Biochimica

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Caratteristiche degli esseri viventi

Gli esseri viventi presentano diverse caratteristiche:

• Complessità chimica e organizzativa con specializzazione funzionale. Anche le singole molecole hanno specializzazioni funzionali quando agiscono da effettrici. Il nostro organismo è composto per il 90-99% in peso da C, O, N e H; il restante 1-10% comprende Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Na⁺, P, K⁺, S^-, Cl^- che vanno a formare i fluidi intracellulare ed extracellulare. I quattro principali atomi che compongono gli esseri viventi si trovano tutti presenti in amminoacidi e proteine ma anche negli acidi nucleici e in alcuni lipidi e zuccheri. Quando consideriamo una proteina, la sua struttura lineare non è predittiva della sua funzione in quanto a determinare la struttura definitiva entrano in gioco i legami deboli:
• Idrogeno → definiscono la struttura delle biomolecole
• Interazioni idrofobiche → permettono la formazione di una struttura che presenta una zona centrale idrofobica e una zona esterna idrofilica
• Ionici
• Interazioni di van der Waals

Questi legami sono fondamentali in quanto permettono una parziale modificazione della conformazione in modo da poter permettere lo svolgimento di funzione diverse.

• Capacità di estrarre e trasformare energia → è comune a tutti i regni viventi e specifica per ogni regno. La fonte primaria di energia è il sole. L'ATP è la molecola chiave di energia ed è nella sua natura chimica la capacità di svolgere questo ruolo. Un'altra molecola in grado di svolgere questo ruolo è il coenzima NADPH: tutte le vie che possono portare a produrre energia per la cellula presentano una certa quantità di energia immagazzinata come NADPH che rappresenta la fonte di attivazione di tutti i processi biosintetici. La composizione di una cellula rappresenta la somma di tutto il processo metabolico e biochimico all'interno della cellula, è la “fotografia” di uno stato stazionario dinamico lontano dall'equilibrio: non è una condizione di reversibilità ma si trova verso una condizione di forte riduzione dell'entropia. Questo può avvenire solo traendo energia dall'ambiente.
• Capacità di autoriprodursi → è una proprietà fondamentale degli organismi viventi che sono in grado di partire da una struttura che agisca da stampo per le altre e che contenga le informazioni per riprodursi, questo è possibile grazie alla complementarietà chimica delle strutture.
• Capacità di cambiare nel tempo attraverso l'evoluzione → un errore introdotto durante la replicazione può portare a un vantaggio, un guadagno di funzione si può infatti tradurre in un vantaggio evolutivo.

Proteine

Le proteine sono fondamentali molecole biologiche che svolgono diverse funzioni:

• Catalisi
• Trasporto
• Deposito
• Difesa
• Movimento
• Supporto strutturale
• Controllo, regolazione

Sono costituite da 20 tipi di amminoacidi uniti da un legame peptidico che ne determina la struttura primaria; la funzione di una proteina può essere intuita dalla composizione degli amminoacidi. Gli amminoacidi sono tutti caratterizzati da 3pK (pK1, pK2 e pKa del gruppo R), un pI e dall'indice idropatico ovvero un valore che definisce l'idrofobicità degli amminoacidi: quelli con elevato indice idropatico sono fortemente idrofobici quindi andranno a costituire una porzione interna alla proteina. Gli amminoacidi si trovano più o meno tutti nelle diverse proteine facenti parte di una cellula ma non si trovano tutti in una singola proteina.

