Biochimica

Il metabolismo

Il metabolismo è un'attività altamente regolata a cui cooperano molti sistemi multienzimatici per adempiere quattro funzioni specifiche:

• Convertire le molecole nutrienti nelle molecole costituenti la cellula
• Ottenere energia chimica da utilizzare per compiere un lavoro
• Polimerizzare i monomeri in polimeri
• Sintetizzare le molecole necessarie per funzioni specializzate

Autotrofi ed eterotrofi

In base alla fonte di atomi di carbonio, possiamo distinguere gli organismi in autotrofi ed eterotrofi. La maggior parte delle cellule ha enzimi in grado di catalizzare sia la sintesi che la degradazione di specifiche molecole, ma le due vie metaboliche devono essere altamente regolate per impedire cicli futili. Molte vie anaboliche e cataboliche hanno in comune gli stessi substrati o gli stessi prodotti e possono avere molte reazioni comuni, ma almeno una delle tappe deve essere catalizzata da enzimi differenti nelle due vie. Le vie anaboliche e cataboliche avvengono in compartimenti cellulari diversi. Le vie metaboliche possono essere regolate dalla concentrazione di substrato o da regolatori allosterici.

Negli organismi pluricellulari, le vie metaboliche di tessuti diversi sono coordinate da messaggeri extracellulari. L'ATP è la moneta energetica che connette l'anabolismo con il catabolismo. I principali nutrienti metabolici sono il glucosio e gli acidi grassi. In circostanze normali, il glucosio è l'unico nutriente che possa essere utilizzato dal cervello. È anche utilizzato preferenzialmente dal muscolo durante le fasi iniziali dell'attività fisica.

Risorse di glucosio

La quantità di glucosio presente nei liquidi extracellulari è di circa 20g, 80kcal. I carboidrati sono immagazzinati sotto forma di glicogeno. Circa 75g sono presenti nel fegato e 400g nel muscolo (circa 1900kcal complessivamente). Il glicogeno epatico può essere la principale fonte di glucosio per non più di 16 ore.

Grassi e aminoacidi

Gli esteri del glicerolo e gli acidi grassi a catena lunga sono i composti ideali per immagazzinare i nutrienti. L'apporto calorico dei grassi è 9 kcal/g. L'organismo possiede una capacità pressoché illimitata di accumulare grassi. Un uomo di 70kg ha circa 15 kg di grasso (trigliceridi) circa 130000 kcal. Gli aminoacidi possono essere utilizzati come combustibile metabolico durante il digiuno o in seguito a malattie o traumi.

Glicolisi

A digiuno, l'utilizzo di glucosio in un individuo di 70 kg è approssimativamente di 2mg/kg/min (200gr nelle 24h). La concentrazione plasmatica di glucosio riflette l'equilibrio tra l'assorbimento dal tratto gastrointestinale, l'utilizzo a livello dei tessuti (glicolisi, via dei fosfopentosi, ciclo degli acidi tricarbossilici, sintesi di glicogeno) e la produzione endogena (glicogenolisi e gluconeogenesi).

L'insulina è uno dei principali ormoni responsabili del controllo dei livelli plasmatici di glucosio. È un ormone anabolico che diminuisce la concentrazione plasmatica di glucosio promuovendone l'entrata nei tessuti, il metabolismo intracellulare del glucosio e la sintesi di glicogeno. Il glucagone (insieme a molti altri ormoni catabolici: catecolamine, cortisolo e ormoni della crescita) contrasta l'azione dell'insulina stimolando sia il rilascio di glucosio dalle riserve che la sua sintesi de novo. Il glucosio è l'unica fonte di energia per cervello, eritrociti, midollare renale e spermatozoi.

I tre stadi del catabolismo

• Stadio I: Idrolisi delle molecole complesse nelle loro unità costitutive.
• Stadio II: Conversione delle unità costitutive in acetil CoA.
• Stadio III: Ossidazione dell'acetil CoA; fosforilazione ossidativa.

