Biochimica Applicata - Appunti

Modelli di sperimentazione biologica

In base all'importanza biologica si distinguono la sperimentazione in vivo, la sperimentazione ex-vivo e la sperimentazione in vitro.

Sperimentazione in vivo

È la più importante in termini di risultati ottenuti. Queste analisi sono molto utilizzate per ottenere informazioni adeguate per la sperimentazione farmacologica. Richiede l'uso di animali intatti, quali topi, cavie, ratti, porcellini d'india, mentre per analisi a livello del sangue, o in generale a livello dei liquidi biologici, vengono utilizzati organismi più complessi, come ad esempio i conigli, i quali hanno una vena nell'orecchio attraverso la quale è possibile fare prelievi continui.

Il laboratorio destinato a queste analisi, chiamato stabulario, è sottoposto a vincoli rigidissimi e deve essere approvato dal Sistema Sanitario locale; segue caratteristiche strutturali ben precise, allo scopo di diminuire il più possibile lo stress a cui gli animali possono essere sottoposti, i quali possono creare reazioni che possono alterare lo studio. Le singole gabbie devono presentare determinate caratteristiche per la sopravvivenza corretta dell'animale; il locale deve essere inoltre insonorizzato ed avere dei ritmi luce-buio adeguati; devono essere provvisti di camere di sacrificio poste lontano dal resto delle gabbie; gli ambienti per lo stoccaggio alimentare devono essere molto controllati.

La sperimentazione biologica sull'animale viene preceduta da una preparazione e da un'autorizzazione, in modo da garantire il giusto trattamento per il sacrificio dell'animale; deve essere specificato ogni utilizzo dell'animale, come ad esempio il tipo di stordimento utilizzato prima del sacrificio dell'animale, il tipo di sacrificio, l'organo che verrà utilizzato, le modalità di eliminazione della carcassa. Il ricercatore deve scegliere il modello animale che meglio si adatta alla sperimentazione, optando per il più economico; deve inoltre occuparsi della crescita del proprio campione biologico, scegliendo le condizioni ideali per lo svolgimento delle sperimentazioni.

Gli animali della sperimentazione vengono suddivisi in due categorie: il gruppo controllo, nel quale è assente la molecola d'interesse, e il gruppo trattato, nel quale invece la molecola è presente. Gli animali vengono scelti il più omogenei possibili tra loro in sesso, età, peso, ceppo ed altre caratteristiche.

Spesso per lo studio della biodisponibilità di un farmaco si controlla la quantità di molecole presenti nelle urine e nelle feci; nelle feci è presente la frazione di molecola non assorbita, mentre nelle urine è presente la molecola dopo aver espletato la sua funzione. A questo scopo vengono utilizzate particolari gabbie che consentono la separazione di urine e feci; queste devono essere precedentemente trattate con molecole idrolitiche, quali ad esempio le Idrolasi, poiché potrebbe sfuggire una certa quantità di molecola che può essere stata coniugata; le Idrolasi ed altri enzimi idrolizzano diversi tipi di coniugazione. Dopo i processi enzimatici si può passare ai processi estrattivi.

Esistono inoltre gabbie in cui è possibile raccogliere l'aspirato; contengono una sostanza assorbente, priva di CO₂, capace di assorbire il prodotto evaporato anche dalla pelle dell'animale; questo rivestimento viene recuperato ed analizzato. Per determinare la quantità di molecole nella bile è necessario invece il sacrificio dell'animale dopo anestesia.

Spesso nelle sperimentazioni in vivo si utilizzano animali transgenici, cioè portatori di una modifica genetica, sia nel genotipo che nel fenotipo, e capaci di trasmettere germinalmente la modifica genetica. Vengono utilizzati per due scopi: rappresentare un modello fisiopatologico di alcune malattie su cui sperimentare molecole o farmaci in grado di contrastare i sintomi della malattia, di cui l'animale è geneticamente portatore; creare animali bioreattori per la produzione di molecole di interesse farmacologico e biologico, che viene recuperata dall'animale e introdotta nel mercato.

