Alimentazione e promozione della salute, parte 1: metodologia

ED INCIDENZA DI MALATTIE CRONICHE

Valutare l'aderenza alla dieta mediterranea significa classificare la popolazione sulla base di abitudini relative ai consumi legati alla dieta mediterranea, e dare un punteggio in funzione del consumo di questi principali gruppi alimentari. Quindi si tratta di aderenza di un profilo di consumo.

In questo caso sono stati identificati 12 studi di coorte che valutano l'aderenza alla dieta mediterranea in relazione con il rischio di malattia o la mortalità.

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Questa metanalisi considera tutte le cause di mortalità, ci sono studi con maggiore numerosità che hanno un intervallo di confidenza minore. Il diamante ha un valore di 0.91 e un intervallo di confidenza tra 0.89-0.94. C'è un effetto moderatamente protettivo del 9% (non raggiunge l'1).

Nella stessa pubblicazione è stata fatta una sotto-analisi per la mortalità CV, tumore, Parkinson ed Alzheimer.

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Utilizzo di

colture cellulari in ambito nutrizionale La cellula è la più piccola parte di un organismo capace di esprimere tutte le proprietà vitali dell'organismo stesso. Essa ha diverse funzioni: - Metaboliche: assunzione di nutrienti e loro utilizzazione, accrescimento, eliminazione di scorie metaboliche - Motilità: capacità di spostarsi nell'ambiente - Adattamento all'ambiente: modificazione fenotipiche che selezionano le cellule più adatte a sopravvivere in determinate condizioni ambientali - Riproduzione: ampliamento della popolazione. Le colture cellulari sono insiemi di cellule, generalmente dello stesso tipo, ma esistono anche le co-colture (con più di un tipo cellulare), che possono essere derivanti da tessuti o isolate da fluidi biologici (sangue). Le cellule vengono coltivate per tempi più o meno lunghi al fine di verificare la loro funzionalità e comportamento in diverse condizioni sperimentali o in seguito a

trattamenti di vario tipo. Esse quindivengono utilizzate per vedere l'effetto di un determinato composto presente in un alimento,ovviamente è impossibile utilizzare l'alimento stesso, quindi si utilizza un estratto o un componentele frazioni di componenti bioattivi vengono messe a contatto con le cellule, per studiare il loro possibile ruolo. Es. si è visto come i polifenoli agiscono sul NF-kB, riducendo il processo di infiammazione e il processo di adesione dei monociti alle cellule endoteliali. Quindi utilizzo singolicomponenti o estratti, per studiare il meccanismo di azione della cellula.

Allestire una coltura cellulare non è semplice, occorre rispettare diverse regole.

Caratteristiche dei locali

Il locale in cui vengono allestite le colture cellulari deve essere un ambiente dedicato: dovrebbe essere isolato dalle altre stanze da almeno una porta, per mantenere un certo grado di sterilità.

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L'atmosfera nella stanza delle

colture dovrebbe essere in pressione positiva, cioè ad una pressione leggermente maggiore che non nel resto del laboratorio, in modo da fare eventualmente uscire aria dalla stanza ma non entrare. Le dimensioni del locale devono essere adeguate per potere accogliere tutto l'equipaggiamento necessario. La collocazione perfetta sarebbe quella in cui tra le due porte ci fosse sufficiente spazio da poterlo usare come spogliatoio, in cui togliersi i camici da usare nel resto del laboratorio e indossare quello dedicato alle colture.

Il pavimento dovrebbe essere in materiale non poroso, facile da pulire, di colore chiaro in modo da rivelare facilmente macchie dovute a residui caduti. L'accesso deve essere limitato esclusivamente alle persone autorizzate e adeguatamente formate.

Le finestre dovrebbero essere grandi in modo da garantire una buona illuminazione con luce naturale, ma non devono mai essere aperte, per evitare di fare entrare aria esterna carica di contaminanti.

Cappe sterili

a flusso laminare. Le cappe devono essere sterili a flusso laminare, l'aria sterile viene aspirata dall'esterno, passa sotto il piano in cui si trova la coltura cellulare, arriva in alto, dove viene filtrata da dei filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air). La cappa laminare ha un doppio obiettivo: - Proteggere l'operatore dal rischio di infezione (es. a volte si maneggiano cellule tumorali o cellule provenienti dall'uomo) - Proteggere il campione dall'operatore e dall'ambiente, mantenendo un ambiente sterile. Incubatori. Le cellule devono essere incubate, occorre usare incubatori che mantengano una crescita ottimale a una temperatura di circa 37°C, e normalmente si utilizzano terreni di coltura a pH neutro o leggermente alcalino (7.0-7.2). La presenza di un'atmosfera ad elevato grado di umidità, grazie all'erogatore di O2 e CO2, previene l'evaporazione del terreno e la morte delle cellule. Sono necessari pertanto incubatori in

grado di controllare sia la temperatura che la miscela di gas: di solito si opera a 37°C con il 95% di aria e il 5% di CO2, mentre l'umidità viene mantenuta da una vaschetta d'acqua posta sul fondo dell'incubatore. Anche nell'incubatore si deve mantenere un certo grado di sterilità, riducendo il più possibile la presenza di contaminanti esterni si devono utilizzare antibatterici, es. benzalconio (miscela di ammonio quaternario con attività antibatterica).

