Appunti di Biochimica Applicata

Folding proteico

• Idropatia > compatibilità sterica > volume della catena laterale • Inibitore della ribonucleasi Motivi beta foglietto-ansa-alfa elica (forma a ferro di cavallo) ○ Modulo stabilizzato da leucine (2, 5, 7 del foglietto beta si impacchettano con le leucine ○ 17, 20, 24 dell'alfa elica e con la leucina 12 dell'ansa) • Zif 268 (zinc finger) Cys₂-His₂ ○

In vivo e in vitro

• In vivo: alfa-elica 100 n sec; beta-foglietto 1 u sec • In vitro: alfa-elica 50 u sec; tempo >>

Interazioni e conformazione

• Interazioni tra residui amminoacidici chiave -> globulo fuso (struttura che contiene la struttura secondaria finale - fase rapida) -> conformazione terziaria e quaternaria (fase lenta) • Ripiegamento della proteina può iniziare durante la sintesi proteica o dopo che ha raggiunto un determinato compartimento • Per proteine con più di 100 amminoacidi si osserva un intermedio che è una tappa obbligata (quasi sempre) • Velocità di riavvolgimento >> velocità di sintesi • L'avvolgimento di un dominio proteico (100-300 amminoacidi) può avvenire solo quando l'intera sequenza di amminoacidi di cui è formato è stata sintetizzata • Tendenza ad aggregare della catena nascente può essere fortemente incrementata dalla contemporanea presenza di altre catene nascenti a livello dei poliribosomi associati allo stesso mRNA -> chaperones (attività ATPasica)

Chaperones

• Ubiquitari oppure distretto cellulare/tessuto specifici; alcuni interagiscono con la catena polipeptidica nascente (QC I); altri interagiscono dopo che la catena polipeptidica è stata sintetizzata (QC II)

HSP70

Citoplasma, nucleo, mitocondri, cloroplasti ○ Legame alle proteine nascenti, prevenzione di aggregati molecolari, partecipano a ○ processi post-traduzionali (determinazione della destinazione specifica e trasferimenti attraverso membrane) Riconoscono 7 amminoacidi idrofobici ○ Dominio N-terminale ATPasico e dominio C-terminale che lega peptidi ○ Legano le HSP40 e legano ed idrolizzano ATP (l'idrolisi comporta un forte legame alle ○ proteine bersaglio); rilascio di HSP40 e ADP e legame di una nuova molecola di ATP e si dissociano dalla proteina bersaglio

Eucarioti e procarioti

• Eucarioti Procarioti
• HSP70 DnaK
• HSP40 DnaJ
• Bag-1 GrpE

HSP90

Agiscono a valle del sistema HSP70/HSP40 ○ In assenza di shock/stress interagiscono solo con poche segnalatrici fra cui i recettori ○ degli ormoni steroidei, chinasi protooncogeniche come Raf e Src e molecole che regolano il ciclo cellulare; in presenza di shock/stress diventano meno selettive e immagazzinano proteine non ben avvolte che verranno rinaturate da altri chaperones. Formano omodimeri e ogni monomero presenta un dominio N-terminale ATPasico, un ○ dominio intermedio e un dominio C-terminale che permette la dimerizzazione. Riconoscono il substrato in conformazione quasi nativa e il legame al substrato dipende ○ dalle HSP70 ed è mediato da p60/Hop (una proteina che interagisce sia con le HSP70 che con le HSP90). L'azione delle HSP90 dipende da numerosi cofattori differenti la maggior parte dei quali ○ possiede un dominio TPR-clamp (tetratricopeptide repeat) che permette il legame alla sequenza EEVD (Glu-Glu-Val-Asp) di HSP90. Altri possiedono attività particolari: § Peptidil-prolil isomerasi § Serina/treonina fosfatasi 5. Altri ancora sono localizzati in strutture cellulari specifiche e funzionano come trasportatori (TOM70)

HSP a basso peso molecolare

• HSP a basso peso molecolare (15 e 40 kDa) Ubiquitarie ○ Attività indipendente da ATP ○ Condividono una sequenza interna di circa 100 amminoacidi (questa sequenza permette ○ a queste HSP di formare aggregati con altre 50 subunità); questi complessi si riorganizzano in complessi più piccoli e attivi quando la cellula è sottoposta a stress; numerose proteine con struttura non-nativa possono essere legate e rese stabili da uno di questi complessi e poi verranno indotte ad assumere la conformazione nativa dalle HSP70 o da altri chaperones

Chaperonine

• Chaperonine (60 kDa) Attività ATPasica ○ Complessi costituiti da 2 anelli sovrapposti e ciascun anello delimita una cavità ○ 2 gruppi di chaperonine ○