Le reazioni della glicolisi

Tutti gli intermedi della via glicolitica sono fosforilati perché:

• Sono intrappolati nella cellula;
• L'energia derivata dall'idrolisi dell'ATP è parzialmente conservata nei legami fosfo-estere;
• Il legame tra gruppo fosforico e sito attivo produce un'energia di legame che contribuisce ad abbassare l'energia di attivazione.

La conversione del glucosio in piruvato avviene in due stadi. Le prime cinque reazioni della glicolisi corrispondono a una fase di investimento energetico. Le reazioni successive della glicolisi costituiscono una fase di generazione dell'energia; si formano al netto due molecole di ATP mediante la fosforilazione a livello del substrato. Si formano anche due molecole di NADH; mentre se il prodotto finale è il lattato, il NADH viene convertito in NAD⁺.

La fosforilazione del glucosio è catalizzata dall'esoquinasi. L'esoquinasi è una transferasi che catalizza la fosforilazione di esosi come il glucosio e il fruttosio, ed è una reazione di attivazione mediante fosforilazione. Il gruppo fosforico terminale viene trasferito ad un accettore nucleofilo. L'esoquinasi è presente in tutte le cellule di tutti gli organismi. Gli epatociti contengono una forma di esoquinasi chiamata esoquinasi IV o glucochinasi, che differisce dalle altre forme di esoquinasi per le proprietà cinetiche e regolatorie (isoenzimi). La glucochinasi ha una Km per il glucosio molto maggiore dell'esoquinasi e una Vmax molto alta.

Isomerizzazione del glucosio 6-fosfato a fruttosio 6-fosfato: La reazione è rapidamente reversibile e non è la tappa limitante la velocità della glicolisi, né una reazione soggetta a regolazione (fosfoesosio isomerasi).

La conversione del fruttosio 6-fosfato in fruttosio 1,6-bifosfato: La reazione irreversibile di fosforilazione catalizzata dalla fosfofruttochinasi1, è il punto di controllo più importante della glicolisi, nonché la tappa che regola la velocità della glicolisi. L'aldolasi A scinde il fruttosio 1,6-bifosfato in due triosi: gliceraldeide 3-fosfato e diidrossiacetone fosfato. Il trioso fosfato isomerasi catalizza l'interconversione del diidrossacetone fosfato in gliceraldeide 3-fosfato per essere ulteriormente metabolizzato nella via glicolitica.

La fase di recupero dell'energia: La conversione della gliceraldeide 3-fosfato in piruvato. Sintesi dell'1-3bifosfoglicerato. L'ossidazione del gruppo aldeidico della gliceraldeide 3-fosfato in un gruppo carbossilico è accoppiata all'unione di un P al gruppo carbossilico appena generato (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi). Sintesi del 3-fosfoglicerato: è un esempio di fosforilazione a livello del substrato come la reazione che produce ATP e acido piruvico. L'energia derivante dall'idrolisi del legame fosfo-anidridico dell'1,3 BPG viene utilizzata per sintetizzare ATP.

Conversione della gliceraldeide 3-fosfato in 1-3bifosfoglicerato: L'ossidazione del gruppo aldeidico della gliceraldeide 3-fosfato in un gruppo carbossilico è accoppiata all'unione di un Pi al gruppo carbossilico appena generato. La presenza di tale fosfato ad alta energia permetterà la sintesi dell'ATP nella reazione successiva. Sintesi del 3-fosfoglicerato: è un esempio di fosforilazione a livello del substrato.

Lo spostamento del gruppo fosfato dal carbonio 3 al carbonio 2 del fosfoglicerato ad opera della fosfoglicerato mutasi è liberamente reversibile. La deidratazione del 2-fosfoglicerato da parte dell'enolasi ridistribuisce l'energia all'interno della molecola di 2-fosfoglicerato determinando la formazione del fosfoenolpiruvato (PEP), il quale contiene un fosfato enolico ad alta energia.

