Biochimica Applicata - Appunti

μL.

trasparenti e 2 opache. Al loro interno verrà introdotto la soluzione del campione da analizzare.

Le facce trasparenti, devono essere indirizzate verso il raggio proveniente dal monocromatore; il

raggio attraverserà la prima faccia trasparente della cuvette, interagirà con il campione

contenuto in essa, quindi il raggio trasmesso dal campione uscirà dalla cuvette attraversando la

seconda faccia trasparente.

Come il raggio incidente, anche quello trasmesso conterrà un'energia potenziale. A valle

dell'alloggiamento del campione è presente un sistema di rilevazione del raggio trasmesso, che

converte l'intensità luminosa in un segnale elettrico, che viene misurato successivamente da un

apparato di misura (galvanometro). L'energia di un'onda elettromagnetica viene rilevata grazie a

cellule fotoelettriche; l'energia fotonica si rileva perché il fotone viene diretto su una lastra

metallica, la quale viene eccitata rilasciando elettroni dal fotocatodo; questi verranno attratti dal

fotoanodo, dando origine a una corrente elettrica, per cui l'energia potenziale si trasforma in

corrente elettrica. Maggiore sarà l'energia potenziale, maggiore sarà il numero di elettroni

emessi, maggiore sarà l'energia elettrica. Si determina con questo principio sia l'energia

potenziale del raggio incidente che del raggio trasmesso; quindi si può ricavare anche la densità

ottica; maggiore è quest'ultima, maggiore sarà la concentrazione del campione. La

spettrofotometria dà un analisi qualiquantitativa della molecola di nostro interesse.

La densità ottica è un valore puro, che non ha alcun significato se non si usa uno standard di

riferimento con diverse soluzioni a concentrazione diverse e note. Per ogni concentrazione si

valuta la densità ottica e si costruisce una retta di taratura; si valuta quindi la densità ottica della

soluzione a concentrazione incognita e si mette in relazione alla retta costruita. Ciò è possibile

farlo se la densità ottica è minore di 2, perché la misura di densità ottica è più precisa per

soluzioni più diluite, che hanno densità ottica minore di 2; se il valore di densità ottica è uguale

a 2 o superiore, si diluisce la soluzione di 10 volte, facendo attenzione ad inserire poi il fattore di

diluizione.

Questa tecnica si usa per analisi sia analitiche che preparative. L'analisi qualitativa prevede il

riconoscimento della presenza o assenza di un prodotto.

Lo spettrofotometro deve subire una manovra preventiva di taratura, poiché la molecola da

analizzare è presente come soluzione; la presenza del solvente potrebbe interferire per cui si

esegue prima un'analisi solo del solvente, atta a valutare la sua densità ottica, che viene registrata

e di conseguenza nell'analisi successiva sottratta alla misura totale; questo si effettua per lo

spettrofotometro a singolo raggio. Lo spettrofotometro a doppio raggio è costituito da tutte le

parti dello spettrofotometro a singolo raggio; tuttavia il raggio uscente dal monocromatore

viene diviso in 2 parti con l'ausilio di un sistema di specchi, in modo da indirizzare il raggio

anche in una seconda cuvette, che conterrà solo il solvente. Per ogni misura si andrà a valutare la

differenza tra il contributo totale e quello del solvente. Dunque la taratura avviene in parallelo;

questo garantisce una misura migliore, ed ha una lettura ad efficacia maggiore, rappresentando

una correzione di dati il linea di massima perfetta; questa misura simultanea, con l'uso dello

stesso sistema di rilevazione, consente la misura del solvente e della soluzione nelle stesse

identiche condizioni.

Lo spettrofotometro è utilizzato per un'analisi qualitativa delle proteine; i densitometri sono

degli spettrofotometri in cui il raggio non colpisce una cuvette ma una superficie di spessore 0,7

mm di gel trasparente, e scorrendo lungo la lunghezza del gel è in grado di rilevare la differenza

tra il gel trasparente e le bande colorate ottenute durante l'elettroforesi. Si rileva in questo caso

un tracciato di assorbanza delle singole bande rilevate, analizzando la concentrazione delle

proteine ancorate sul supporto solido.

Si usano dei sistemi di riconoscimento anche in soluzione proteiche, senza supporto, ma sono

sistemi colorimetrici; le proteine contenenti aminoacidi aromatici consentono la rilevazione

delle stesse perché questi gruppi hanno picchi di assorbimento particolari; le proteine assorbono

a 280 nm. Gli elettroni dei gruppi aromatici assorbono energia potenziale e si eccitano; si

rileverà un certo raggio trasmesso che rileva la concentrazione complessiva della proteina nel

campione, se conosciamo il coefficiente di estinzione morale, altrimenti si otterrà solo una

misura qualitativa.

Tecniche colorimetriche

L'intensità di colorazione di un cromoforo in presenza di proteine è correlato alla

concentrazione delle proteine stesse. Esistono 3 tecniche colorimetriche.

