Appunti di Biochimica Applicata

L’accumulo degli aggregati può portare all’induzione della risposta all’accumulo di

proteine mal ripiegate (UPR) ed anche all’apoptosi, ma una piccola quantità di aggregati

nel ER è abbastanza bene tollerata, tali aggregati si formano spesso in cellule

ingegnerizzate che codificano proteine da secernere. La necessità del legame con i

gruppi prostetici può essere sfruttata negli esperimenti di terapia genica per far si che la

proteina inserita (ad es. un ormone) venga rilasciata a comando, con un sistema più

semplice rispetto a quello di inserirla nelle cellule della ghiandola a secrezione interna e

quindi di ottenere che la sintesi sia regolata con i sistemi fisiologici. La proteina porta un

frammento (dominio) di legame ad un piccolo ligando seguito da una sequenza tagliata

dall’enzima proteolitico Furina, che risiede nel Golgi. Aggiungendo il ligando, che entra

facilmente nel lume del reticolo, si può indurre la secrezione della proteina

ingegnerizzata nel momento in cui è necessaria la sua presenza.

• ERAD: Endothelial Reticulum Associated Degradation

Le proteine che non hanno assunto la struttura nativa o perché mutate, o perché pur

○ essendo normali, malgrado l’aiuto degli chaperones non hanno assunto l’avvolgimento

corretto, o ancora perché non hanno trovato i giusti “partners” per formare la struttura

quaternaria prevista, vengono esportate nel citoplasma dove gli oligosaccaridi vengono

rimossi da una N-glicanasi che stacca l’oligosaccaride dall’Asparagina. Le proteine

vengono ubiquinate e degradate nel proteasoma.

Malgrado l’intervento degli chaperones molte proteine del ER non riescono ad

○ avvolgersi in modo corretto. Esse sono trasportate nuovamente nel citosol e degradate.

Il trasporto al citoplasma avviene attraverso lo stesso complesso Sec61 utilizzato per

l’ingresso delle proteine al reticolo. Anche in questo caso la segnalazione parte

dall’oligosaccaride. Un enzima, la ER α-mannosidasi I, rimuove dall’oligosaccaride un

singolo residuo di mannosio che è legato all’oligosaccaride con legame α 1,2 glicosidico

dalla catena ramificata nella quale gli altri residui di mannosio sono legati con legame α

1,3. Questo segnale non è sufficiente per la degradazione infatti numerose proteine

mancanti del mannosio vengono trasportate al Golgi. Siccome la mannosidasi lavora

lentamente si pensa che la presenza del mannosio serva a proteggere la proteina da una

degradazione prematura. Quando il mannosio è stato rimosso la proteina ben avvolta

andrà al Golgi, quella non avvolta correttamente potrà essere degradata. Interviene, a

quantopare, una seconda proteina, detta EDEM, capace di legare l’oligosaccaride con 8

Man solo in proteine mal avvolte. EDEM le avvia alla degradazione.Si suppone anche

l’esistenza i molecole deputate a riconoscere ad a destinare al ERAD, proteine specifiche

non avvolte correttamente.

• Risposta all'accumulo di proteine dell'ER mal ripiegate nei mammiferi

La risposta viene innescata da BiP che ha la possibilità di legarsi a proteine della

○ membrana di ER esercitando un ruolo di inibizione. Quando troppe proteine sono mal

avvolte BiP scarseggia e si dissocia dalla membrana dell’ER scatenando la risposta.

Questa è mediata da tre proteine dell’ER che agiscono con meccanismi sinergici.

§ ATF6 è una proteina il cui precursore inattivo si associa con il ER come proteina

transmembranaria di tipo II. Ha un dominio all’N-terminale che può agire da

fattore di trascrizione. La dissociazione di BiP provocata da una proteasi

sitospecifica che agisce su ATF6 liberando nel citoplasma la porzione N-terminale

della proteina. Questo peptide và al nucleo ed attiva la trascrizione portando ad

un aumento nella sintesi degli “chaperones”.

§ PERK una k inasi residente nel ER, fosforila eIF2α, e quindi limita

temporaneamente la velocità di sintesi proteica e di conseguenza la necessità di

chaperones. Nel caso in cui il proteasoma non riesca a far fronte alla situazione, la

fosforilazione di eIF2α indurrà l’apoptosi. Questo meccanismo è alla base

dell’insorgenza del diabete di tipo II.

§ Ire 1 (inositol-requiring enzyme 1) è la k inasi omologa a quella identificata anche

nel lievito. Questa k inasi, dopo dimerizzazione, acquista attività endonucleasica ed

attiva la trascrizione inducendo un diverso meccanismo di maturazione degli

mRNA. Ire 1 causa la rimozione di un introne nell’mRNA di HAC1, questo mRNA

allora viene tradotto con maggiore efficienza e forse la proteina prodotta risulta

modificata. La proteina codificata da HACI è un fattore di trascrizione. Questo a

sua volta attiva la sintesi del fattore di trascrizione XBP1, che aumenta la

produzione di fattori che portano alla ERAD. L’attivazione di XBP1 è più lenta

dell’aumento nella concentrazione di chaperones, infatti la sua sintesi richiede una

cascata di attivazioni, mentre la sintesi degli chaperones avviene direttamente, in

seguito all’attivazione di ATF6. In questo modo i tentativi di rinaturare le proteine

precedono la decisione di eliminarle .

