Appunti di biochimica applicata

Biochimica applicata

Giovedì 4 marzo 2021

Puri ficazione primaria delle proteine

Proteine => macromolecole costituite da molti amminoacidi (unità elementari). Amminoacidi solo 20. In natura c’è un numero elevatissimo di fino a 300, ma di questi entrano a far parte della costituzione di proteine, perché codificati da DNA. Le proteine sono polimeri lineari di amminoacidi, non ramificazioni. Ogni proteina ha la sua struttura tridimensionale, che deve essere assolutamente mantenuta, perché se viene persa questa struttura, la proteina non è più in grado di svolgere la sua funzione —> correlazione tra struttura e forma di proteine.

Struttura degli amminoacidi

Ogni amminoacido, a parte prolina (che ha catena laterale che si chiude), possiede un C centrale, a cui sono legati 4 gruppi differenti:

• Gruppo amminico NH₃⁺ con caratteristiche basiche;
• Gruppo acido carbossilico COO^-;
• Atomo di H;
• Catena laterale, diversa per ogni amminoacido.

Il C centrale è un centro chirale e —> otticamente attivo. Gli amminoacidi esistono in forma D (gruppo amminico su dx) e forma L (gruppo amminico su sx). Gli amminoacidi presenti in proteine sono solo quelli in forma L.

Punto isoelettrico

Il punto isoelettrico di un amminoacido è il valore di pH al quale la carica netta di un amminoacido è uguale a 0 (cariche + e - si equivalgono). A valori di pH inferiori al punto isoelettrico, l'amminoacido ha carica positiva perché NH₃⁺ accetta protoni. A valori di pH superiori, l'amminoacido ha carica negativa perché il gruppo COOH tende a dissociarsi (quello legato a C e a quelli laterali). Le proteine sono polimeri di amminoacidi —> hanno un punto isoelettrico che dipende dalle catene laterali di amminoacidi, in quanto ci sono amminoacidi acidi e basici. Ogni proteina, dipendentemente dagli amminoacidi di cui è costituita, ha il suo punto isoelettrico.

Legame peptidico tra amminoacidi

Gli amminoacidi nelle proteine sono tenuti insieme da legami peptidici, che si formano tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico di quello successivo (non è l’opposto). Questo avviene durante la sintesi proteica tramite l'eliminazione di una molecola di acqua. Il legame peptidico ha determinate caratteristiche che consentono alla proteina di organizzarsi in serie di livelli strutturali. È a metà tra un legame covalente semplice e un legame covalente doppio. Può esistere in 2 forme di risonanza, perché se considero gli elettroni di doppio legame C=O, possono essere spostati su O, conferendogli carica negativa. Gli elettroni presenti su N possono andare tra C e N, formando il doppio legame C=N. È un legame planare rigido ma permette la rotazione tra C e C precedente e tra N e C che segue. Grazie a questa caratteristica, le proteine assumono ripiegamenti nello spazio, cioè strutture secondarie.

Classificazione degli amminoacidi

Le proprietà di un amminoacido dipendono dalla sua catena laterale. Esistono amminoacidi apolari, amminoacidi polari (OH e SH hanno caratteristiche simili poiché O e S sono nello stesso gruppo in tavola periodica), amminoacidi polari acidi, e amminoacidi polari basici.

Struttura delle proteine

La struttura e la funzione delle proteine sono strettamente correlate. Le proteine globulari sono la stragrande maggioranza delle proteine nella cellula. Le proteine hanno 4 strutture principali:

• Struttura primaria => sequenza di amminoacidi della catena polipeptidica, legati tra di loro dal legame peptidico. Stabilisce la struttura tridimensionale della proteina.
• Struttura secondaria => descrive ogni ripiegamento regolare periodico della catena polipeptidica determinato dal legame peptidico. Alfa elica e foglietto, stabilizzate da legami a H tra C=O e NH.
• Struttura terziaria => descrive un ulteriore ripiegamento della proteina; permette il raggiungimento di una struttura tridimensionale. Se si perde questa struttura, la proteina perde la sua funzione biologica. È stabilizzata da legami a H, forze di Van Der Waals, ponti disolfuro, interazioni elettrostatiche.
• Struttura quaternaria => associazione tra strutture multimeriche specifiche. I singoli monomeri interagiscono attraverso interazioni deboli (le stesse che stabilizzano la struttura terziaria) che si instaurano tra i loro amminoacidi superficiali.

