Biochimica

FUNZIONAMENTO.

La maggior parte degli enzimi presenta una notevolissima specificità per la reazione catalizzata e

per i substrati coinvolti. Tale specificità è legata a diversi fattori che caratterizzano l'associazione

tra il substrato e il sito attivo, come la complementarità dal punto di vista strutturale, le cariche

elettriche, la natura idrofila o idrofoba. Gli enzimi mostrano spesso livelli elevatissimi

di stereospecificità, regioselettività e chemoselettività.

Il primo modello a essere stato messo a punto per spiegare la specificità degli enzimi è quello

suggerito da Hermann Emil Fischer nel 1894, secondo il quale l'enzima e il substrato possiedono

incastro

una forma esattamente complementare che ne permette un perfetto. Tale modello è

chiave-serratura

spesso definito come . In ogni caso tale modello esplica bene la specificità degli

enzimi, ma è decisamente meno affidabile nello spiegare la stabilizzazione dello stato di

transizione che l'enzima raggiunge durante il legame con il substrato.

chiave-serratura

Nel 1958 Daniel Koshland propose una modifica del modello : dal momento che gli

enzimi sono strutture relativamente flessibili, egli suggerì che il sito attivo potesse continuamente

modellarsi in base alla presenza o meno del substrato. Come risultato, il substrato non si lega

rigido

semplicemente a un sito attivo , ma genera un rimodellamento del sito stesso, che lo porta a

un legame più stabile in modo da portare correttamente a termine la sua attività catalitica, come

succede ad esempio per la esochinasi e per altri enzimi glicolitici. In alcuni casi, come avviene per

le glicosidasi, anche il substrato può cambiare leggermente la propria forma all'ingresso nel sito

attivo.

Il legame iniziale tra enzima e substrato è necessario anche da un punto di vista energetico.

L'energia del legame deriva non solo da eventuali legami covalenti, ma anche da una fitta rete di

interazioni deboli, ioniche o elettrostatiche. Solo il corretto substrato è in grado di partecipare a

tutte le interazioni previste. Ciò, oltre a spiegare la sorprendente stabilità del legame tra enzima e

substrato, permette di comprendere i meccanismi che conferiscono elevata specificità all'enzima

stesso.

La riduzione dell'energia di attivazione può essere invece spiegata dal fatto che tutte le interazioni

tra enzima e substrato sono possibili solo quando il substrato si trova nello stato di transizione.

forzato

Tale stato è dunque stabilizzato (in un certo senso esso viene ) dal legame tra enzima e

substrato. Il substrato nello stato di transizione può essere considerato un vero e

nuovo nuova

proprio substrato di una reazione, avente un'energia di attivazione inferiore a

originale

quella . La riduzione della ΔG può dunque essere intesa come conseguenza della

‡

nuova

creazione di una sorta di reazione, impossibile senza la presenza dell'enzima corretto.

L'affinità dell'enzima per il substrato è quindi la condizione necessaria per il suo funzionamento;

complesso

ma questo non significa che nel le forze di interazione debbano essere molto elevate:

se il complesso enzima-substrato fosse eccessivamente stabile, per esempio, l'enzima non

tenderebbe a formare i prodotti. Se fosse invece troppo alta l'affinità tra enzima e stato di

transizione (o tra enzima e prodotto) la reazione si bloccherebbe, non permettendo al complesso di

dissociarsi e liberare i prodotti.

MECCANISMI CATALITICI.

I principali meccanismi catalitici sono:

- Catalisi acido-base.

- Catalisi covalente.

- Catalisi da metalli.

La catalisi acida generale è un processo il cui trasferimento di protoni da un acido abbassa

l’energia di attivazione dello stato di transizione di una reazione.

Una reazione di tautomeria cheto-enolica non catalizzata procede lentamente a causa della elevata

energia libera dello stato di transizione.

La donazione di un protone da parte dell’acido all’atomo di ossigeno accelera la reazione.

Una reazione può essere catalizzata anche da basi e la velocità della reazione aumenta in seguito

alla rimozione di un protone da parte della base.

Alcune reazioni possono essere catalizzate da entrambi i processi contemporaneamente. Queste

reazioni sono concertate, cioè avvengono tutte in una volta.

Queste reazioni avvengono perché le catene laterali di alcuni residui amminoacidici Asp, Glu, His,

Cys… presentano valori di pK che rientrano nei valori di pH fisiologici il che consente loro di agire

come catalizzatori acido/base.

La catalisi covalente aumenta la velocità di reazione attraverso la formazione temporanea di un

legame covalente tra catalizzatore e substrato. Questo legame si forma attraverso la presenza di

un gruppo nucleofilo sul catalizzatore un gruppo elettrofilo sul substrato.

Un esempio di catalisi covalente avviene durante la decarbossilazione dell’acetoacetato catalizzata

dalle ammine primarie.

Nella prima fase della reazione l’ammina attacca il gruppo carbonilico dell’acetoacetato per dare

origine alla base di Schiff. L’atomo di azoto protonato agisce come trappola per elettroni allo scopo

di ridurre il carattere ad alta energia dello ione enolato. La formazione e la decomposizione della

base di Schiff sono processi veloci e non limitano la reazione.