Struttura delle proteine

• Struttura primaria → corrisponde alla sequenza lineare amminoacidica unita mediante legami peptidici.
• Struttura secondaria → si riferisce a segmenti peptidici e ne definisce l'organizzazione spaziale della catena principale, senza tenere conto delle catene laterali. Le principali strutture secondarie sono:
• α-eliche → sono strutture formate dall'interazione tra il gruppo carbonile (C=O) e il gruppo amminico (NH₂) del legame peptidico attraverso legami idrogeno. Lo scheletro carbonioso si avvolge ad elica lasciando sporgere i gruppi R esternamente; ogni giro dell'elica è costituito da 3,6 residui amminoacidici. Il ripiegamento in α-eliche dipende dall'ingombro dei gruppi R e dalle repulsioni di carica.
• Foglietti-β → sono costituiti dalla disposizione affiancata di diverse conformazioni β, zone definite dalla disposizione dello scheletro carbonioso a zig-zag secondo specifici angoli in cui gruppi R degli amminoacidi adiacenti sporgono dalla struttura; le catene di un foglietto β possono essere parallele o antiparallele.
• Ripiegamenti-β → sono strutture che collegano tratti successivi in foglietti-β in modo tale che il gruppo carbonilico del primo residuo formi un legame idrogeno con l'idrogeno legato all'azoto del quarto residuo. Residui di Gly sono destabilizzanti di questa struttura perché sono troppo piccoli e quindi presentano troppi gradi di libertà, così come Pro che è un amminoacido ciclico.
• Struttura terziaria → è quella struttura che dà la tridimensionalità alla molecola e si forma grazie ad interazioni deboli fra i gruppi R e a ponti disolfuro tra due residui di Cys. Le proteine vengono suddivise in fibrose o globulari in base alla conformazione della struttura terziaria.
• Struttura quaternaria → si forma per quelle proteine costituite da più catene associate tra loro in complessi tridimensionali.

Proteine fibrose

Sono formate da catene polipeptidiche che formano fasci di foglietti e presentano una struttura secondaria che definisce la funzione stessa della proteina e una struttura terziaria semplice. Sono tutte proteine strutturali che conferiscono resistenza, protezione e sono coinvolte nel movimento; presentano inoltre uno sviluppo prevalentemente in una dimensione e hanno una scarsa capacità di sciogliersi in acqua. Le proteine fibrose hanno un elevato grado di ripetitività degli aa e un'elevata % di aa idrofobici nella catena (fino al 45% nell'elastina).

Le principali proteine fibrose sono:

• α-cheratina
• Fibrillina
• Collagene
• Elastina

α-cheratina

Fa parte della famiglia dei filamenti intermedi ma si trova anche in capelli e unghie o nel corno di rinoceronte: può formare strutture di diversa rigidità a seconda del numero di ponti disolfuro. È costituita da una lunga α-elica; alcune coppie di queste α-eliche si avvolgono fra loro ad elica e vanno a formare una struttura quaternaria. È il prodotto del superavvolgimento di 2 proteine a struttura III che si avvolgono grazie alla presenza di aa compatibili per ingombro sterico. Questa elica forma un protofilamento che a sua volta forma un protofibrilla costituita sempre da una prevalenza di α-eliche che determinano anche la funzione finale della proteina. Grazie a un'elevata % di aa idrofobici presenta un impaccamento delle catene con esclusione di acqua. Nel punto di intersezione tra le due α-eliche gli aa corrispondenti non possono essere ingombranti.

Fibroina

È costituita da un'alternanza di aa: Gly-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly.. che presentano un diverso ingombro sterico ma vanno a formare foglietti-β in modo tale che i due aa con un uguale ingombro si affaccino l'uno sull'altro. La struttura complessiva è stabilizzata da numerosi legami idrogeno tra i gruppi peptidici e da interazioni di van der Waals tra i foglietti adiacenti. È una proteina poco flessibile poiché presenta una struttura già quasi al massimo dell'estensione della catena I.

Collagene

È la proteina più abbondante nella maggior parte degli animali e può arrivare fino a ⅓ della massa proteica. È formata da una tripla elica superavvolta in cui le eliche presentano una struttura diversa dalla classica α-elica. A livello della catena amminoacidica ha una struttura del tipo (Gly-x-y), la glicina quindi costituisce circa ⅓ degli amminoacidi e si trova a livello dei punti di intersezione fra le tre catene proprio perché è poco ingombrante. Possono essere presenti anche amminoacidi modificati, in particolare Lys e Pro: la modificazione avviene dopo che questi sono stati inseriti nella catena peptidica ed è fondamentale per identificare le diverse forme di collagene. La formazione di una molecola di collagene avviene seguendo diversi step:

• Traduzione
• Idrossilazione di Lys e Pro → viene introdotto un gruppo -OH, viene quindi ossidata la molecola a discapito di una riduzione dell'acido ascorbico
• Glicosilazione
• Formazione della tripla elica e ripiegamento delle porzioni globulari che forniscono una condizione di solubilità necessaria a rimanere nel citoplasma durante l'assemblamento
• Secrezione
• Rimozione delle porzioni globulari
• Deamminazione, ossidazione dei residui di Lys e formazione di legami crociati, dal cui numero dipende la struttura del collagene. Diverse molecole di collagene si associano infatti in modo sfalsato per garantire una maggiore resistenza alla trazione.