Puri ficazione delle proteine

La purificazione è il processo di isolare una proteina da un determinato contesto (fonte), come cellule, tessuto animale/vegetale. Bisogna ottenere un estratto grezzo, cioè rompere cellule/tessuto, in modo che il contenuto interno venga riversato all’esterno. Dopo aver ottenuto l'estratto grezzo, si applica la purificazione primaria con tecniche di precipitazione frazionata, un tipo di purificazione grossolana che consente di eliminare ciò che non interessa, riducendo il volume. Alla fine si ottiene un certo quantitativo di proteina, che poi può essere studiata grazie a cromatografia, elettroforesi, e poi studi strutturali e funzionali.

Procedure preliminari per la purificazione delle proteine

Scelgo la fonte, poi pianifico la strategia di purificazione, che dipende da:

• Tipo di proteine da studiare;
• Dove si trova nella cellula (se in citoplasma, membrana, extracellulare);
• Studi che si vuole condurre (strutturale/funzionale);
• Quantità di proteina che si vuole ottenere.

La proteina deve comunque rimanere integra —> attenzione a pH, temperatura a cui si lavora, ecc.

Puri ficazione delle proteine cellulari

Innanzitutto, bisogna rompere le cellule (lisi cellulare) per far fuoriuscire il contenuto cellulare di interesse. La lisi cellulare deve avvenire in un mezzo che preservi la struttura nativa delle proteine, cioè in una soluzione tampone. Lieviti e batteri vengono fatti crescere in un terreno di coltura —> per la purificazione di proteine devo togliere il terreno di coltura e poi aggiungere il tampone. I tessuti animali e vegetali, invece, vengono messi subito in tampone. Le soluzioni tampone devono avere una composizione che preservi il più possibile la struttura nativa delle proteine:

• pH simile a quello fisiologico;
• Elevata solubilità;
• Non assorbire nelle regioni dello spettro UV-visibile, perché altrimenti potrebbero interferire con le successive misure spettroscopiche;
• Non essere tossico per le cellule;
• Spesso il tampone deve contenere inibitori di proteasi, perché all’interno delle cellule ci sono proteasi che tagliano legami peptidici, quindi distruggono proteine —> le proteasi vanno inibite.

I tamponi più usati sono: carbonato, fosfato, borato, ammine, aminoacidi e tamponi commerciali. I metodi usati per ottenere l’estratto grezzo si differenziano in funzione della localizzazione subcellulare della proteina da purificare e della fonte biologica.

Metodi per ottenere l'estratto grezzo

Metodi non meccanici

Shock osmotico => per cellule fragili (es: eritrociti); pongo cellule in tampone ipertonico (=concentrazione di soluti in tampone è maggiore rispetto al contenuto in cellula), ad alta osmolarità —> eritrociti raggrinziscono, perché l'acqua da eritrociti esce per andare nel tampone, in modo da diluirlo. Gli eritrociti raggrinziti vengono poi messi in soluzione ipotonica (concentrazione di soluti nel tampone è inferiore rispetto a nelle cellule), per cui acqua richiamata all’interno —> eritrociti si gonfiano fino a scoppiare —> contenuto di eritrociti riversati in soluzione. Come soluzione ipotonica si può usare anche acqua distillata.

Congelamento e scongelamento => può essere usata per coltura di fibroblasti ad esempio. Usata per cellule fragili. La coltura di cellule è posta in freezer a -80 °C —> cristalli di ghiaccio che si formano in cellula bucano la membrana plasmatica —> quando scongelo, il contenuto all’interno di cellula viene buttato fuori. Il ciclo è ripetuto 2-3 volte.

Enzimi litici => in alcuni casi le cellule hanno una parete cellulare, per cui le cellule vengono messe a contatto con enzimi litici, che tagliano la parete cellulare, e poi si interviene con metodi non meccanici (shock osmotico, congelamento e scongelamento, ecc.).