Esistono molte molecole, in particolare proteine, che posseggono effetti farmacologici importanti; alcune patologie impediscono la normale formazione di queste molecole, e risulta quindi necessario introdurle direttamente come farmaco. Un esempio tipico è quello dell'insulina, che veniva prima estratta dai maiali sacrificando l'animale; l'insulina porcina però non era completamente uguale a quella umana, e alla lunga veniva riconosciuta come estranea da parte dell'organismo ed eliminata dal sistema immunitario. Per risolvere tale problema si è creato un animale transgenico che riuscisse a produrre normalmente l'insulina umana, in maniera continua ed infinita; l'animale transgenico viene modificato nella sequenza del DNA, con introduzione della sequenza codificante per l'insulina e della sequenza promoter che ci dia la sicurezza che quel gene venga espresso e che la proteina venga quindi sintetizzata; risulta inoltre utile ed essenziale far sì che l'espressione del gene d'interesse avvenga in un determinato organo dal quale poi la molecola è facilmente ricavabile, come ad esempio gli organi che producono fluidi extracellulari; le cellule mammarie, ad esempio, espellerebbero la molecola d'interesse attraverso il latte.

Altri tipi di molecole prodotte utilizzando animali transgenici sono i fattori di coagulazione per la cura dell'emofilia, il collagene utile per la formazione di veli nelle ustioni, gli ormoni della fertilità per la cura della sterilità, l'albumina sierica, alcuni anticorpi, il fibrinogeno, e diverse altre molecole. Gli animali transgenici più utilizzati sono le mucche, ma anche capre, maiali e pecore.

Oltre alla produzione di molecole di interesse farmacologico, gli animali transgenici sono creati allo scopo di simulare uno stato patologico; questo può essere indotto mediante modificazioni all'interno del genoma che possono essere di due tipologie: la modifica può essere di tipo transgenica quando si addiziona un carattere genotipico di interesse, mentre si parla di animali transgenici di tipo knock-out se sono deficienti per un carattere genico, tramite modificazione del gene endogeno allo scopo di creare una situazione di non espressione del gene di interesse.

Esempi di animali transgenici knock-out sono i conigli che non esprimono la Apolipoproteina E o ApoE; rendere knock-out un coniglio per la ApoE vuol dire non rendere più disponibile questa proteina; la funzione della ApoE è quella di trasportare lipidi e lipoproteine dal sangue verso i recettori del fegato, includendole all'interno del fegato stesso; con la mancata espressione di ApoE, quest'ultima non può più espletare la propria funzione, con conseguente aumento del livello di colesterolo plasmatico; tali animali sono infatti utilizzati allo scopo di simulare l'aterosclerosi nel loro organismo.

Un altro esempio è quello dell'animale reso knock-out per la p53; la p53 è una proteina oncosoppressore che regola l'apoptosi mediante interazione con sequenze enhancer per geni che codificano per le proteine CIP ed INK (inibitrici rispettivamente delle cicline e delle chinasi, con blocco del ciclo cellulare), per le proteine NOXA e PUMA (proteine proapoptotiche BH3 only) e con sequenze silencer per geni che codificano per le proteine antiapoptotiche; l'assenza di p53 provoca l'accumulo di danni citotossici, e l'animale diviene un organismo a rischio di tumori.

Un ulteriore esempio è fornito da animali knock-out per la proteina transmembrana CFRT, che regola il flusso del cloro; in assenza di essa il cloro non viene eliminato frequentemente, si accumula producendo muco nelle vie respiratorie, provocando l'insorgenza della fibrosi cistica, una malattia incontrollabile e mortale.

Esempi di animali con modificazioni di tipo transgenico sono rappresentati invece da quelli portanti nel proprio genoma l'oncogene myc, che regola l'inattivazione della proteina del retinoblastoma per fosforilazione, regolando l'ingresso della cellula in fase G1; se questo gene viene inserito in una parte di DNA che si esprime in modo continuo, viene favorita l'insorgenza del cancro.

Un altro esempio è quello dato dall'inserimento del gene codificante per l'APP umana, una proteina che idrolizzata forma fibrille che si depositano in prossimità delle sinapsi neuronali, diminuendo l'efficacia degli stimoli nervosi; l'induzione della formazione di questa proteina provoca l'accumulo di fibrille, con alta probabilità di insorgenza di malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer.

Sperimentazione ex-vivo

La sperimentazione ex-vivo è un tipo di sperimentazione su organi animali isolati, che prevede quindi il sacrificio dell'animale e l'escissione dell'organo di interesse; l'organo deve essere di grandi dimensioni ed i più utilizzati sono il fegato ed il cuore, poiché in grado di continuare a svolgere un adeguato meccanismo organico e la fisiologia dell'organo. La sperimentazione, in questo caso, si occupa di molecole che influenzano il metabolismo epatico e molecole di interesse cardiaco.

