Biochimica applicata - Appunti

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ

Abbiamo detto che esistono due tecniche: centrifugazione in gradiente zonale e centrifugazione in gradiente isopicnica.

Centrifugazione in gradiente zonale abbiamo un gradiente che riempie tutto il volume della provetta e che ha sempre

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una densità che è inferiore alle particelle che vogliamo separare. Questa è una tecnica di velocità la strategia di mettere

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un gradiente aumenta la risoluzione perché la velocità dipende dalla differenza di densità tra particelle e mezzo. Però se

ci dimentichiamo la centrifuga accesa, anche se vengono richiesti tempi più lunghi, la particella più leggera si sedimenterà

insieme a quella pesante perché non viene frenata dalla densità del gradiente in quanto il gradiente è sempre meno denso

rispetto alle particelle. Questa tecnica è strettamente dipendente dal tempo le centrifugazioni in gradiente richiede

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tempi molto più lunghi rispetto alla centrifugazione differenziale si possono lasciare in azione anche per tutta la notte.

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Dipende dal coefficiente di sedimentazione che a sua volta dipenderà dalle dimensioni, dalla forma e dalla densità di ciò

che vogliamo far precipitare. Quando abbiamo una centrifugazione in gradiente abbiamo una centrifugazione con limitata

capacità in quanto la provetta è riempita tutta dal gradiente che abbiamo formato. Tutto il campione parte dall’alto e

quindi non abbiamo il problema che avevamo invece nella centrifugazione differenziale di avere dei pellet non puri. Qui

partendo dall’alto della provetta avremo un piccolo volume rispetto al volume totale che però inizierà a sedimentare in

accordo con il coefficiente di sedimentazione. Grazie al gradiente che rallenterà le particelle più piccole e leggere e farà

invece arrivar in fondo alla provetta quelle più grandi, riusciamo ad aumentare il potere risolutivo rispetto alla

centrifugazione differenziale. Ma attenzione perché è una tecnica di velocità se non stiamo attenti a settare il tempo

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giusto rischiamo di perdere nuovamente la risoluzione nel senso che anche le particelle più piccole sedimenteranno.

Centrifugazione in gradiente isopicnica questa gioca sul fatto che la velocità è dipendente dalla differenza tra densità

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del mezzo e densità delle particelle (equazione che descrive la velocità di una particella sottoposta a campo centrifugo).

Se noi creiamo un gradiente nel quale in un punto la densità del mezzo equivale alla densità della

particella, la particella ad un certo punto si fermerà, non riuscirà più a scendere sul fondo della

particella perché troverà un punto del gradiente in cui la sua densità equivale a quella della

particella stessa. Quindi, riassumendo, giochiamo sul fatto che nella centrifugazione in gradiente

isopicnica si avrà un gradiente a concentrazione maggiore rispetto a quella zonale, un gradiente

che a un certo punto avrà la densità di ciò che volgiamo isolare e far sedimentare tecnica all’equilibrio o di equilibrio

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proprio perché se sono uguali e abbiamo una velocità che dipende dalla differenza tra la densità della particella e quella

del mezzo ed essendo questi uguali avremo una velocità che viene praticamente annullata.

Equazione: la densità è inversamente proporzionale alla viscosità ma è direttamente proporzionale al raggio della

particella (particelle più grandi sedimenteranno più velocemente), alla differenza tra la densità della particella e quella del

mezzo per il campo centrifugo che applichiamo.

L’equilibrio non cambia nel tempo quindi se dimentichiamo la centrifuga in

azione non si avrà perdita in risoluzione perché ci sarà il fermarsi di una

particella in un punto di gradiente. Il tempo richiesto per questa

centrifugazione sarà ancor più lungo di quello per la centrifugazione in

gradiente zonale perché avrò una forza di attrito che si opporrà al

movimento/velocità delle particelle nel mezzo.

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Che cosa si separa di solito con centrifugazione in gradiente isopicnico? Si

separano i vari organelli perché, per esempio, tra lisosomi, mitocondri e

perossisomi abbiamo densità diverse. Quindi se creiamo questo gradiente anche a

scalini, ossia prendo prima 1mL di soluzione, per esempio, più concentrata e

andando a decrescere la densità fino al punto in cui applichiamo il campione, ecco

che con una ultracentrifuga da 100.000 giri per 4 ore riusciremo ad avere la

separazione. In questa ultracentrifuga, quali sono i requisiti essenziali per raggiungere queste alte velocità e quindi far

avvenire la separazione sfruttando un campo centrifugo così elevato? Quali sono le differenze fisiche e meccaniche di

una ultracentrifuga risetto alla centrifuga da banco? Il vuoto ed il raffreddamento. Il vuoto perché se no non riusciremmo

a raggiungere delle velocità così elevate ed il raffreddamento perché questa attività cinetica ed il campo centrifugo

surriscaldano il tutto, compreso il campione che rischia di denaturarsi.

Ci sono varie tabelle che permettono di correlare la densità ai coefficienti di sedimentazione e quindi si può sfruttare e

mettere a punto il protocollo migliore a seconda del nostro quesito sperimentale.

