Appunti di Biochimica e biochimica applicata

ELIMINARE L'ECCESSO DI FISSATIVO RIMASTO ALL'INTERNO DEI CAMPIONI, CHE POTREBBE REAGIRE CON ICOLORANTI SUCCESSIVI

INCLUSIONE

NEI TESSUTI FISSATI, PER POTER ESSERE OSSERVATI AL MICROSCOPIO OTTICO, DEVONO ESSERE:

• SEZIONATI IN FETTINE SOTTILI 2-8 μm
• PER OTTENERE SEZIONI SOTTILI I TESSUTI DEVONO ESSERE SUFFICIENTEMENTE DURI E COMPATTI
• INCLUSIONE IN MEZZI SEMISOLIDI
• IL TESSUTO DEVE ESSERE IMBIBITO DELLA SOSTANZA USATA PER L'INCLUSIONE (PARAFFINA)

Sostanze di inclusione per osservazione in MO: PARAFFINA e MISCELE DI POLIMERI PLASTICI (PARAPLAST)

PARAFFINA

СН3-CH2- - - -CH2-CH3 (CnH2n+2)

-SI OTTIENE DAI RESIDUI DI DISTILLAZIONE DEL PETROLIO

-IL PUNTO DI FUSIONE SI INNALZA CON LA LUNGHEZZA DELLA CATENA

-IN ISTOLOGIA SI USANO DA C22 A C28, DIVIDENDO LE PARAFFINE IN MOLLI (45 - 54°C) E DURE (58 - 60°C)

-OGGI NON SI USANO PIÙ LE PARAFFINE NATURALI (SEMPRE MISTURE DI VARIA LUNGHEZZA), MA PARAFFINE SINTETICHE, PURE E OMOGENEE (ES. PARAPLAST)

-I SOLVENTI

PER LA PARAFFINA SONO: XILENE, CLOROFORMIO, BENZENE E TOLUENE

Inclusionedue fasi:

• Infiltrazione del mezzo di inclusione
• Indurimento del mezzo di inclusione

Indurimento del mozzo di inclusione

Fase di SOLIDIFICAZIONE:

Dopo l'ultima sostituzione nel mezzo di infiltrazione i pezzi biologici saranno inserti in opportuni contenitori sagomati o in piccoli recipienti di plastica. Pezzi biologici inseriti negli opportuni contenitori sagomati si solidificheranno a temperatura ambiente.

SEZIONAMENTOTAGLIO

Il suo scopo è quello di sezionare il pezzo allo spessore voluto (5-8 um di norma) in modo da poter essere osservato al microscopio dopo opportuna colorazione.

OCCORRENTE

• Lama
• Blocchetti di legno
• Paraffina solida in scaglie
• Microtomo rotativo
• Lama diritta
• Contenitore delle fette

IL MICROTOMO ROTATIVO

Per il sezionamento si sfruttano due movimenti:

1. uno di avvicinamento del campione alla lama e corrisponde allo spessore della sezione che varia da 0,25 a 50 micron

(Microtomo: 5-8 milcron)2. il secondo, perpendicolare alla direzione di avvicinamento, corrisponde al movimento di taglio

IMPORTANTE: durante il taglio al microtomo si formano sezioni seriali di tessuto (seriatura). La seriatura consentirà all'operatore di seguire il cambiamento morfologico durante tutta l'indagine in tutto il tessuto, dopo le colorazioni, durante l'osservazione al MO.

Le sezioni seriali ottenute con il microtomo sono trasferite, tramite l'ausilio di pennelli, in bagnetto termostatato con acqua calda distillata a 37°C-45°C. Tale temperatura consente la distensione della paraffina allo scopo di eliminare eventuali pieghe che si formano all'atto del taglio sulle fette distese sulla superficie dell'acqua.

SEZIONAMENTO
RACCOLTA delle sezioni
dopo distensione, le sezioni seriali (fette) sono raccolte su vetrini portaoggetti. I vetrini su cui è stato posto il campione incluso saranno posti su piastre riscaldate a 37°C-38°C.

Di localizzare gli antigeni nella coltura cellulare o nella sezione di tessuto mediante l'uso di anticorpi marcati attraverso interazioni antigene-anticorpo che sono visualizzati da un marcatore come un colorante fluorescente, enzima o oro colloidale.

IMMUNOISTOCHIMICA

Tecnica che usa gli anticorpi per localizzare gli antigeni nei tessuti. Gli scopi possono essere:

1. Ricerca
2. Attività clinica

La diagnosi, la prognosi, la terapia e la reazione antigene-anticorpo sono alcuni dei possibili scopi. La reazione immune non è di per sé visibile. È necessario quindi servirsi di marcatori che direttamente o indirettamente possano evidenziarne la formazione.

MARKERS DELLA REAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA

Attualmente sono impiegati due differenti tipi di tracciante:

• Fluorescente
• Enzimatico

Tecniche Immunoistochimiche: Tecniche di Immunofluorescenza utilizzano fluorocromi come marcatori della reazione antigene-anticorpo. Tecniche Immunoenzimatiche utilizzano enzimi per evidenziare la reazione.

antigene-anticorpo

tecniche e metodi

La tecnica Immunoenzimatica prevede l'uso di enzimi legati direttamente o indirettamente all'Ac T° per evidenziare la formazione del complesso immune.