La catalisi covalente quindi può essere divisa in 3 fasi:

- Reazione nucleofila tra catalizzatore e substrato con formazione di legame covalente.

- La sottrazione di elettroni dal centro di reazione da parte del catalizzatore che diventa

elettrofilo.

- La liberazione del catalizzatore nel corso di una reazione.

Un aspetto importante della catalisi covalente risiede nel fatto che quanto maggiore è la stabilità

del legame covalente formatosi, tanto minore è la facilità con cui esso tende a rompersi nella fase

conclusiva della reazione.

Un terzo di tutti gli enzimi richiede la presenza di ioni metallici per svolgere attività catalitiche.

Fanno parte di questo gruppo i metalloenzimi, contenenti cofattori metallici legati saldamente.

Questi ioni svolgono funzioni catalitiche e strutturali.

Prendono parte al processo secondo 3 modalità principali.

- Legano i substrati per orientarli correttamente ai fini della reazione.

- Mediano reazioni di ossidazione-riduzione attraverso modificazioni reversibili del loro stato

di ossidazione.

- Stabilizzano o schermano cariche di segno opposto.

In numerose reazioni agiscono come un protone e sono spesso più efficaci. Sono presenti in alte

concentrazioni anche a pH 7.

La carica di ione metallico può rendere le molecole d’acqua più acide rispetto a quanto fa l’acqua

libera e diventano fonte di ioni idrossi.

Un meccanismo tipo di queste reazioni catalizzate è l’azione dell’anidrasi carbonica.

L’anidrasi carbonica contienitene uno ione Zn .

2+

CO + H O H CO + H

+

⇄

2 2 2 3

Questo ione polarizza una molecola d’acqua formando ione idrossi che a sua volta effettua un

attacco nucleofilo alla anidride carbonica convertendola in HCO . Il protone prodotto nella

3-

reazione viene trasferita sulla superfice dell’enzima mediante catalisi basica e il sito dell’enzima

viene quindi rigenerato.

LE SERINA PROTEASI.

Un meccanismo enzimatico utilizzato da un gruppo ampio di enzimi proteolitici chiamati serina

proteasi. Prendono questo nome perché hanno tutti lo stesso processo catalitico che coinvolge un

residuo Ser particolarmente reattivo.

La chimotripsina, tripsina ed elastasi sono enzimi sintetizzati dal pancreas e secreti nel duodeno.

I tre enzimi catalizzano l’idrolisi di legami peptidici (amidici) ma con specificità differenti per le

catene laterali che fiancheggiano il legame peptidico che deve essere tagliato.

La chimotripsina è specifica di un gruppo voluminoso e idrofobico che deve precedere il legame da

scindere. I tre enzimi formano un potente sistema proteolitico che porta avanti il processo della

digestione.

L’identificazione della catena laterale del residuo Ser nel sito della serina proteasi può essere

effettuata usando il reagente diisopropilfosfofluoridrato (DIPF). Questo composto inattiva in modo

irreversibile l’enzima agendo solo sul Ser del

sito attivo senza intaccare gli altri Ser. Tale

specificità rende il composto estremamente

tossico.

La neurotossicità del DIPF è dovuta alla sua

capacità di inattivare l’acetilcolina esterasi, un

enzima che catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina.

L’attività esterasica dell’acetilcolina esterasi

richiede un residuo Ser.

L’acetilcolina è un neurotrasmettitore, cioè

trasmette gli impulsi nervosi attraverso le

sinapsi. L’acetilcolina esterasi degrada

l’acetilcolina in modo che l’impulso elettrico

duri qualche millisecondo. L’inattivazione dell’acetilcolina

esterasi fa sì che l’impulso duri più dei millisecondi

richiesti.

Composti simili sono: Parathion e Malathion che son

tossici per gli insetti e il sarin che sono inattivati

dall’enzima paraossonasi.

La chimotripsina, tripsina ed elastasi presentano considerevoli omologie: le strutture primarie di

questi enzimi sono identiche per il 40%. Questi enzimi possiedono un residuo Ser attivo ed uno His

cataliticamente essenziale.

Queste strutture proteiche sono ripiegate in 2 domini che presentano ampie regioni di foglietti β

antiparalleli che formano strutture a barile con pochi elementi elicoidali.

I siti His 57 e Ser 195 sono cataliticamente essenziali perché legano il substrato. Il residuo Asp 102

è immerso in una tasca inaccessibile al solvente. Questi 3 residui invarianti danno origine ad una

serie di legami idrogeno e sono chiamati triade catalitica.

Le serina proteasi legano preferenzialmente lo stato di transizione.

La distorsione conformazionale che si osserva con la generazione dell’intermedio di reazione

determina lo spostamento dell’ossigeno carbonilico ora anionico del legame da rompere all’interno

del sito attivo in modo da occupare una posizione precedentemente vuota definita buco

dell’ossianione.

In questa posizione l’ossigeno forma 2 legami idrogeno con l’enzima che non potevano formarsi

quando il gruppo carbonilico era nella posizione consueta.

La distorsione tetraedrica consente la formazione di un legame idrogeno tra l’enzima e il gruppo

NH dello scheletro appartenente al residuo precedente il legame peptidico da rompere.

Questo legame preferenziale dello stato di

transizione rispetto al complesso enzima-

substrato tradizionale è responsabile di gran

parte della stab