La centrifugazione in gradienti è molto usata anche nei laboratori clinici. Infatti, se

vogliamo isolare le piastrine o i linfociti, il sangue viene messo a contatto con un

materiale chiamato Ficoll mediante il quale si ha la separazione delle varie parti

corpuscolate del sangue in questo modo possiamo separare linfociti e monociti

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dai basofili, dai neutrofili, dagli eosinofili e dagli eritrociti. In particolare, creiamo il

nostro gradiente e mettiamo il campione; dopodiché sottoponiamo a centrifugazione

e in fondo otteniamo un pellet di globuli rossi,

subito sopra ai globuli rossi c’è il Ficoll che

viene concentrato, lasciando nello strato superiore i linfociti e sopra il plasma

ricco di piastrine. Ficoll è il nome commerciale del gradiente maggiormente

utilizzato per questa centrifugazione in gradiente del sangue.

Possiamo poi giocare sull’utilizzo di

mezzi diversi poiché mezzi diversi

possono cambiare un po’ le densità dei

vari organelli. Ad esempio, se consideriamo il mezzo saccarosio, i mitocondri

hanno una densità di 1.188, se invece usiamo il Nycodenz abbiamo una

diminuzione che è ancora più accentuata se facciamo un gradiente con

Metrizamide. Nello stesso tempo abbiamo una variazione di perossisomi e

lisosomi. Quindi possiamo giocare a selezionare mezzi diversi che portino ad

avere ciò che vogliamo isolare di una densità molto diversa da altre componenti. Quindi si dice che il mezzo può

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influenzare la densità degli organelli per un effetto prevalentemente osmotico. Il mezzo con cui creiamo il gradiente, in

questo caso, servirà per separare ma anche per aiutarci a cambiare e esacerbare le differenze tra quello che volgiamo

isolare rispetto a tutto il resto. Possiamo anche isolare le parti di membrana plasmatica che sono

resistenti ai detergenti ovvero quelle parti che sono riconducibili a

strutture di tipo LIPID RAFTS. Il microscopio con il quale possiamo

verificare e visualizzare i rafts lipidici è il microscopio a forza atomica →

microscopio con una piccola levetta che compie dei piccoli spostamenti

sulla membrana delle cellule e riesce a percepire differenze in densità e

composizione tanto da poter ricreare un’immagine che evidenzia, nel

doppio strato fosfolipidico, dove sono concentrati gli sfingolipidi ed il colesterolo e quindi dove esistono questi rafts lipidici.

Avremo parti della membrana cellulare che saranno caratterizzate dal doppio strato fosfolipidico e altri in cui avremo

proteine transmembrana e recettori tutti organizzati in queste zattere lipidiche che vengono tenute insieme grazie alla

presenza di colesterolo e di sfingolipidi. Per isolarli facciamo in modo che tutta la parte non raft venga disgregata grazie

all’aggiunta di detergenti perché essendo fosfolipidi, in presenza di detergenti e senza niente che li tenga uniti, si

disperderanno. Attuando un trattamento delle cellule con il detergente Triton X-100 (per esempio) avremo il disintegrarsi

delle parti di membrana non raft ed il permanere delle parti raft con le proteine nella loro forma nativa perché stiamo

usando un detergente non ionico. Se sottoponiamo a centrifugazione in gradiente quello che è rimasto dopo il trattamento

con Triton X-100 vediamo trovarsi a un certo livello della provetta una banda opalescente che è quella corrispondente

alla parte raft della membrana plasmatica. Queste sono tecniche preparative che poi permettono di fare degli studi più

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avanzati ma che se sbagliamo queste tecniche preparative sbagliamo poi le tecniche più evolute e all’avanguardia che

potranno seguire questo step preparativo.

Cellule tipo adipociti o cellule muscolari o epatiche queste 3 potrebbero prestarsi a ciò che abbiamo in mente avendo

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detto che abbiamo cellule controllo e cellule trattate con l’insulina. Se diciamo insulina e si fanno come esempio queste

3 cellule, cosa può avvenire in queste 3 cellule quando c’è l’insulina? Sono quei 3 tipi cellulari che saranno in grado di

immagazzinare glucosio se siamo in situazioni di iperglicemia. Come fanno queste cellule a incamerare più glucosio e a

stoccarlo poi in qualche modo? Quando dobbiamo abbassare i livelli di glicemia viene secreta insulina che fa sì che il

glucosio entri proprio in quelle cellule che sono in grado di fare qualcosa Cosa faranno? Fegato e muscoli andranno a

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sintetizzare glicogeno mentre gli adipociti andranno a sintetizzare trigliceridi (questo è il motivo per il quale se uno mangia

delle caramelle senza introdurre lipidi ingrassa). Come fa a entrare più glucosio in queste cellule rispetto alle altre quando

abbiamo un picco glicemico? Perché l’insulina si lega ai recettori di queste cellule e permette un ingresso veloce e

cospicuo di glucosio in quelle cellule che sono in grado di stoccarlo in qualche modo. Quindi si ha un aumento dei carrier

di membrana i GLUT4 che sono gli insulino-dipendenti. In situazioni basali il GLUT4 è localizzato in vescicole di

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membrana intracellulari. Solo quando l’insulina si lega al proprio recettore viene attivata una via di trasduzione di segnale

che ha come risultato questa traslocazione delle vescicole di membrana con GLUT4 sulla membrana plasmatica. In

questo caso aumentano i trasportatori di numero ed è per questo che in queste cellule entra più