• Gruppo I Eucarioti (mitocondri e cloroplasti) Procarioti
• HSP60 GroEL
• HSP10 GroES □
• HSP60/GroEL possiedono 3 domini:
• Dominio apicale formato da un sandwich-beta con ai lati alcune alfa-eliche
• Dominio intermedio formato da 3 alfa-eliche
• Dominio equatoriale formato da 10 alfa-eliche formato dalle estremità N- e C-terminale □
• 14 subunità di GroEL/HSP60 e 7 GroES/HSP10 (forcine beta formano il tetto), le anse mobili sono idrofobiche e interagiscono con GroEL/HSP60 □
• Meccanismo di funzionamento delle chaperonine
• La proteina da rinaturare viene catturata da interazioni con GroEL.
• L’ATP si lega con cooperatività positiva alle sub. di un anello, ma con cooperatività negativa a quelle dell’altro anello.
• L’anello che ha legato ATP lega rapidamente Gro ES. Allo stesso tempo c’è un notevole cambiamento strutturale nell’anello che ha legato GroEL, i siti di legame idrofobici vengono internalizzati ed il substrato penetra nella camera di “folding”.
• L’ATP viene idrolizzato ed il substrato si riavvolge.
• Un nuovo substrato ed ATP si legano all’altro anello ed inducono il distacco di GroES e la liberazione della proteina.
• Viene incapsulato un nuovo substrato

• Gruppo II (TRiC o CCT) □ Citoplasma degli eucarioti e non richiedono HSP10 □
• TRiC (complesso ad anello TCP-1) o CCP (chaperonine contenenti TCP-1) □
• 16 subunità ortogonali (2 anelli di 8 subunità molto simile ma che differiscono per il dominio apicale che quindi permettono di legare substrati differenti); possiedono un'alfa-elica in più forma un'estroflessione e che si pensa possa funzionare come GroES/HSP10 □
• Il meccanismo di funzionamento di queste chaperonine è meno conosciuto rispetto a quello del gruppo 1. Si pensa comunque che dopo il legame del substrato si verifichi un cambiamento strutturale simile a quello descritto per il gruppo 1 e guidato anch’esso dall’idrolisi dell’ATP, e che questa modifica strutturale porti ad uno spostamento delle eliche che sostituiscono GroES e ad incapsulare il substrato. TRiC può agire anche durante la traduzione per l’avvolgimento di domini proteici in proteine di grosse dimensioni. I substrati più abbondanti di TriC sono l’actina e la miosina, ma le chaperonine citoplasmatiche possono interagire anche con molte altre proteine.

Modelli di folding assistito da chaperones molecolari

• Eucarioti Procarioti
• NAC (complesso associato alla catena nascente) Fattore TRIGGER

Chaperones specifici del citosol

QC II ○

• Cofattori A, B, C, D, E -> assemblaggio della tubulina alfa e beta)
• UCS (Unc-45/Cro1/She4p) -> miosina
• AHSP -> subunità alfa dell'emoglobina A

Chaperones del reticolo endoplasmatico

BiP, GRP94 ○ PDI (Protein-disulfite isomerase) ○

• Le proteine che presenteranno ponti disolfuro saranno proteine dell'ER, proteine di membrana o proteine di altri distretti della via di secrezione o proteine secrete
• Es. BPTI (inibitore pancreatico bovino della tripsina) residui 5 e 55, 30 e 51 e 14 e 38
• Analogo procariotico DSB (disulphide bridge-forming enzymes) che si trovano nello spazio periplasmatico Calnexina e calreticulina ○
• Chaperones QC II (presenti solo nelle cellule deputate alla sintesi delle proteine che coadiuvano):
• HSP47 -> collagene
• Rap -> recettori LDL

Mutazioni degli chaperones molecolari e malattie umane

Mutazione V721 nel dominio equatoriale della chaperonina HSP60 (che ha un ruolo ○ essenziale nella biogenesi mitocondriale -> influenza maggiore nei motoneuroni e nelle cellule muscolari) -> paraplegia spastica ereditaria SPG1 Mutazione geni codificanti la chaperonina TRiC -> sindrome di Bardet-Biedl di tipo 6 ○ (BBS6) Ataxia spastica di Charlevoix-Sangenay (SACS) dovuta alla codifica della proteina sacsin ○ generata da un gene costituito da un singolo esone che ha il dominio N-terminale simile a quello delle HSP90 e quello C-terminale simile a DnaJ Le alfa-crystallins sono membri delle piccole chaperonine e ognuna è formata da 2 ○ subunità alfa-A e alfa-B, la sostituzione di un residuo conservato di arginina nel dominio centrale di ciascuna proteina è responsabile di una patologia:

• R116C nella alfa-A -> cataratta ereditaria
• R120G della alfa-B -> miopatia relativa alla desmina (DRM)