Proteine globulari

Le proteine globulari non presentano elementi di struttura secondaria prevalenti ma sono formate da diverse strutture secondarie e supersecondarie (motivi, ripiegamenti o domini) e la loro struttura è ripiegata poi in tre dimensioni; comprendono tutte le proteine non fibrose e sono solubili in acqua poiché si organizzano in modo da localizzare le catene idrofobiche all'interno. Le strutture sono stabilizzate da una serie di legami idrogeno ed interazioni ioniche. L'avvolgimento delle proteine è anche responsabile di una maggiore diversità strutturale che permette una γ di funzioni più vasta. Le strutture secondarie o supersecondarie possono avere delle loro funzioni specifiche e se presenti in due proteine diverse ne identificano funzioni analoghe indipendentemente dalla funzione a sé stante della proteina. Queste strutture sono:

• Motivi (o ripiegamenti) → avvolgimenti polipeptidici caratteristici formati da due o più elementi di struttura secondaria e dagli elementi di connessione tra di essi; esempi sono il barile β o l'ansa β-α-β. I motivi vengono utilizzati per la classificazione strutturale delle proteine che si dividono in:
  • Tutto α
  • Tutto β
  • α/β → α-eliche e foglietti-β alternati
  • α+β → α-eliche e foglietti-β ben distanziati
• Domini → sono parti di catene polipeptidiche di per sé stabili che possono esistere anche come entità separate e presentano una specificità funzionale; due proteine diverse che presentano lo stesso dominio hanno quindi analogie nella funzione.

Le proteine possono essere raggruppate in:

• Famiglie → proteine che hanno somiglianza nella sequenza, nella struttura e nella funzione;
• Superfamiglie → proteine che hanno sequenze diverse ma analogie nella struttura e nella funzione.

Nelle proteine globulari le catene amminoacidiche sono distribuite in base alla polarità e la stratificazione delle diverse regioni della proteina è in funzione della polarità stessa: le porzioni apolari si trovano all'interno della proteina mentre quelle polari all'esterno. La sequenza degli amminoacidi nella struttura primaria permette l'intuizione della struttura terziaria che avrà la proteina. La stratificazione permette un'organizzazione su più livelli diversi della proteina, mentre la compattazione permette l'esclusione di ambiente acquoso e l'identificazione di rapporti volumetrici funzionali al ruolo della proteina. Una proteina di membrana deve invece avere una organizzazione opposta nello spazio: le regioni idrofobiche si posizionano all'esterno, quelle idrofiliche all'interno e permettono la formazione di un canale. In questo tipo di proteine sono spesso identificabili siti di legame con molecole di natura non proteica, detti gruppi prostetici, fondamentali per l'attività della proteina stessa: tra la molecola proteica e quella non proteica esiste una complementarietà dinamica stabilizzata dai legami idrogeno che vengono a formarsi. Nella maggior parte delle proteine la struttura è mantenuta da legami deboli (es. mioglobina), alcune proteine di piccole dimensioni però possono essere stabilizzate dalla formazione di legami covalenti tra la componente proteica e il gruppo prostetico (ad esempio il citocromo c). Questi legami covalenti possono crearsi anche all'interno della proteina stessa, ad esempio ponti disolfuro.

