lo stesso codone di riconoscimento per il segnale di stop UGA: a volte funge da stop, a volte fa integrare la selenocisteina. Il codone per la sua codifica è solo in 25 geni nell’uomo.

Da un punto di vista nutrizionale, gli amminoacidi sono distinti in non essenziali (glicina, alanina, serina, acido aspartico, asparagina, acido glutammico, glutammina e prolina), per cui esistono vie metaboliche che permettono al nostro organismo di sintetizzarli, ed essenziali (isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina - in assenza di tirosina, treonina, triptofano e valina) da introdurre con la dieta perché non li possiamo sintetizzare. Gli amminoacidi semi-essenziali (tirosina, cisteina, arginina e istidina) sono invece essenziali solo nell’infanzia perché l’organismo non li può sintetizzare in quantità adeguate.

Amminoacidi post-sintetici: amminoacidi modificati dopo la sintesi, comprendono:

• Amminoacidi fosforilati: aa con gruppo OH, sono serina, treonina e tirosina fosforilati fosfoserina, fosfotreonina e fosfotirosina; vengono sfruttati per attivare/disattivare la proteina di cui fanno parte
• Cistina: formata da ponte disolfuro tra due residui di cisteine (vedi sopra)
• Idrossiprolina e idrossilisina
• Acido carbossiglutammico

Esistono anche amminoacidi a livello di struttura che però non sono considerati con gli altri perché non costituiscono proteine: GABA (acido γ-amminobutirrico), ornitina e citrullina (due intermedi del ciclo dell’urea) e β-alanina.

A seconda del pH a cui si trovano, gli amminoacidi hanno una carica diversa, ma cosa succede alla carica laterale? Es. istidina a diversi valori di pH: a pH acido troviamo l’ammina legata al C_α, il gruppo carbossilico e l’ammina dell’anello imidazolico tutti protonati (carica netta 2+); aumentando progressivamente il pH a 2 si ha un mix delle forme con carica 2+ e carica 1+ (si annulla la carica negativa sul carbossile), andando oltre si inizia a dissociare anche il gruppo amminico dell’anello imidazolico, poi con pH intorno a 9 inizia a dissociarsi anche l’ammina legata al C_α, finché l’amminoacido non acquisisce una carica netta negativa. Con l’equazione di Henderson-Hasselbalch si può calcolare la concentrazione delle specie acida e basica e il punto isoelettrico (valore di pH in cui una molecola con più gruppi dissociati ha carica netta nulla) dell’amminoacido, che si calcola identificando i valori di pK_a tra cui si ha la forma di carica netta nulla e poi si fa una media.

Gli amminoacidi hanno anche un ruolo in diagnostica perché in condizioni patologiche se ne trovano eccessi in urine e sangue = amminoaciduria, che caratterizza patologie come fenilchetonuria (accumulo di fenilalanina), cistinuria (accumulo di cistina e amminoacidi basici causa difetto di trasporto), morbo di Hartnup (difetto in assorbimento intestinale e riassorbimento renale di amminoacidi causa deficit di triptofano), sindrome di Fanconi (accumulo di amminoacidi e glucosio con perdita di fosfato).

Legame polipeptidico di condensazione tra gruppo amminico di un aa e gruppo carbossilico dell’aa successivo con eliminazione di una molecola di H₂O. Quello che resta è il residuo amminoacidico, per cui se negli aa possono reagire tutti i gruppi carbossilici e amminici, in una proteina possono farlo solo quelli alle estremità della catena.

Formazione di proteine, classificabili in vario modo in base a:

• Composizione: proteine di soli amminoacidi o con gruppi prostetici di natura diversa es. lipidi (lipoproteine), carboidrati (glicoproteine es. gamma globulina), gruppi fosfato (fosfoproteine es. proteine respiratorie che legano il gruppo eme = emoglobina e mioglobina), coenzimi flavinici (flavoproteine), metalli (metalloproteine es. alcool deidrogenasi che legano zinco e ferritina che lega il ferro nella cellula rendendolo non reattivo VS formazione di radicali liberi)
• Struttura: proteine fibrose (es. collagene, actina, miosina ecc. per sostegno strutturale) o globulari (funzioni più complesse, proteine delle vie metaboliche)
• Funzione: enzimi (tripsina), proteine di trasporto, di riserva (caseina), contrattili (actina e miosina), strutturali (cheratine, collagene), di difesa (anticorpi), regolative (ormoni), fattori di trascrizione e canali ionici.

