Biochimica

ES

E +S E+S all e zi a solo ua do

avviene in presenza di un inibitore competitivo questo è in grado di legarsi

uesto li e o. L i i ito e o petiti o o upa il sito atti o dell e zi a. “i fo a u o plesso EI

i atti o, o p o ede ella eazio e. l i i ito e sta sott ae do l e zi a li e o i soluzio e, fa

di i ui e la o e t azio e dell enzima. La formazione di questo complesso EI inattivo può essere

contrastato solo se si aggiungono grandissime quantità di substrato. Per effetto della

o petizio e o e tazio i satu a ti di su st ato s alza o l i i ito e dal sito atti o dell e zi a e

portano nuovamente alla formazione del complesso ES. solo in questo modo si può consentire la

disso iazio e dell i i ito e dall e zi a. Dal pu to di ista a os opi o ua do si aggiu ge u

inibitore di questo tipo possono essere osservate alcune caratteristiche che vengono

rappresentate nel grafico di Michaelis-Menden. se si

considerano concentrazioni elevate di substrato le curve si

equivalgono, raggiungono entrambe asintoticamente lo

stesso valore di Vmax. Questo perché il substrato è in

g ado di s alza e l inibitore dal sito attivo in quantità

saturabili. La due curve differiscono nella loro parte iniziale.

Possiedono km differenti. La curva in assenza di inibitore ha

un certo valore di km, mentre allo stesso valore di ½ di

Vmax si trova un punto, nella curva che rappresenta la

p ese za dell i i ito e o petiti o, o ispo de u a k

maggiore. Questo valore di Km viene definita km apparente. Questo perché in presenza

dell i i ito e o petiti o au e ta appa e te e te il alo e di k . L au e to di k sugge is e

u a i o e affi ità pe il su st ato. I ealtà l affi ità dell e zi a pe il su strato, per questo si

hia a appa e te. Questo su ede pe h l i i ito e sta sott ae do l e zi a li e o. Lo sott ae pe

fo a e il o plesso EI. L e uili io he po ta alla formazione del complesso ES attivo viene

spostato verso la dissociazione E +S. Essendo la km il rapporto tra Km-1 e K1, in presenza

dell i i ito e o petiti o au e ta la k-1 e quindi aumenta di conseguenza anche la km

appa e te e te . L e uili io to a i dietro, prevale

la reazione di dissociazione e quindi graficamente si

nota un aumento di km. In realtà non diminuisce

l affi ità dell e zi a pe il su st ato a di i uis e la

concentrazione di enzima libero. Se si va a vedere il

grafico dei doppi reciproci e quindi si riportano i dati in

retta si possono ricavare esattamente i valori di Km e

V a . Le due ette he si osse a o i te sa o o l asse

delly nello stesso punto perché la Vmax non cambierà.

Le due rette hanno però una pendenza diversa e infatti 58

o i te se a e l asse delle i due pu ti di e si. La etta

van che rappresenta la reazione con

l i i ito e competitivo possiede un valore di -1/km a valori meno negativi rispetto alla retta

rappresentate la reazione senza inibitore competitivo.

normalmente gli inibitori competitivi competono del substrato del sito attivo perché sono

analoghi, dal punto di vista strutturale, al substrato. Per esempio il

succinato, un acido di carbossilico, è il substrato naturale di un enzima

Quest e zi a, el o so del i lo di

chiamato succinato deidrogenasi.

krebs, trasforma il succinato in fumarato. Un inibitore competitivo del

succinato è il malonato. È sempre un acido dicarbossilico, però possiede

un ch2 in meno. È molto simile dal punto di vista strutturale e quindi riesce ad ingannare il sito di

lega e dell e zi a. Moltissi i fa a i so o i i ito i o petiti i, o e i sulfa idi i o a he al u i

antitumorali. Moltissimi farmaci vengono usati come inibitori competitivi. Un enzima molto

l al ol deid oge asi he t asfo a l al ool i a etaldeide he

importante che lavora nel fegato è

può esse e eta olizzata ad a ido a ossili o e ui di o isulta pa ti ola e te tossi a. L al ol

deid oge asi eta olizza di e si al oli, t a ui a he il eta olo. L i tossi azio e da etanolo

non è dovuta tanto al metanolo quanto dal suo metabolita: la formaldeide. La formaldeide non

può esse e ulte io e te eta olizzata e l i tossi azio e da eta olo può esse e u ata t a ite

la somministrazione di metanolo. Questo perché i due alcoli competono per il sito attivo dello

stesso e zi a. L eta olo usa l al oldeid oge asi, p op io o e il eta olo. L eta olo i ele ate

o e tazio i ies e a s alza e il eta olo dal sito atti o dell al ol deid oge asi e ita do la

formazione di formaldeide.

L inibizione competitiva viene usata nelle vie metaboliche per regolare la velocità di queste. Se si

vuole accelerare o rallentare una via metabolica si può agire sui livelli di alcuni metaboliti che

funzionano da inibitori competitivi dper alcuni enzimi della via metabolica stessa. Questo succede

sia in reazioni reversibili sia in reazioni irreversibili. Per esempio le esochinasi trasformano il

glucosio in glucosio-6-fosfato. La reazione è di tipo irreversibile. Il glucosio 6 fosfato può

comportarsi da inibitore competitivo del glucosio nei confronti delle esochinasi. Quando il glucosio

6 fosfato viene prodotto in quantità abbondanti può andare ad occupare il sito attivo delle

esochinasi e impedire al substrato naturale( glucosio) di entrare nel sito attivo. Il glucosio 6 fosfato

a ui di a lo a e l atti ità dell e zi a stesso he lo ha p odotto. Così fa e do la eazio e

rallenta. Si parla di inibizione da prodotto ed è un tipo di inibizione competitiva. Lo stesso accade

pe l e zi a glu osio-6-fosfato Quest e zi a a a toglie e u g uppo fosfato al glu osio

fosfatasi.