Idrolisi del fosfoenolpiruvato (PEP): La conversione del PEP in piruvato è catalizzata dalla piruvato chinasi ed è un altro esempio di fosforilazione a livello del substrato; è seguita dalla tautomerizzazione spontanea del prodotto, il piruvato. La tautomerizzazione non è possibile nel fosfoenol piruvato e quindi il prodotto dell'idrolisi è più stabile del reagente. Si ha anche una stabilizzazione per risonanza del P. La produzione di P ad alta energia è utilizzata per sintetizzare ATP (è accoppiata direttamente all'ossidazione di un substrato).

Gluconeogenesi

Degradazione di polisaccaridi (glicogeno epatico, amido o glicogeno dalla dieta) → glucosio. La gluconeogenesi utilizza il piruvato e altri composti a tre o quattro atomi di carbonio (lattato, piruvato, glicerolo...) per formare glucosio. Avviene principalmente nel fegato, per via inversa alla glicolisi, eccetto tre reazioni:

• Reazione 1: Glucosio 6-fosfato → glucosio (glucosio 6-fosfatasi)
• Reazione 3: Fruttosio 1,6 bifosfato → fruttosio 6-fosfato (FBPasi-1)
• Reazione 10: Piruvato → ossalacetato (piruvato carbossilasi) → PEP (PEP carbossichinasi)

Trasporto di ossalacetato

Il trasporto di ossalacetato dal mitocondrio al citosol è accompagnato da un aumento della concentrazione di NADH citosolico, che sarà utilizzato nelle tappe successive della gluconeogenesi.

Regolazione glicolisi

Il trasporto del glucosio

Il glucosio non può diffondere direttamente nelle cellule. Esso entra nelle cellule mediante due meccanismi di trasporto:

• Diffusione facilitata Na⁺ indipendente
• Co-trasporto Na⁺-monosaccaride

Diffusione facilitata Na⁺ indipendente

• Avviene secondo il gradiente di concentrazione, per cui non richiede energia!
• È un processo mediato da una famiglia di proteine comprendente almeno 14 trasportatori (GLUT-1...GLUT-14)
• L'espressione è tessuto specifica (Glut-1 G. Rossi ed encefalo, Glut-2 fegato, rene...)
• Questi trasportatori si trovano nella membrana cellulare
• Il glucosio extracellulare si lega al trasportatore, esso modifica la propria conformazione e così trasporta il glucosio attraverso la membrana.

Co-trasporto Na⁺ monosaccaride

• Richiede energia!
• Trasporta il glucosio contro il suo gradiente di concentrazione
• È mediato da un trasportatore
• Il trasporto del glucosio è accoppiato al gradiente di concentrazione del Na⁺ (contemporaneamente trasportato dentro la cellula)
• Questo trasporto avviene nelle cellule epiteliali dell'intestino, dei tubuli renali e del plesso corioideo

Le reazioni della glicolisi

Fosforilazione del glucosio: intrappola lo zucchero nel citosol (gli zuccheri fosforilati non attraversano le membrane cellulari); è irreversibile; è catalizzata dall'enzima esoquinasi (uno dei tre enzimi regolatori della glicolisi, insieme a fosfofruttochinasi e piruvato chinasi). Nel fegato e nel pancreas è catalizzata dalla glucochinasi.

L'esoquinasi: catalizza la fosforilazione del glucosio nella maggior parte dei tessuti. Ha un'ampia specificità per il substrato (fosforila anche altri esosi); è inibita dal prodotto della reazione (glucosio 6-fosfato); ha una Km bassa per il glucosio (e quindi un'affinità alta); ha una Vmax bassa, per cui non possono essere fosforilati più zuccheri di quanti la cellula non ne possa utilizzare.