Biureto. Il metodo del Biureto è un metodo di determinazione delle sieroproteine di tipo

• chimico; riscaldando l'urea a 180 °C si ottiene la condensazione di due molecole di urea

che formano un composto detto Biureto. Se il Biureto viene posto in una soluzione

alcalina contenente ioni rameici (provenienti ad esempio da solfato rameico), si ha la

formazione di un complesso di colore violetto: questa reazione è indicata come reazione

del Biureto. L'intensità del colore sviluppato è proporzionale al numero di legami

peptidici interessati nella reazione, ed è quindi utilizzabile come metodo particolarmente

rapido e semplice per la determinazione qualitativa delle sieroproteine e delle proteine in

genere. L'intensità del colore violetto viene misurato con uno spettrofotometro, a 520-

550 nm.

Contestualmente alla formazione dei legami di coordinazione, i gruppi -NH- riducono

gli ioni rameici in rameosi; maggiore è la concentrazione delle proteine, maggiore è la

concentrazione degli ioni rameosi; poiché gli ioni rameosi aumentano l'intensità di

colorazione della soluzione, ne consegue che maggiore sarà l'intensità di colorazione,

maggiore sarà la concentrazione delle proteine.

Questa colorazione ha però anche un contributo di colorazione interferente del Biureto

che non ha reagito; si deve perciò sottrarre questo valore, tarando il sistema e misurando

cioè la densità ottica del sistema con il rame non complessato; dunque si effettua la

prima lettura sul reagente libero, e lo spettrofotometro registrerà questa misura per poi

sottrarla all'intensità totale.

Dalla densità ottica si risale alla concentrazione delle proteine tramite l'utilizzo di una

curva di taratura, con l'uso dell'albumina bovina, una proteina pura, a diverse

concentrazioni note, entro un determinato range di concentrazioni.

Lowry. E' molto più sensibile e si usa per un campione ad elevato grado di purezza o in

• tutte le situazioni di misura del contenuto proteico nelle colture cellulari, che è

dell'ordine di 5-10-20 Anche questo metodo si basa sul principio della reazione

μg.

degli ioni rameici con 4 legami peptidici, con formazione di ioni rameosi. Si usa poi una

soluzione di acido fosfotungomolibdinico (reattivo di Folin), che è un forte ossidante,

che viene, per la presenza degli ioni rameosi, ridotto in molibdato e tungstato; la sua

colorazione originale è giallo, ma per riduzione il colore vira al rosso intenso. L'intensità

di colorazione definisce la concentrazione di proteine; il reattivo di Folin viene aggiunto

successivamente al rameico poiché, essendo fortemente ossidante, provocherebbe

ossidazione. Si esegue una prova in bianco per azzerare il sistema di taratura

completamente e successivamente si esegue la lettura.

Acido Bicinconinico. E' sensibile quanto il Lowry nel range di concentrazione di E'

μg.

• utile per semplificare le procedure di analisi. Si aggiunge l'acido in contemporanea con gli

ioni rameici, senza che si provochino interferenza, perché questo interagisce

selettivamente con i prodotti rameosi ottenuti dalla reazione di riduzione tra peptidi e

ioni rameici; la colorazione che si ottiene è rossa. Questa analisi è molto più veloce

rispetto ai tempi di sviluppo delle altre prove.

Fluorimetro

La fluorescenza è un fenomeno spettroscopico che differisce dalla spettrometria di assorbimento

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per il tempo di ritorno degli elettroni allo stato fondamentale (10 s). Varia anche l'energia

ceduta come fotoni; parte dell'energia è dissipata, e l'energia restituita sarà più bassa di quella

incidente. Il raggio trasmesso consiste in un fotone di energia più bassa e lunghezza d'onda

maggiore. Tutte le molecole assorbono, ma solo alcune fluorescono. La lunghezza d'onda

incidente sarà inferiore della lunghezza d'onda del raggio emesso. Si parlerà di spettro di

assorbimento e spettro di emissione. Le sostanze fluorescenti hanno entrambi i tipi di spettri. Si

possono avere in questo caso sia informazioni qualitative che quantitative. L'analisi qualitativa

esprime il massimo di assorbimento e il massimo di emissione. Se la molecola che stiamo

cercando ha un certo picco di assorbimento e di emissione, ritrovati nel campione allora quella

molecola è presente. Si devono dimostrare 2 caratteristiche questa volta. L'analisi quantitativa si

effettua per la legge di Stokes che regola la densità ottica della soluzione in confronto alla

concentrazione della molecola nella soluzione. Anche la fluorescenza si valuta come densità

ottica ed è direttamente proporzionale alla concentrazione del composto.

La strumentazione è diversa; si ha sempre un generatore di UV costituito da una lampada al

deuterio; è presente il monocromatore che seleziona la lunghezza d'onda; il raggio selezionato

colpirà la cuvette, sempre di cammino ottico 1 cm, all'interno del quale sarà presente il

campione; il raggio emesso sarà rilevato a 90° e non a 180°.

La molecola emette fotoni, in una miscela contenente diverse molecole, per cui se il raggio

fosse misurato a 180° dovrebbe attraversare tutta la cuvette nel suo spessore e potrebbe essere

assorbito da queste altre molecole; si otterrebbe una sottostima della fluorescenza emessa.

Inoltre a 180° il fotocatodo potrebbe interagire con la luce diffusa dal campione che fluoresce.

L'onda elettromagnetica viene dunque registrata a 90°; viene poi raccolta dal fotocatodo una

quota di onde elettromagnetiche provenienti dalla superficie di contatto diretto con la cuvette

da parte del raggio inc