L'enzima catalizza la formazione di un precipitato colorato e insolubile visibile al microscopio, nel sito in cui è avvenuta la reazione Ag-Ac.

EVIDENZIAZIONE DEL COMPLESSO IMMUNE

A seconda del tracciante enzimatico:

IMMUNOPEROSSIDASI

IMMUNOFOSFATASI

IMMUNOGLUCOSIDASI

IMMUNOB-GALATTOSIDASI

Perossidasi è ottenuta dal rafano ma è presente anche nei tessuti umani.

Può formare legami covalenti con le immunoglobuline.

Il suo substrato è il perossido di idrogeno:

2 H2O2 = 2 H2O + O2

elemento ossidante per il cromogeno.

Il cromogeno più utilizzato è la DAB che da un prodotto di ossidazione insolubile e colorato in bruno.

L'insolubilità e la stabilità del prodotto di ossidazione della DAB consentono il montaggio e l'archiviazione dei

IMMUNOISTOCHIMICA - STEPS

1. Preparazione delle sezioni
2. Smascheramento dei siti dell'antigene
3. Bloccaggio
4. Incubazione con Anticorpo (Ab) / Lavaggio
5. Rilevamento legame Antigene: -Ab / Lavaggio
6. Contrasto dei nuclei / Montaggio / Osservazione Microscopia

Preparazione delle sezioni

FISSAZIONE FISICA PER CONGELAMENTO:

Gli antigeni sono inalterati ma la morfologia delle sezioni potrebbe essere alterata durante la procedura.

FISSAZIONE CHIMICA (Paraformaldeide) e INCLUSIONE:

La struttura del tessuto viene preservata ma nelle procedure di inclusione l'alcool può estrarre i lipidi.

SPARAFFINATURA:

Solvente organico = XYLENE.

REIDRATAZIONE:

Alcooli discendenti (100%, 70%, 50% e poi H2O).

Smascheramento dell'Antigene

Le sezioni sparaffinate e reidratate devono essere trattate per esporre gli epitopi antigenici attraverso la reversione parziale della fissazione aumentando l'accessibilità dell'anticorpo.

Bloccaggio dei

Sono chiamati anticorpi policlonali.

Monodional antibodies: Anticorpi specifici per un singolo EPITOPO e prodotti da un singolo clone sono chiamati anticorpi monoclonali.

Rilevamento del legame Antigene-I Ab:

• Preparazione delle sezioni
• Smascheramento dei siti dell'Antigene
• Bloccaggio dei siti non specifici
• Incubazione con Anticorpo Primario (I Ab)
• Lavaggio
• Rilevamento legame antigene- IAb (incubazione con anticorpo secondario II Ab, 30-60 min at T.a. L'anticorpo deve essere diretto contro la regione costante dell'anticorpo primario)
• Lavaggio
• Contrasto dei nuclei
• Montaggio
• Osservazione microscopia

Visualizzazione del legame anticorpo-antigene:

Marcatore Fluorescente:

• Fluoresceino
• Texas Red
• Marcatore Enzimatico: Horseradish peroxisade (HRP)
• Colloidal gold

Incubazione with DAB + H2O2 per 5 min at RT

ALLESTIMENTO DI PREPARATI IMMUNOISTOCHIMICI:

Procedimenti da eseguire sui tessuti per dimostrare le molecole desiderate, possono

• Metodo diretto
• Metodo indiretto

• Metodo con immunocomplessi
• Metodo diretto con avidina biotina
• Metodo indiretto con avidina biotina
• Metodo indiretto con avidina biotina ABC

• AVIDINA - BIOTINA - PEROSSIDASI: Avidin-Biotin complex
• Ab primario diretto contro l'antigene
• Ab secondario coniugato con la biotina
• La biotina si lega ad un complesso preformato costituito da un reticolo di avidina-biotina ed enzima

• È estremamente sensibile e ha il vantaggio che un solo anticorpo II° marcato può essere utilizzato per riconoscere diversi anticorpi I° appartenenti alla stessa specie.
• Nell'esempio la sezione della reazione precedente è stata incubata con un anticorpo secondario prodotto in capra (goat) diretto contro la parte costante delle immunoglobuline di coniglio (goal-anti rabbit= GaR) e coniugato con un'attività

enzimatica (E)

Contrasto dei nuclei e montaggio

Incubazione con DAPI for 1-5 min at RT

Montaggio con Aqueous Mounting Medium

Incubazione con ENTELLAN per 1-5 min at RT v disidrataz. in Alcol (50%, 70%, 100% e Xylene)

Montaggio con Non-Aqueous Mounting Medium

Osservazione microscopio ottico

Ad esempio, ecco il risultato dell'osservazione di cellule mononucleate del sangue sottoposte a reazione immunoenzimatica con un anticorpo primario diretto contro la molecola "IL-6" (=antigene)

In questo campo, 4 cellule sono "positive"