Proprietà delle proteine:

• Solubilità e precipitabilità: una proteina con molti gruppi carichi è solubile, con gruppi idrofobici no; dipende anche dal pH della soluzione in cui si trovano
• Peso molecolare: indice della dimensione di una proteina perché un residuo pesa circa 110 Dalton
• Carica: le proteine sono polianfoliti (hanno molteplici cariche), la cui carica globale dipende dal pH e dal numero e tipo di gruppi dissociabili e talvolta anche dalla funzione della proteina, es. istoni carichi positivamente per interagire con il DNA, carico negativamente

Livelli strutturali delle proteine:

• Primaria: successione dei residui amminoacidici (residuo = ogni aa della catena) che la compongono, definisce l’individualità di una proteina. La catena polipeptidica è dotata di polarità, con estremità C-terminale (-COOH libero, per convenzione a sinistra) e N-terminale (-NH₂ libero, per convenzione a destra). Legame peptidico di condensazione con caratteristiche particolari = legame C-N con due sostituenti e un doppietto libero, per cui si possono avere forme limite di risonanza con doppietto che si sposta a formare una sorta di doppio legame peptidico parziale. Natura di doppio legame testimoniata anche dalla lunghezza intermedia tra legame singolo e doppio di 1.32 Å. Conseguenze:
  • L'azoto del legame non può essere protonato perché è impegnato nel parziale doppio legame
  • Il legame peptidico è planare e si può considerare lo scheletro della proteina come una successione di piani nello spazio, su ciascuno dei quali giace un legame polipeptidico, che possono ruotare solo attorno al C_α con angolo di rotazione φ rispetto all’azoto e ξ rispetto all’altro carbonio. Queste caratteristiche compaiono nel grafico di Ramachandran che ne visualizza le combinazioni all’interno delle proteine e ne identifica quindi tutte le conformazioni assumibili.
  • Non ci può essere rotazione attorno al legame (NO isomeria conformazionale)
  • Il legame peptidico è soggetto a isomeria cis-trans
• Secondaria: conformazione spaziale delle catene che dipende da legami tra residui tendenzialmente vicini, con formazione di eliche (α o altri tipi meno frequenti) o foglietti β. Questi sono elementi ripetitivi, ma la ripetitività conformazionale della catena non implica la ripetitività delle sequenze di aa.
  • α-eliche: i residui si avvolgono attorno ad un asse, perpendicolare alla catena primaria; passo = tratto dell’elica la cui altezza comporta una rotazione di 360°. La formazione è garantita da legami idrogeno paralleli all’asse dell’elica e perpendicolari alla struttura primaria. Il numero di residui per giro non è un numero intero perché un giro non corrisponde alla minima unità ripetitiva (= modulo). L’elica 3₁₀ è più lassa di quella standard.
  • Foglietto β: struttura più lassa con catena proteica parallela all’asse del foglietto; può essere antiparallelo o parallelo in base alla polarità delle file di aa che lo compongono. Nell’elica lo spazio tra residui è di 0.15 nm, mentre nel foglietto di 0.32 nm, struttura secondaria molto più estesa.

Proteine dotate di sola struttura secondaria con funzione puramente meccanica o di sostegno strutturale, es. cheratine del capello ad α-elica con dimeri coiled-coil che si appaiano in protofilamenti, che si uniscono in protofibrille. Proprietà: insolubilità, resistenza meccanica e inestensibilità. β-cheratine (es. fibroina della seta) con foglietti β con proprietà: insolubilità, resistenza meccanica, inestensibilità (i foglietti sono già fin troppo lassi di loro) e flessibilità; composti da 44.6% di residui di glicina, 29.4% di alanina e 12.2% di serina = amminoacidi più piccoli che possono quindi impaccarsi più stretti.

Collagene: struttura fibrosa resistente alle tensioni costituita da molecole di tropocollagene organizzate in una tripla elica. A seconda di scopi e tessuti ne esistono tipi diversi, codificati da geni su più cromosomi. Costituisce le fibre di collagene di tendini, matrice delle ossa, cartilagini, derma, endoteli, ecc. Tropocollagene costituito da tre catene polipeptidiche ad α-elica di circa 1000 residui ciascuna (tre residui per giro), con PM = 95 kDa, L = 260 nm, d = 1.5 nm e arrotolate insieme con polarità nell’insieme destra: le tre catene sono parallele mentre la singola catena è lievemente sinistra. Residui:

• Gly-X-Y = unità ripetitiva: ogni tre residui uno è glicina per non creare debolezze strutturali (ogni tre residui le catene che si avvolgono su se stesse sono talmente vicine che in quella posizione si possono trovare solo residui di Gly, in quanto aa più piccolo)
• Gly-Pro-Y: quando c’è (30%), la prolina si trova sempre in posizione X, dopo la glicina
• Gly-X-Hyp: quando c’è (30%), la 4-idrossiprolina si trova sempre in posizione Y, due aa dopo Gly