La glucochinasi: è il principale enzima responsabile della fosforilazione del glucosio nel fegato e nelle cellule delle isole pancreatiche. Nel fegato facilita la fosforilazione del glucosio durante l'iperglicemia. Differisce dalla esoquinasi perché:

• Ha una K_m >> esoquinasi (cioè richiede una [glucosio] più elevata per raggiungere 1/2 Vmax) perciò funziona soltanto quando la [glucosio] negli epatociti è alta (p.es. dopo un pasto ricco di carboidrati)
• Ha una Vmax elevata (permette al fegato di eliminare con efficienza dal sangue portale il glucosio, anche dopo un pasto ricco di carboidrati, minimizzando l'iperglicemia durante il periodo dell'assorbimento)

Regolazione della glucochinasi

Insulina: Negli epatociti, incrementa l'attività della glucochinasi.

Fruttosio 6-fosfato e glucosio: Nel nucleo c'è una proteina regolatrice della glucochinasi:

1. In presenza di fruttosio 6-fosfato (che si trova in equilibrio con il glucosio 6-fosfato), l'enzima si trasferisce nel nucleo, si lega alla proteina regolatrice e diventa inattivo.
2. Un aumento di glucosio attiva l'enzima poiché provoca il distacco della glucochinasi dalla proteina regolatrice. L'enzima migra nel citosol e fosforila il glucosio a glucosio 6-fosfato.

L'isomerizzazione del glucosio 6-fosfato in fruttosio 6-fosfato: è catalizzata dalla fosfoglucosio-isomerasi. È reversibile.

Fosforilazione del fruttosio 6-fosfato a fruttosio 1,6 bisfosfato: è irreversibile; è catalizzata dalla fosfofruttochinasi-1 (PFK-1). È il punto di controllo più importante della glicolisi ed è la tappa che limita la velocità della via.

La PFK-1 è inibita da: alta concentrazione di ATP e citrato.

La PFK-1 è attivata da: alta concentrazione di AMP, ADP, e fruttosio 2,6-bisfosfato.

Regolazione della fosfofruttochinasi-1 (PFK-1)

• La PFK-1 è inibita in modo allosterico da: alta concentrazione di [ATP] (indicano abbondanza di composti ad alta energia) e [citrato].
• La PFK-1 è attivata in modo allosterico da: alta concentrazione di [AMP] (indicano un impoverimento della riserva energetica della cellula) e fruttosio 2,6-bisfosfato.

Il più potente attivatore della PFK-1 è il fruttosio 2,6-bisfosfato: esso è sintetizzato in tutti i tessuti; la sua sintesi è stimolata dall'insulina e inibita dal glucagone; funge da segnale intracellulare, indicando un'abbondanza di glucosio. La sua azione contemporanea sulla glicolisi (stimola la fosfofruttochinasi-1) e sulla gluconeogenesi (inibisce la fruttosio 1,6 bisfosfatasi) fa sì che le due vie non siano attive nello stesso momento, evitando un ciclo futile.

Durante lo stato alimentato nel fegato, aumenta la concentrazione di fruttosio 2,6 bisfosfato con incremento della glicolisi.

Durante il digiuno nel fegato, si ha una diminuzione della concentrazione di fruttosio 2,6 bisfosfato con conseguente aumento della gluconeogenesi.

La concentrazione del regolatore allosterico fruttosio 2,6-bifosfato è mantenuta dalle velocità relative della sua formazione e demolizione. Questo composto si forma per fosforilazione del fruttosio-6-fosfato. Catalizzata dalla FOSFOFRUTTOCHINASI-2 (PFK-2) e viene demolito dalla FRUTTOSIO 2,6-BIFOSFATASI -2 (FBPasi-2). La PFK-2 e la FBPasi-2 sono due attività enzimatiche separate presenti sulla stessa proteina bifunzionale.

Regolazione della piruvato chinasi (a livello epatico)

Nel fegato, la piruvato chinasi è attivata da un aumento di fruttosio 1,6-bisfosfato (il prodotto della reazione della fosfofruttochinasi-1). Questa regolazione collega l'attività delle due chinasi: se aumenta l'attività della fosfofruttochinasi (PFK-1), aumenta il fruttosio 1,6-bisfosfato e aumenta la piruvato chinasi.