Metodi meccanici

Si sviluppa sempre calore, che può denaturare proteine in modo irreversibile. Bisogna quindi sempre raffreddare il materiale di partenza e lavorare mettendo i contenitori in ghiaccio oppure in una stanza mantenuta a 4 °C (stanze fredde).

Omogeneizzatore a mescolamento => simili a frullatori domestici, con recipiente statico e lame rotanti. Si possono usare solo per tessuti animali e vegetali, non per microrganismi. Il Waring blender è molto usato; ha un recipiente in acciaio inossidabile che resta freddo se preriscaldato. L'omogeneizzazione deve essere effettuata in tempi brevi, perché altrimenti si sviluppa calore; l’omogeneizzato tra un passaggio e l’altro deve essere raffreddato nel ghiaccio.

Omogeneizzatore a pestello => tubo in vetro smerigliato e pistone; cellule all’interno, pistone mosso su e giù in modo da sforzare le cellule nel tubo per romperle, in modo da riversare all’esterno il contenuto. Può essere manuale oppure motorizzato. Usato per sospensioni di cellule animali e vegetali, ma non per microrganismi.

Estrusione liquida => usata per batteri e lieviti. Macchinario con camera di acciaio inox dove vengono messe cellule. C’è un orifizio collegato all’esterno con una valvola a spillo. Le cellule sono forzate a uscire attraverso questa valvola a pressioni molto elevate. I cambiamenti di pressione distruggono le cellule. Quello che esce dalla valvola è estratto grezzo.

Estrusione solida => usata per batteri e lieviti. Simile a quella liquida, ma uso una pasta di cellule congelata —> inserisco cellule nella camera con orifizio, c’è sempre una valvola a spillo, ma ci sono anche cristalli di ghiaccio, che rompono le membrane cellulari.

Sonicazione => usata per batteri e lieviti. Le cellule sono messe in provetta in cui inserisco una sonda metallica. Onde ultrasoniche di urto vanno contro le cellule e rompono le membrane cellulari.

Puri ficazione primaria con tecniche di precipitazione frazionata

A questo punto ho ottenuto l'estratto grezzo —> devo fare la purificazione primaria, che consiste in una serie di tecniche di precipitazione frazionata. Faccio precipitare anche la proteina. Ciò che rimane in soluzione viene eliminato. Questo processo permette anche di ridurre i volumi quando ho litri di materiale. Per la precipitazione frazionata devo sfruttare proprietà chimico-fisiche delle proteine. Per far precipitare proteine vario la solubilità in soluzione. Una proteina globulare ha residui polari all’esterno e quelli apolari all’interno. Metodi usati per la precipitazione frazionata includono:

• Via punto isoelettrico;
• Aggiunta di sali;
• Variazione della temperatura;
• Aggiunta di solventi organici.

La precipitazione frazionata consente di ridurre i volumi e scremare un po’. Può essere reversibile o irreversibile. Il supernatante è ciò che rimane sopra a precipitazione e va eliminato.

Venerdì 5 marzo 2021

Puri ficazione primaria delle proteine

La precipitazione frazionata di proteine può essere fatta in diversi modi, cioè si possono sfruttare le diverse proprietà fisico-chimiche di macromolecole presenti nel campione. Ci permette di ridurre i volumi e operare il primo taglio di proteine che non ci interessano, perché i metodi di precipitazione frazionata hanno in comune la capacità di far variare la solubilità delle proteine in soluzione —> alcune non sono più solubili e precipitano, altre rimangono solubili. Le proprietà fisico-chimiche sfruttate includono:

• Punto isoelettrico;
• Presenza di sali;
• Temperatura, facendo attenzione a non denaturare la proteina;
• Solventi organici.

Si modificano le proprietà della soluzione in cui c’è la proteina di interesse variando il pH, oppure aggiungendo sali, oppure variando la temperatura, in modo da far precipitare la proteina. Poi si effettua la centrifugazione —> precipitato e surnatante, che viene eliminato. Nel precipitato ci sono anche altre proteine che non ci interessano, ma almeno abbiamo iniziato a ridurre i volumi, inoltre tagliamo le proteine che non ci interessano. È una sorta di prima scrematura, che ci porterà poi ad avere proteina pura. La precipitazione può essere reversibile oppure irreversibile. Ci sono dei casi, soprattutto quando si usa la temperatura o solventi organici, in cui la precipitazione è irreversibile. Bisogna quindi stare attenti, perché se la proteina precipita in modo irreversibile, la proteina non si può più recuperare, per cui il processo di purificazione non è più valido.

