Appunti di biochimica applicata

Principi di Cromatografia

B ARs = 2 ⋅ (non da sapere)w + wA BPiù questo valore è elevato, più risoluzione è maggiore. Mano a mano che aumenta valore dicoe ciente di risoluzione, separazione sarà migliore, e i 2 picchi saranno risolti a livello della lineadi base.

L'area totale sottesa al picco è proporzionale alla concentrazione (o alla quantità) del composto.

E cienza piatti teoricidi una colonna => si quanti ca tramite numero di (N), che è entitàastratta.N si calcola considerando la larghezza del picco, in quanto più stretti sono i picchi, più è elevato ilcoe ciente di risoluzione, più la bontà di separazione è migliore, più e ciente è la colonna.

Piatto teorico => più piccola zona adiacente alla colonna in cui soluto raggiunge equilibrio tra fasemobile e fase stazionaria.Più sezioni ci sono, quindi più elevato è il numero dei piatti teorici.

più la colonna è e ciente, quindi più il coe ciente di risoluzione è maggiore. Più basso è il numero di piatti teorici e più basso è il numero del coe ciente di risoluzione, meno e ciente è la colonna.

Esempio: Picchi parzialmente sovrapposti —> Rs è basso, e N è basso, per cui 1 colonna ha bassa e cienza. Picchi non sovrapposti —> Rs è maggiore, N è maggiore, e quindi colonna 2 ha e cienza maggiore.

Più la base dei picchi è stretta, più risoluzione è maggiore, più colonna è e ciente.

Più il numero dei piatti teorici è elevato, più il coe ciente di separazione è elevato, più la colonna è e ciente e la bontà di separazione è maggiore.

Basi sfruttate per separare componenti di miscela sfruttare proprietà chimico siche. Bisogna di sostanze, come dimensioni, forma, carica, grado di idrofobicità.

solubilità e funzione biologica. A seconda di proprietà da sfruttare faccio cromatografia diversa:

• adsorbimento - cromatografia per sfruttare solubilità;
• ripartizione - cromatografia di sfruttare solubilità;
• gel filtrazione - cromatografia per sfruttare dimensioni e forma;
• scambio ionico - cromatografia a sfruttare carica (la faremo in laboratorio);
• affinità - cromatografia di sfruttare interazione biologica;
• interazione idrofobica - cromatografia per sfruttare grado di idrofobicità delle sostanze.

Cromatografia di adsorbimento eluizione in gradiente, usa cioè vengono usate diverse fasi mobili. Adsorbimento accumulare e trattenere su superficie - proprietà tipica dei solidi; proprietà di molecole di gas o soluti con i quali vengono a contatto. Interazioni elettrostatiche tra le molecole adsorbite e la superficie di adsorbente si instaurano solo (legami deboli).

Come legami a idrogeno, forze di London, interazioni dipolo-dipolo, ecc. —> molecole polari o polarizzabili possono essere soggette a fenomeno di adsorbimento. Quanto più grande è la polarità del soluto, tanto maggiore è la forza di adsorbimento, cioè adsorbirà più facilmente.

Fase stazionaria: solido insolubile nel solvente=> su cui i soluti vengono adsorbiti. Deve essere usato, non deve reagire con le sostanze da separare, e le sue particelle devono essere le più piccole possibili. I più usati sono: allumina, gel di silice.

Fase mobile: liquida o gas=> può essere (cromatografia solido-liquida) o (cromatografia solido-gas).

La matrice presenta la fase stazionaria, ad esempio gruppi OH di silice.

Procedura sperimentale:

1. Impacco colonna e l'equilibrio con solvente di natura apolare (es: metanolo, etanolo, acetonitrile).
2. Prendo colonna...

chiusa.Quando faccio partire cromatogra a apro valvola —> fase mobile uisce ed entra in colonnacromatogra ca.Valvola aperta —> acqua entra da contenitore 1 nel contenitore 2, che è sottoposto ad agitazione.Se all’inizio ho fase mobile costituita solo da solvente apolare, mano a mano cambiacomposizione di fase mobile, perché mano a mano diminuisce concentrazione del solventeapolare, e aumenterà la concentrazione dell’acqua —> avrò soluzione che a mano a mano hapercentuale di solvente sempre più bassa, e percentuale di acqua sempre più alta.Aumenta polarità della fase mobile —> molecole polari che si sono legate da fase stazionariainiziano a interagire con l’acqua, e quindi vengono eluite.Ordine di eluizione: molecole apolari —> molecole polari. Da polarità minore a polaritàmaggiore.Metanolo è solvente organico polare, ma rispetto all’acqua è

più apolare, per cui lo consideriamo polare.

Matrice serve a immobilizzare la fase stazionaria.

21fi fi fi fi fl fi fi fi giovedì 18 marzo 2021

Cromatogra a

Cromatogra a di ripartizione

Eluizione in gradiente => non si usa sempre stessa fase mobile, ma questa viene cambiata.

Proprietà sfruttata: solubilità.

Fase stazionaria liquido non è solida, ma dotato di proprietà solventi nei confronti delle molecole che vogliamo separare.

Liquido distribuito su supporto inerte (cellulosa / gel di silice). Fase stazionaria ad esempio può essere acqua —> posso avere colonna piena di matrice inerte, su cui è presente anche fase stazionaria liquida come l’acqua.

Fase mobile liquido o gas.

può essere Molecole nella miscela hanno diverse caratteristiche.

Se uso come fase stazionaria l’acqua (molecola polare per eccellenza), solo molecole polari si sciolgono in solvente polare, quindi si legano a fase stazionaria.

In miscela complessa

gradiente.cromatogrammaNel che si ricava i primi corrispondono a molecole non polari, quelli successivicorrispondono a sostanze con grado di polarità sempre maggiore.Viene quindi sfruttata polarità delle molecole, quindi loro interazione dal punto di vista dellasolubilità tra fase ssa e mobile. 22fi fi fi fi fi fi fi fi fiCromatogra a per gel ltrazioneeluizione isocratica,Unico tipo di cromatogra a dove è cioè si usa stesso tampone per tutto iltempo.Molecole separate in base a forma e peso molecolare fasivengono —> bisogna usarestazionarie con proprietà di setaccio molecolare. materialiFasi stazionarie costituite daporosi, che solitamente sono polimeri che permettono di ottenere fase stazionaria costituita dasferette con una sorta di reticolo tridimensionale poroso.proprietà di un gel.Fase stazionaria ha tipiche soprattutto per proteine o peptidi con strutturaCromatogra a per gel ltrazione usatatridimensionale

globulare.Proteine quando passano attraverso colonna guidate da fase mobile possono entrare o no nei pori delle sferette a seconda delle loro dimensioni: se le proteine sono grandi non riescono a entrare, ma passano tra una sfera e l'altra; più una proteina è piccola, più entra nei pori. Proteina grande Percorso che seguono le proteine nella fase ssa è diverso, perché se è eluita prima, la piccola proteina passa in tutte le sferette. È una sorta di setaccio molecolare che funziona al contrario: le proteine grandi non entrano nei pori delle sferette di fase ssa, e quindi vengono eluite per prime; più il percorso è tortuoso,