L'attività cellulare tende ad acidificare il mezzo (terreno), pertanto è necessario tamponare. Un sistema molto usato è il tampone bicarbonato/CO2 che richiede un apporto di CO2 nell'incubatore e bicarbonato nel mezzo. Per avere un'indicazione visiva del pH, i terreni vengono addizionati di rosso fenolo, un indicatore che ha un colore rosso-arancio a pH 7.3, vira al giallo-arancio a pH acido e al rosso viola a pH alcalino.

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cellule in vita hanno una loro attività che genera metaboliti, che→tendono ad acidificare il terreno, e rendono necessaria una sua sostituzione (almeno ogni 2-3 giorni). È buona norma pulire e controllare frequentemente gli incubatori. Nel caso di inquinamento delle colture, è necessario eliminare velocemente le fiasche contaminate e decontaminare l'incubatore. Anche gli strumenti da utilizzare devono essere sterili: pipette, flasks, piastre, provette, etc.

Medium di coltura

Tutti i terreni base disponibili contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule. I medium di coltura sono tanti, e differiscono per la concentrazione di amminoacidi (che servono per la sintesi delle proteine, e quindi per la crescita cellulare) e di sali, oltre che per la concentrazione di glucosio. Contengono poi sali inorganici e vitamine. Il terreno base viene conservato a 4°C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con glutammina.

(amminoacidoessenziale molto labile è una delle fonti principali di carbonio per molte cellule in coltura), antibiotici(penicillina/streptomicina) e siero (supplemento più comune delle colture cellulari, il più utilizzato è il FBS, siero fetale di bovino). I più comuni terreni base di coltura sono: - MEM: Minimum Essential Medium - DMEM: Dulbecco’s modification of MEM - RPMI: Roswell Park Memorial Institute. Sistemi di crescita Esistono diverse tipologie di coltura cellulare: - Cellule in adesione, che tendono a crescere formando una sorta di mosaico, essendo in vivo parte di tessuti solidi (es. cellule epitelio intestinale e cellule endoteliali) - Cellule in sospensione, di solito di origine ematopoietica, che normalmente vivono in un letto fluido, es. monociti o linfociti. Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni Per prevenire le contaminazioni occorre seguire alcune regole: 1. I terreni e le soluzioni che si usano devono

• Essere tutti sterili
• Aggiungere penicillina-streptomicina per scongiurare il pericolo di contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le cellule) contro i miceti
• Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari
• Operare sempre sotto cappa a flusso laminare
• Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica)
• Utilizzare sempre pipettatorielettrici
• Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro
• Controllare periodicamente i filtri della cappa
• Mantenere con attenzione ben pulito l'incubatore a 37°C (pericolo miceti e micoplasmi)

Utilizzo delle colture cellulari in ambito nutrizionale: vantaggi vs svantaggi

VANTAGGI

• Sistemi semplificati e altamente riproducibili
• Un sistema semplificato ci permette di valutare con facilità i meccanismi cellulari e molecolari
• Elevato controllo sperimentale coltivo io le cellule, l'ambiente è controllato, quindi rispondono alle condizioni sperimentali in cui si trovano, e non risentono

di fattori esterni- Rispetto ad altre tipologie di modelli (es. uomo) sono più economici e hanno una certa rapidità di risposta. La risposta della cellula a un determinato componente è abbastanza immediata (nel giro di una settimana si riesce a fare l'esperimento).- Dispongo di tante tipologie di cellule, esistono banche dati in cui le cellule possono essere acquistate. SVANTAGGI- Si tratta di un sistema molto semplificato rispetto a un organismo completo. Non posso testare un alimento in un sistema cellulare, perché la cellula non se ne fa nulla dell'alimento, in quanto non è in grado di scomporlo. Quindi posso testare un singolo componente, o una miscela di componenti. Tuttavia, non ci nutriamo di singoli componenti.- Le condizioni di esposizione alle sostanze sono diverse da quelle in vivo.- Si lavora con concentrazioni di componenti superiori alla concentrazione fisiologica (concentrazione circolante nel plasma di persone che...

assumono un determinato alimento)

Laila Pansera - 71- Difficoltà a correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo spesso si lavora in condizioni farmacologiche, ma ad oggi si tende ad utilizzare composti in dosi vicine a quelle fisiologiche, per avvicinarsi a quella che è la realtà. In alcuni casi i componenti svolgono il loro effetto solo a dosi elevate però, es. resveratrolo, che per ottenere i suoi effetti di potente antiossidante, deve essere assunto in grandi quantità, che si scontrano con le indicazioni nutrizionali sull'alcol- Le sostanze che si utilizzano nei terreni di coltura, possono interagire con essi, es. i polifenoli una volta inseriti nel terreno, cambiano la loro struttura conformazionale. In questo caso però una cosa analoga succede nel nostro organismo: fino allo stomaco, con pH acido sono stabili, a livello intestinale iniziano a subire delle modificazioni.

Tipi di colture cellulari