Precipitazione al punto isoelettrico (pI)

Questa tecnica è reversibile. Bisogna conoscere il punto isoelettrico della proteina. Il punto isoelettrico è il valore di pH a cui le cariche positive e negative delle proteine si equivalgono —> carica netta della proteina è 0. Al di sotto di pI, le proteine hanno carica positiva, mentre sopra pI le proteine presentano carica negativa. Le cariche sono date da catene laterali di amminoacidi. Al pI, le proteine si trovano in condizioni migliori per formare aggregati tra di loro e precipitare. La solubilità di una proteina varia al variare di pH: si raggiunge la minima solubilità al pI della proteina, perché se la proteina ha lo stesso numero di cariche positive e negative, si ha attrazione elettrostatica —> le proteine interagiscono tra di loro formando aggregati che precipitano. La solubilità della proteina è minima. Altre proteine rimangono in soluzione perché a quel valore di pH che corrisponde al pI della proteina di interesse, le altre proteine non sono al loro pI, per cui si respingono. A questo valore di pH, comunque, ci sono altre proteine che si trovano al loro pI, per cui precipitano insieme alla proteina di interesse. Sul fondo della provetta c’è la nostra proteina e altre proteine con lo stesso punto isoelettrico, ma abbiamo scartato altre proteine che non sono al loro pI. A una provetta con precipitato si aggiunge un tampone che ha un valore di pH diverso dal pI della proteina di interesse, in modo che questa torni in soluzione.

Precipitazione con i sali

Aggiungo direttamente a un estratto grezzo una certa quantità di sale. I sali più usati: NaCl, (NH₄)₂SO₄. La solubilità di proteine all’aumentare della concentrazione di sale aumenta fino a un punto massimo, poi dopo quel punto massimo diminuisce sempre di più, fino a diventare nulla. Il punto massimo divide il grafico in 2 parti:

• Salting in => concentrazione di sale tale per cui la proteina rimane in soluzione;
• Salting out => concentrazione di sale in cui la proteina precipita.

NaCl è un composto ionico —> se lo aggiungo a un estratto grezzo, che comunque contiene acqua, perché la sorgente è stata messa in tampone, NaCl si dissocia in Na⁺ e Cl^-, che quando si trovano in soluzione acquosa sono circondati da molecole di acqua (acqua di solvatazione). Ioni Na⁺ e Cl^- cominceranno a interagire con le proteine. La proteina ha una struttura tridimensionale, che ha gruppi polari carichi verso l’esterno, e quelli non polari verso l’interno —> ioni Na⁺ e Cl^- interagiscono con gruppi carichi esterni alla proteina:

• Na⁺ —> COO^-;
• Cl^- —> catene con carica positiva (lisina, arginina, istidina).

Se i gruppi della proteina legano ioni Na⁺ e Cl^-, la proteina è circondata da un numero elevato di ioni, che a loro volta sono circondati da acqua —> aumenta l’acqua di solvatazione intorno alla proteina —> la solubilità della proteina aumenta (salting in). La proteina poi diminuisce la sua solubilità, perché mano a mano che aggiungo NaCl, questo ha bisogno di sempre più acqua per sciogliersi —> sottrae molecole di acqua alle proteine —> le proteine rimangono senz’acqua, per cui espongono zone idrofobiche all’esterno, interagiscono tramite queste zone che solitamente sono all’interno, e precipitano (salting out). La concentrazione di sale che causa salting out è diversa da proteina a proteina e dipende dalla struttura primaria:

• Proteine molto idrofobiche precipitano a bassa concentrazione di sale;
• Proteine meno idrofobiche con elevata % di amminoacidi polari o carichi precipitano ad alta concentrazione di sale.

Se prendo un estratto grezzo e lo sottopongo a centrifugazione, si forma un precipitato che contiene proteina di interesse e altre.