La fosforilazione della piruvato chinasi (ad opera di una proteina chinasi cAMP dipendente) determina la sua inattivazione:

1. Quando la concentrazione di glucosio è bassa: aumenta la concentrazione di glucagone, aumenta la concentrazione di cAMP intracellulare, fosforilazione della piruvato chinasi e diminuisce la piruvato chinasi.
2. Il fosfoenolpiruvato (PEP) non può continuare la via glicolitica e sarà utilizzato nella via gluconeogenica.

La defosforilazione della piruvato chinasi (ad opera di una fosfatasi) riattiva l'enzima.

Regolazione della glicolisi

La regolazione della glicolisi è affidata a tre passaggi di importanza strategica:

• Fosforilazione del glucosio (esoquinasi e glucochinasi)
• La formazione di fruttosio 1,6-bisfosfato (PFK-1)
• La formazione di piruvato (piruvato chinasi)

Nei tessuti, la glicolisi è un processo molto inibito, cioè funziona ad una velocità molto bassa rispetto alla Vmax. In tal modo, le cellule possono modulare velocemente questo processo, senza ricorrere alla produzione di nuove proteine ed enzimi. La regolazione della glicolisi è affidata ad enzimi regolatori che, in condizioni basali, sono molto inibiti. Il controllo di questi enzimi avviene ad opera di effettori allosterici (piccole molecole che si legano ad un sito diverso dal sito attivo) o per mezzo di modificazioni covalenti (fosforilazione di una proteina).

Regolazione ormonale della glicolisi

La sintesi dei tre enzimi chiave della glicolisi (glucochinasi, fosfofruttochinasi e piruvato chinasi) è stimolata dall'insulina e inibita dal glucagone. Un pasto ricco di carboidrati o la somministrazione di insulina stimola la sintesi dei tre enzimi, favorendo la conversione del glucosio in piruvato. Nel digiuno e nel diabete, la concentrazione di glucagone è elevata e la sintesi dei tre enzimi è ridotta.

Destini alternativi del piruvato

1. Decarbossilazione ossidativa: via importante nei tessuti con elevata capacità ossidativa (cuore); catalizzata dalla piruvato deidrogenasi; converte irreversibilmente il piruvato in acetil CoA (utilizzato nel Ciclo di Krebs o per la sintesi degli acidi grassi).
2. Carbossilazione ad ossalacetato: catalizzata dalla piruvato carbossilasi; rigenera gli intermedi del ciclo di Krebs e fornisce substrati alla gluconeogenesi.
3. Riduzione del piruvato ad etanolo (fermentazione alcolica): avviene nei lieviti e in alcuni batteri.

Catabolismo acidi grassi

Triacilgliceroli

Gli acidi grassi sono tra le principali molecole combustibili. Essi sono immagazzinati in forma di esteri del glicerolo, i triacilgliceroli (grassi neutri o trigliceridi). Quando gli acidi grassi vengono mobilizzati da queste forme di riserva, in seguito a specifici segnali ormonali, sono ossidati per soddisfare le richieste energetiche della cellula. Il principale sito di accumulo dei triacilgliceroli è il citoplasma degli adipociti, cellule specializzate nella sintesi e accumulo delle riserve lipidiche. Riserve di triacilgliceroli si trovano anche nei tessuti muscolari.

Essendo conservati in forma anidra e ridotta, i triacilgliceroli rappresentano la più importante riserva di energia metabolica a lungo termine.

Assorbimento dei lipidi della dieta

La maggior parte dei lipidi della dieta è costituita da triacilgliceroli che devono essere degradati ad acidi grassi per poter essere assorbiti a livello intestinale. Le lipasi sono enzimi intestinali secreti dal pancreas che, grazie all'azione dei sali biliari, degradano i triacilgliceroli consentendone l'assorbimento.