Mutazioni della chaperonina E tubulina-specifica (cofattore, TBCE) -> HRD ○ (iporatiroidismo, ritardo mentale, dismorfismo facciale), sindrome di Sarjad-Sakati, sindrome di Kenny-Caffrey (AR-KCS)

Degradazione proteica

• Struttura di una proteina determina non solo le sue proprietà biologiche ma anche la sua stabilità intracellulare (per esempio la sintesi dell'emoglobina nei reticolociti) • Molte proteine ricombinanti espresse nei batteri non si accumulano perché non essendo glicosilate non assumono la struttura nativa • Velocità di sintesi di proteine anormali >> velocità di degradazione -> aggregati nel citoplasma; le inclusioni vengono trasferite vicino al centrosoma da meccanismi di trasporto mediati da microtubuli • Proteine che presentano motivi conformazionali anormali o amminoacidi ossidati vengono riconosciute dalle proteine E3 (ubiquitina-ligasi) e ubiquitinate; le proteine da eliminare, poliubiquitinate con 4 Ub, vengono trasportate all'interno del proteasoma

Proteasoma (26S)

La proteina viene scissa in peptidi di circa 8 amminoacidi ○ Cilindro centrale cavo (20S) costituito da 4 anelli ciascuno formato da 7 subunità: 7 ○ diversi tipi di subunità alfa e 7 di subunità beta e queste ultime hanno attività proteolitica; nella catalisi intervengono residui di Thr; I 7 diversi tipi di subunità beta hanno specificità differenti (almeno 3) Cappuccio (19S) presente al massimo in 2 copie e ciascuna è formata da 20 subunità e ○ almeno 6 di queste hanno attività ATPasica (svolgono le proteine da digerire, hanno la funzione di cancello, legano e regolano l'ingresso delle proteine da degradare); I cappucci controllano l'entrata inducendo cambiamenti conformazionali nelle subunità alfa

Marcatura delle proteine da degradare con poliubiquitina

• C-terminale di Ub viene attivato da un legame tioestere con E1 ○
• Ub viene trasferita su E2 (che formano complessi con E3-ligasi di cui esistono 500 forme ○ che riconoscono un segnale differente sulle proteine da degradare)
• I complessi E2-E3 trasferiscono Ub su catene laterali di Lys nella proteina bersaglio ○
• A questa Ub ne viene legata una seconda da Ub-esopeptidasi che legano la nuova Ub ○ alla Lys 48 della Ub precedente - > catene di Ub

E3-ligasi

• 500 e esistono 2 famiglie: ○
• Quelle con dominio HECT; in questo gruppo Ub viene trasferito da E2 a una cisteina conservata del dominio HECT
• Quelle con dominio RING finger; sono le più numerose e non sembra formino necessariamente un tiostere con Ub

Possono essere modulate da: ○

• Compartimentalizzazione
• Degradazione indotta da segnali
• Dimerizzazione
• Fosforilazione
• Acetilazione
• Modifiche dovute al legame con altre proteine della famiglia di Ub come SUMO o NEDD8

Esopeptidasi

• K11 e K63 (altre conseguenze) K29 e K48 (degradazione) ○

La via UPP (Ubiquitina - proteasoma)

• Proteine da degradare portano 4 Ub legate l'una all'altra con K48 ○
• Il cappuccio stacca la Ub, lega la proteina, che denatura utilizzando ATP e la fa passare ○ nel 20S

È regolata da fattori: ○

• Positivi: CHIP (E4 che interagisce con la E3 e aumenta la sua attività)
• Negativa:
• 2 classi di DUBs:
• Ubiquitin-C-terminal hydrolases
• Proteasi specifiche per l'ubiquitina
• Proteine che mascherano il substrato (Rad23)

E3 -> proteine citosoliche mal avvolte

che provengono dal reticolo endoplasmatico; E2 -> proteine citosoliche mal avvolte in seguito a stress termico • CHIP E3 causa la poliUb di proteine mal avvolte legate da HSP70 o HSP90 + BAG1/BAG6 • Degradazione delle proteine che hanno acquisito la struttura nativa

Degradazione lisosomiale

§ I lisosomi contengono circa 50 enzimi litici compresi alcune proteasi che agiscono a un pH 5,0 (inattivi a pH 7,0) e degradano sostanze che le cellule assumono per endocitosi e costituenti intracellulari racchiusi in vacuoli che si fondono con essi. § In cellule ben nutrite la degradazione lisosomiale non è selettiva ma lo diviene in condizioni di starvation per cui vengono degradate solo le proteine che portano il pentapeptide KFERQ (Lys-Phe-Glu-Arg-Gln). Vengono degradate proteine prodotte prevalentemente da tessuti che si stanno atrofizzando per esempio in risposta al digiuno (fegato, rene, ecc...) ma non da tessuti che non si atrofizzano (cervello, testicolo)