• Aggiunta di un'ancora GPI ad una proteina dell'ER

Mentre alcune code lipidiche vengono aggiunte a proteine solubili nel citoplasma, le

○ ancore di glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI), vengono aggiunte nel ER. Le proteine con

ancore GPI, destinate alla membrana plasmatica, possono essere rilasciate nel citosol in

risposta a segnali che attivano la fosfolipasi C. Queste proteine hanno all’estremità C-

terminale una sequenza idrofobica transmembrana. Un enzima taglia la proteina e

sposta la parte solubile ad un intermediario preformato sul GPI, legandolo al gruppo

NH2 di una fosfoetanolamina.

• Sintesi di fosfatidilcolina a livello dell'ER

La sintesi dei fosfolipidi che faranno parte delle membrane biologiche avviene a livello

○ delle membrane del ER ed è catalizzata da enzimi con sito attivo rivolto verso il

citoplasma. La sintesi avviene dunque esclusivamente sul foglietto citosolico. Il lipide

sintetizzato in maggior quantità è la fosfatidilcolina.

• Ruolo delle "flippasi" nella formazione delle membrane biologiche

Dal momento che la sintesi dei lipidi avviene sul versante citoplasmatico i lipidi vengono

○ inseriti nel foglietto della membrana che guarda verso il citoplasma. Una scramblasi

catalizza il trasferimento anche sull’altro versante della membrana. Un tipo diverso di

trasportatori. Una ATPasi di trasporto del tipo ABC catalizza lo spostamento specifico dei

fosfolipidi creando l’assimmetria del doppio strato lipidico. Trasporta infatti sul versante

citoplasmatico fosfatidilserina e fosfatidil-etanolamina. Scramblasi e flippasi sono

presenti anche nelle membrane plasmatiche.

• L'ER rifornisce di lipidi anche le membrane dei mitocondri, dei plastidi e dei perossisomi

Le membrane del ER, del Golgi, dei lisosomi, degli endosomi e le membrane plasmatiche

○ comunicano tramite vescicole e quindi I lipidi sintetizzati nel ER arrivano facilmente in

questi distretti. Le membrane di altri organelli non sono collegate dal trasporto di

vescicole ma ricevono egualmente lipidi grazie all’esistenza di proteine trasportatrici,

solubili in soluzioni acquose chiamate “proteine di trasferimento dei fosfolipidi”.

Ciascuna di queste proteine riconosce soltanto un tipo specifico di fosfolipide, lo estrae

da una membrana e lo rilascia in un’altra membrana. Il trasporto riguarda fosfatidilcolina

e fosfatidilserina. Dalla fosfatidilserina i mitocondri ottengono la fosfatidiletanolamina

per decarbossilazione.

Trasporto mediato da vescicole

• Trasporto mediato da vescicole

Il traffico di vescicole è bidirezionale; oltre alle vescicole di trasporto che distribuiscono il

○ materiale proveniente dall’ER ci sono vescicole che riportano indietro le molecole che

devono fungere da trasportatori, e molecole eventualmente sfuggite ai controlli.

• Vescicole di trasporto

Le vescicole gemmano da un compartimento e si fondono con un altro, trasportando

○ come ”cargo” delle molecole presenti in forma solubile nel compartimento di partenza.

Il flusso di vescicole scorre in modo altamente organizzato in percorsi predeterminati. In

questo modo la cellula può dirigere delle molecole in compartimenti specializzati come i

lisosomi, o alla secrezione. Il flusso è sempre bilanciato con vie di recupero che riportano

al compartimento di origine le membrane e delle componenti specifiche. Questo

riciclaggio permette che il viaggio si ripeta dopo una nuova selezione del “cargo” .

• Compartimenti cellulari collegati dal traffico di vescicole

Nella via secretoria molecole sintetizzate dalla cellula vengono trasportate all’esterno o,

○ passando dagli endosomi tardivi, vanno ai lisosomi. Nella via endocitotica molecole

provenienti dalla membrana, o dall’esterno, vengono trasportate agli endosomi precoci

e da qui vengono riciclate alla membrana, o vengono destinate alla degradazione e

portate ai lisosomi. Il flusso retrogrado riporta delle componenti dagli endosomi tardivi

al Golgi e dal Golgi all’ER.

• Mantenimento della differenza nella composizione dei diversi compartimenti

Le differenze tra i compartimenti cellulari, come abbiamo visto anche per altri

○ compartimenti come nucleo e mitocondri, dipendono innanzitutto dalle componenti

della membrana che li delimitano. I marcatori molecolari presenti sulla faccia citosolica

delle membrane delle vescicole, servono da segnali di guida anche per il traffico

vescicolare ed assicurano che le vescicole si fondano solo con le membrane del

compartimento al quale sono destinate. Singoli marcatori si trovano però sulle

membrane di più organelli, è quindi la composizione complessiva, l’insieme dei

marcatori di membrana, che definisce ciascun organello ed indica l’indirizzo specifico al

quale le vescicole in transito sono destinate. Perché marcatori di membrana vengono

mantenuti ad alta concentrazione su vescicole, che provengono da un compartimento e

a bassa concentrazione su un altro tipo di membrane, è necessario che le vescicole

gemmino da domini di membrana con composizione specifica. Le proteine di membrana

devono quindi essere localizzate in domini separati. Questi, a loro volta, vengono creati

dall’interazione di proteine transmembrana con un rivestimento proteico di

composizione particolare che, in quel distretto cellulare, si addensa sulla faccia citosolica

della membrana.

• Siti di partenza per le vescicole dirette al Golgi

I siti dell’ER da cui partono le vescicole sono detti tER, sono distribuiti in varie zone della

○ cellula e sono piuttosto stabili