L'animale viene anestetizzato e l'organo viene asportato, compreso di arterie e vene proprie; l'organo quindi viene immediatamente incannulato; il microcircolo viene chiuso, mentre viene lasciato il macrocircolo con la creazione di una circolazione dalla vena cava con una soluzione che irrora l'organo attraverso il letto vascolare; la soluzione uscirà poi dalla cannula posta nell'arteria. La soluzione in questione è tamponata a pH 7,4, rispettando una certa concentrazione ionica simile a quella del sangue dell'animale di origine; deve essere ricca di nutrienti e di O₂ (perché non sono presenti i globuli rossi e di conseguenza l'emoglobina), contenere glucosio e NaCl allo 0,9%; la sua temperatura deve essere quella fisiologica di 37°C. Tale soluzione viene spinta in circolo mediante una pompa, irrorando l'organo. L'organo inoltre viene messo in un bagno d'organo, pieno di soluzione fisiologica a 37°C, per evitare situazioni di disidratazione. In questo modo l'organo è utilizzabile per brevi periodi di osservazione, perché dopo 48 ore non si possono avere le stesse funzioni fisiologiche e metaboliche di origine.

Nel fegato, ad esempio, la vena porta e le arterie sovraepatiche sono recise ed incannulate con tubi di diametro diverso in base alla grandezza del vaso. L'organo quindi viene posto in una soluzione fisiologica tamponata e scaldata a temperatura fisiologica. Attraverso le cannule viene fatto circolare il liquido grazie ad una pompa che simula l'azione elastica delle arterie e delle vene del letto vascolare.

Le sperimentazioni più usate sono fatte sul muscolo cardiaco per studiare gli effetti e le eventuali soluzioni all'infarto del miocardio e alle ischemie. Per l'ischemia si simula un'ostruzione vascolare; si sottopone l'organo ad uno stato di ipossia sperimentale, successivamente l'arteria viene resa nuovamente attiva e si valuterà l'effetto dell'irroramento successivo all'ipossia.

Durante l'ischemia il cuore è privato di O₂ ed il tessuto diventa prevalentemente glicolitico, con conseguente presenza elevata di acido lattico che abbassa il pH, eliminato dalle cellule con un sistema antiporto che fa accumulare H⁺ nella cellula; questa condizione è molto grave e molte cellule sono compromesse con danni reversibili o irreversibili, per danneggiamento ad esempio di enzimi pH sensibili. Gran parte del tessuto cardiaco viene necrotizzato con riversamento di enzimi litici nello spazio interstiziale, propagando l'effetto necrotico. Nel periodo di riperfusione il danno peggiora, perché la riduzione di O₂ può non essere ottimale, e si ha la produzione di specie radicaliche dell'ossigeno.

In questo momento, a monte dell'ostruzione, si accumulano polimorfonucleati rilasciati dalle cellule necrotiche; questi sono reclutati da particolari proteine chemiotattiche; il sistema, ritornato in perfusione, viene quindi invaso dai globuli bianchi, prima bloccati, per risposta infiammatoria, i quali rilasciano anione superossido, che dovrebbe agire contro un patogeno che in realtà non è presente, poiché la risposta infiammatoria è stata causata dall'ischemia.

Lo sforzo sperimentale è quello di agire sul sistema circolatorio riducendo il periodo ischemico, ed individuare farmaci che in circolo possano proteggere il tessuto riperfuso dai danni ossidativi. Le molecole di interesse sottoposte al nostro studio saranno sicuramente molecole antiossidanti. Contestualmente si effettuano misure elettrofisiologiche (battito cardiaco, tempo necessario per riprendere la normale attività cardiaca), ed aggiungendo un farmaco si può comparare il tempo di recupero dell'attività meccanica del cuore nel quale è stata iniettata la molecola di interesse con quello di un cuore controllo. Altri parametri misurati sono quelli biochimici, che si calcolano misurando l'area di necrosi e di conseguenza gli enzimi liberati dalle cellule morte, come creatina fosfato chinasi, latticodeossigenasi, enzimi tipici del miocita, aminotransferasi, etc.). I danni di un sistema trattato dovrebbero essere inferiori rispetto ad un sistema di controllo, naturalmente se la molecola di interesse agisce correttamente.