Struttura quaternaria

Solo una struttura quaternaria può permettere il comportamento allosterico, di cooperatività, in quanto in questa struttura è possibile avere un aggregato di proteine che svolgono la stessa funzione e che lavorano assemblate in modo tale che il lavoro di una condizioni quello delle altre. L'azione risultante da una proteina costituita da quattro subunità è diversa da quella che potrebbero fare quattro proteine uguali insieme. L'emoglobina ad esempio lavora in questo modo: l'ingresso di una molecola di O₂ su una delle 4 strutture si ripercuote sulle altre strutture rendendole più attive; il risultato dunque non è la somma di quattro attività ma un potenziamento dell'attività totale. Inoltre il vantaggio che dà la struttura quaternaria nell'azione cooperativa è maggiore dello svantaggio che ha la cellula nel dover sintetizzare una grossa proteina. Un altro vantaggio è legato al fatto di avere delle attività coordinate con una logica di compartimentazione dello spazio operativo: un processo di trasformazione che implica l'azione di più enzimi diversi necessita dell'utilizzo di più enzimi diversi e organizzati tra loro, una struttura quaternaria invece rappresenta un sistema compartimentato nello spazio e offre minori possibilità di sviare da questo percorso con una maggiore probabilità di una corretta trasformazione.

Denaturazione e ripiegamento delle proteine

Un agente denaturante è un agente che si occupa di rompere i legami deboli presenti all'interno della struttura terziaria di una proteina distruggendola, ma in modo tale che la proteina possa ricostituirli. La denaturazione delle proteine avviene generalmente mediante calore o agenti denaturanti; in seguito all'avvenuta denaturazione gli agenti possono essere rimossi o la soluzione può essere raffreddata in modo da permettere la rinaturazione della proteina che riacquista la sua struttura terziaria e la sua funzione. Questo indica che l'informazione necessaria per il ripiegamento della proteina è insita nella molecola stessa. Esempi di agenti denaturanti sono urea (rompe i legami H) e mercaptoetanolo (rompe i ponti disolfuro).

Paradosso di Levinthal

Ipotizzando che ciascun residuo amminoacidico che costituisce una proteina possa assumere 10¹⁰⁰ differenti conformazioni, un peptide lungo 100aa potrebbe assumere in vitro 10⁷⁷ conformazioni diverse, ognuna delle quali deve essere valutata per trovare la più stabile. La valutazione di una singola conformazione richiede 10^-13 sec, quindi la cellula impiegherebbe 10⁷⁷ anni per trovare la struttura proteica più stabile. Quello che avviene in realtà durante il ripiegamento delle proteine è una selezione cumulativa: ogni qualvolta che si crea una conformazione con un minimo di energia relativa questa viene bloccata, in questo modo vengono bloccati dei gradi di libertà. Il ripiegamento in un sistema cellulare avviene nell'ordine di secondi; la nucleazione, ovvero l'identificazione e l'avvolgimento di strutture secondarie che servono per condurre il processo, avviene nell'ordine dei msec. Una volta avvenuta la formazione di strutture secondarie, che costituiscono il nucleo del prodotto finale, il ripiegamento va avanti tramite un riarrangiamento e un consolidamento guidato dalle disolfuro isomerasi e dalle chaperonine; questo meccanismo fa diminuire il tempo di ripiegamento all'interno della cellula rispetto all'ambiente in vitro. Dal punto di vista entropico questo processo è fortemente svantaggiato, il vantaggio però si ha dal punto di vista entalpico: tutti i legami che si formano sono infatti esotermici e la somma di questi fattori dà quindi un ΔG comunque negativo (ΔG= ΔH – TΔS).

Le disolfuro isomerasi può agire in due modi:

• Rompendo due punti disolfuro già esistenti ma instabili e creando conformazioni alternative più stabili e vantaggiose dal punto di vista energetico;
• Catalizza l'ossidazione di una proteina che presenta dei gruppi SH liberi creando un ponte disolfuro all'interno della proteina; l'ossidazione avviene con una riduzione dell'enzima stesso.

Gli chaperoni molecolari invece interagiscono con i polipeptidi ripiegati parzialmente o in modo improprio inducendone un riarrangiamento con consumo di ATP. Le due principali famiglie di chaperoni sono:

• Chaperonine → complessi proteici necessari per il ripiegamento di proteine che non si organizzano spontaneamente; portano quindi la proteina a una condizione di maggiore stabilità
• Proteine della famiglia Hsp70 → si legano a regioni idrofobiche impedendo aggregazioni improprie oppure impediscono il ripiegamento di proteine che devono rimanere lineari fino all'uscita dalla membrana.

Gli chaperoni sono composti da una serie di anelli costituiti da più subunità che formano delle camere molecolari all'interno delle quali si lega la proteina mediante interazioni idrofobiche.