Degradazione di ubiquitina (Ub)

§ Nelle cellule eucariotiche anche la degradazione di proteine a vita breve avviene nel proteasoma e richiede ATP oltre alla marcatura delle proteine da degradare con Ub. La vita media delle proteine dipende dall'amminoacido all'estremità N-terminale e da sequenze interne:

• Proteine con all'estremità N-terminale Asp/Arg/Leu/Lys o Phe emivita = 2-3 min
• Proteine con all'estremità N-terminale Ala/Gly/Met/Ser o Val emivita > 10 ore procarioti; > 20 ore eucarioti
• Proteine con segmenti ricchi in Pro/Glu/Ser/Thr (PEST) sono rapidamente degradate •

Meccanismi di regolazione dei complessi E2-E3

Certe proteine (come le cicline) devono avere emivita breve condizionale ○ In generale i meccanismi di attivazione dei complessi E2-E3 sono:

• Fosforilazione
• Legame di piccole molecole modulatrici
• Legame di altre componenti proteiche

In altri casi compare sulla proteina bersaglio un segnale che la rende riconoscibile per la degradazione; segnali comuni sono:

• Fosforilazione in un sito specifico
• Dissociazione di una subunità da un complesso
• Un taglio proteolitico che crea un'estremità N-terminale destabilizzante •

Degradazione delle proteine nei procarioti, in mitocondri e cloroplasti

In E. coli sono stati identificati 4 sistemi di degradazione proteica che richiedono ATP ○ § ClpAP/XP e Clp/YQ: domini ATPasico e proteasico in subunità differenti § Lon e FtsH: domini ATPasico e proteasico in domini diversi della stessa catena.

Tutti i 4 sistemi hanno proprietà in comune tra loro e con il proteasoma 26S:

• Degradazione dipende dall'idrolisi di ATP
• Formano complessi a molte subunità che delimitano una camera di degradazione. L'ingresso alla camera e quindi la specificità proteolitica è regolata dalle ATPasi
• Producono peptidi di piccole dimensioni (10-15 amminoacidi)

Le proteine a vita breve vengono riconosciute dall'estremità N-terminale (in altri casi le ○ sequenze riconosciute sono al C-terminale) Le proteine danneggiate o non ben avvolte vengono riconosciute attraverso due tipi di ○ segnalazioni:

• Aggiunta di un peptide di 11 amminoacidi detto Tag al C-terminale (processo co-traduzionale)
• Effetto dei polifosfati (in quanto si legano ai ribosomi che alle proteasi Lon)

Alcuni modulatori influenzano globalmente il tipo di substrato selezionato da una certa ○ proteasi ad es. FtsH degrada sia proteine di membrana che citoplasmatiche ma viene diretto verso proteine citoplasmatiche da 2 proteine di membrana FlK ed HflC

Aggregazione proteica e formazione di amiloidi

Aggregazione di proteine specifiche con l'aggiunta di altre componenti proteiche e carboidrati. Caratteristiche:

• Ottiche: birifrangenti, legano molecole come Congo Red
• Morfologiche: lunghe fibre non ramificate, con strutture a twist di pochi nm di diametro
• Diffrazione ai raggi X: strutture a "Cross-beta"; il cuore della struttura è composto da foglietti beta che decorrono perpendicolarmente all'asse della fibra

Formazione

• Malattia di Alzheimer: si formano depositi amiloidi del peptide A-beta in zone extracellulari e della proteina Tau all'interno della cellula
• Morbo di Parkinson: si formano depositi all'interno della cellula e vengono formati dalla proteina alfa-synuclein
• Malattia di Huntington: mutazione nella proteina huntingtin che rende più esteso il suo domino di poliglutammina e perciò facilita la formazione di aggregati
• Mutazioni analoghe producono malattie neurodegenerative comprese le SCAs (malattie da poliQ).

Più che del deposito delle fibre amiloidi sia il processo della loro formazione ad essere tossico (per esempio in un modello di Alzheimer si è visto che erano gli oligomeri del peptide A-beta ad essere tossici e non le fibre amiloidi mature e la stessa cosa è stata vista in un modello di malattia di Huntington)

Motivi strutturali generici delle fibrille amiloidi

• Struttura tipica a croce beta dati da foglietti con struttura beta che decorrono perpendicolarmente all'asse della fibra; la sequenza che forma la croce beta è prodotta da una sequenza amminoacidica che nelle varie molecole si dispone esattamente in registro
• Le forme oligomeriche solubili e le forme protofibrillari sono più tossiche delle fibrille
• Proteine non avvolte o avvolte solo in parte si associano tra loro per formare piccoli aggregati solubili che subiscono un'