Spesso il farmaco può anche essere aggiunto prima di indurre l'ischemia, oppure direttamente nel liquido di reflusso; naturalmente, nel primo caso si valuta anche un modello di prevenzione che può simulare una condizione di stile di vita alimentare dell'animale. Si può quindi agire somministrando il farmaco all'animale in un gruppo trattato e somministrando solo il veicolo al gruppo di controllo, con però un certo stile alimentare. In questo modo si studia l'effetto ischemico dell'organo pre-trattato o veicolato.

Un altro modello di sperimentazione ex-vivo è l'analisi delle cellule del tessuto sanguigno. È un'analisi che viene eseguita sull'uomo con un semplice prelievo, valutando parametri biochimici dopo che l'individuo è stato condizionato ad uno stress particolare, come ad esempio uno stress ossidativo alimentare. Quando gli acidi grassi insaturi ossidati prevalgono sui nativi, le LDL accumulano prodotti ossidativi di lipidi che sono citotossici per le cellule vascolari, in quanto possono danneggiarle ed indurre uno stato di infiammazione; si vengono ad ossidare altri lipidi, i quali poi possono accumularsi conducendo in breve tempo ad un'ostruzione vascolare (aterosclerosi). Questa situazione può provocare ischemia in vari organi (cardiaca, polmonare, epatica, cerebrale). La strategia terapeutica per lo stress ossidativo consiste nell'alimentazione con sostanze antiossidanti che agiscono sulle LDL diminuendo anche gli acidi grassi ossidati.

Dal prelievo di sangue si isola il plasma, e da questo le LDL. Una sperimentazione ex-vivo prevede ad esempio un periodo di alimentazione con fichi d'India, i quali rilasciano dopo 3 ore molte molecole antiossidanti; si isolano le LDL di un prelievo precedente (di controllo) e poi le LDL dopo 3 ore dalla somministrazione; queste ultime, in condizioni di stress ossidativo resistevano il doppio rispetto alle LDL di controllo; ciò vuol dire che abbiamo condizionato fisiologicamente le LDL valutando in vitro le conseguenze di un trattamento eseguito in vivo.

Sperimentazione in vitro

Per la sperimentazione in vitro si fa riferimento a sistemi cell-free (omogenati di tessuto), che si ottengono quando un tessuto immerso in un fluido viene totalmente disgregato, con la rottura dei collegamenti intercellulari ed inducendo anche la rottura delle membrane cellulari, con conseguente dispersione omogenea di tutte le sostanze subcellulari; in questo modo le membrane subcellulari rimangono intatte, consentendo ai singoli organelli di mantenere le proprie attività.

L'omogenato si distingue dalle colture cellulari, poiché queste ultime prevedono operazioni differenti e prevedono solo la rottura dei contatti cellulari, digerendo solo la matrice cellulare senza danneggiamento delle membrane cellulari. Di conseguenza l'obiettivo dei due processi è totalmente diverso.

Omogenizzazione

L'omogenizzazione si esegue in determinate condizioni, in modo da preservare meglio le attività biologiche del campione; l'ambiente dove avviene il processo deve rispettare alcuni principi:

• Il tessuto deve essere immerso in un fluido che deve essere tamponante, in modo da ristabilire un certo pH; il tampone che si sceglie varia in base alle esigenze della sperimentazione o in base al tipo di tessuto. Il tampone fosfato non è molto utilizzato, poiché è in grado di chelare ioni bivalenti come Mg²⁺ e Ca²⁺, sottraendoli all'equilibrio e privando la soluzione di ioni fondamentali per le attività biologiche. Viene utilizzato il TRIS, o 2-aminoidrossipropan-1, 3-diolo, un acido debole che ha un pKa di circa 7,4; quest'ultimo però inibisce le deidrogenasi, per cui se si vuole controllare l'attività di enzimi del genere il TRIS non può essere utilizzato. Esistono tamponi come EPES o PIPES che però interferiscono con i sistemi di colorazione dei cromogeni usati per il dosaggio proteico, e si possono utilizzare solo se il dosaggio proteico non interferisce con essi.
• La soluzione deve inoltre essere isotonica in modo da non danneggiare i corpuscoli; l'isotonicità è ottenuta aggiungendo NaCl 0,1% alla soluzione, oppure utilizzando una soluzione di saccarosio 0,25 M che aumenta il valore osmotico della soluzione.
• Le soluzioni omogenizzate contengono una certa quantità di agenti riducenti, come il ditiotreitolo (DTT) o il β-mercaptoetanolo, per prevenire l'ossidazione dei gruppi tiolici nelle proteine.