fosfato pe p odu e il glu osio. Quest ulti o può fu zio a e da i i ito e o petiti o ei

lega dosi al suo sito atti o e i i e do l atti ità dell e zi a he

confronti del glucosio-6-fosfato lo

ha prodotto. so o i g ado di lega si all e zi a solo dopo he l e zi a stesso si

Gli inibitori incompetitivi

legato al substrato. Si lega solo al complesso ES. Una volta che S ha occupato il suo sito di legame

allo a a he l i i ito e può lega si al suo sito di lega e spe ifi o, posto vicino al sito di legame per

il su st ato. Questo lo a l e zi a i u o plesso E“I he o pleta e te i atti o, o può

andare avanti nella reazione. Questo comporta il cambiamento dei parametri cinetici della

reazione. In primis cambia la Vmax. La Vmax può essere espressa anche come concentrazione 59

totale dell e zi a. “e si sott ae dalla eazio e il o plesso E“ hia a e te di i uis a a he la

Vmax. In presenza di un inibitore competitivo il complesso ES viene sottratto. Si osserva anche una

diminuzione della Km. Questo succede perché se si

i uo e il o plesso E“ l e uili io si sposta e so il

prodotto,aumenta la formazione del complesso ES.

aumenta quindi anche la K1 e quindi la Km diminuisce. In

ealtà o au e ta l affi ità dell e zi a pe il su st ato,

au e ta la elo ità o ui l e zi a si lega al su st ato

ma

perché si sta sottraendo il complesso ES e si sta spostando

l e uili io e so la eazio e di asso iazio e piuttosto he

della reazione di dissociazione. Questi cambiamenti

possono essere rappresentati sul grafico di michaelis-

mennen. In presenza di un inibitore in competitivo diminuisce la Vmax e ad ½ di Vmax si trova un

punto della curva che corrisponde ad una coordinata x pari ad un valore di km apparentemente

più basso rispetto al valore di km condotto in assenza di inibitore. Questa km è apparente perché

la km non diminuisce effettivamente ma solo in modo apparente. Questa situazione può essere

osse ata a he el g afi o dei doppi e ip o i. Dopo a e aggiu to l i i ito e i o petiti o e

misurati i vari punti sperimentali si ottiene

una retta che ha la stessa tendenza della

retta che rappresenta la reazione in assenza

di inibitore. Sono rette parallele. La retta

rappresentante la reazione con aggiunta di

l asse delle

inibitore in competitivo interseca

y a valori maggiori rispetto alla retta parallela

o asse za di i i ito e. L asse delle ie e

intersecato dalle due rette a valori diversi. La

etta o l i i ito e p ese ta alo i di -1/km

più negativi, mentre quella in assenza di

inibitore possiede tale valore più vicino allo 0.

L e tità della a iazio e della k e della

Vmax sono tali da mantenere inalterata la

pendenza delle rette. a o a lega si all e zi a sia ua do l e zi a li e o sia

Gli inibitori non competitivi puri

ua do l enzima è complessato con il substrato. Questi inibitori possiedono un sito di legame

spe ifi o he o o elato o la p ese za del su st ato. “e si lega all e zi a li e o fo a u

complesso EI inattivo, se si lega al complesso ES forma un complesso ESI inattivo. In realtà questi

due o plessi i atti i posso o t asfo a si l u o ell alt o o la disso iazio e del su st ato.

Questo comporta una diminuzione della Vmax perché anche in questo caso si sta rimuovendo il

complesso ES nella miscela di reazione e di conseguenza diminuisce la Vmax perché questa è pari

alla K-1/K1. Non si osservano macroscopicamente variazioni della km. Questa non diminuisce e

non aumenta. La km rimane invariata perché in realtà le variazioni che avvengono si annullano 60

reciprocamente in quanto quando si forma il complesso EI non si fa altro che aumentare la

dissociazione del complesso ES, per lo stesso

motivo degli inibitori competitivi. Se si

sott ae l e zi a li e o il o plesso po tato

a dissociarsi e questo dovrebbe portare ad

un aumento della km. Allo stesso tempo

pe ò ua do l i i ito e lega il o plesso E“ e

lo i uo e dal ezzo di eazio e l e uili io

è spostato verso la formazione di un nuovo

o plesso E“. Da u a pa te si ha l au e to

alt a

della velocità di dissociazione e dall

l au e to della elo ità di fo azio e.

“i o e l e tità dell i te azio e dell i i ito e

è la stessa le due variazioni che sono

contrarie in realtà si annullano mantenendo la km stabile.

Funzionano da inibitroi non competitivi puri diverse sostanze tossiche come metalli pesanti,

mercurio, piombo che vanno a reagire con

gruppi Sh provenienti da gruppi di cisteina

esposti sulla supe fi ie dell e zi a e osì

fa e do fo a o dei o plessi o l e zi a he

lo rendono inattivo. Possono andare ad

te fe i e o l atti ità e zi ati a di olti

i

enzimi. I valori sperimentali delle varie reazioni

possono essere chiaramente riportate nel grafico

dei doppi reciproci. In presenza di inibitore non

o petiti o pu o l u i o effetto he si ha u a

diminuzione di Vmax (1/Vmax è maggiore)

e t e la k uguale e ui di e t a e le ette i te se a o l asse delle ello stesso pu to.

so o i i ito i he si lega o all e zi a o lega i olto fo ti, spesso

Gli inibitori irreversibili EI i s i di ile. La ole ola dell e zi a ie e lo ata

covalenti , formando un complesso

defi iti a e te e