Spettrometria di massa - Cromatografia - Gascromatografia - HPLC

La spettrometria di massa

La spettrometria di massa misura i pesi delle molecole con un’accuratezza maggiore.

Elettroforesi

Tecnica che sfrutta la diversa mobilità delle molecole in un campo elettrico. Serve per distinguere le molecole grazie al loro peso molecolare. Ha un errore di circa il 10%.

Utilizzi della spettrometria di massa

• Indicare prodotti ignoti
• Determinare quantitativi di composti noti
• Chiarire le proprietà strutturali e chimiche delle molecole
• Pesare i complessi di tante molecole

La prima applicazione è stata fisica, utilizzata per individuare gli isotopi. Ad oggi viene usata per rilevare gli antibiotici. Misura il rapporto massa/carica (m/z) degli ioni. L’unità di misura per la massa delle molecole è il Dalton (1Da = 1/12 della massa di 1 atomo di C).

La carica elettrica può esistere solo come multipli interi della carica elementare, che è quella di un elettrone o di un protone. La carica di uno ione è espressa come il numero z di cariche elementari. Tutti gli spettrometri hanno 2 componenti fondamentali che devono essere sempre presenti (sorgente di ioni e analizzatore), perché la spettrometria non funziona con le molecole neutre, ma ha bisogno degli ioni, che poi devono essere separati dall’analizzatore. Poi molto importante è il rivelatore.

In realtà lo spettrometro non pesa la massa ma il rapporto m/z.

Parametri che cambiano in funzione della tipologia di analizzatore

Il dato di spettrometria di massa deve dare:

• Elevata sensibilità, cioè si deve riuscire ad andare ad analizzare analiti che sono presenti in un campione alimentare a concentrazioni basse.
• Risoluzione elevata, si vuole avere la possibilità di discriminare analiti che hanno una massa molto simile.
• Accuratezza, si vuole la possibilità di avere una m/z misurata dallo strumento che sia il più vicino possibile a quella che è la massa teorica attesa per quell’analita.

Processi che avvengono

• Produzioni di ioni e frammentazione: avviene dando energia alle molecole in modo da creare gli ioni, ma se si dà troppa energia le molecole si frammentano, e grazie ai loro singoli pesi molecolari si può ricostruire la molecola iniziale.
• Separazione degli ioni in base al rapporto m/z
• Rivelazione

Introduzione del campione

I composti solidi (sali, proteine) vengono posti sulla sommità di una sonda che viene introdotta nella camera da vuoto. Il campione viene quindi evaporato o sublimato in fase gassosa, in genere riscaldandolo. Gas e liquidi possono essere introdotti mediante speciali sistemi di introduzione con un flusso controllato (siringa). Oppure, si può usare la cromatografia. Per ottenere lo spettro di massa di un singolo composto presente in una miscela, i vari componenti devono essere separati prima dell’analisi. La separazione è importante per poter avere un’identificazione sicura in quanto due composti presenti contemporaneamente nella sorgente danno luogo a segnali sovrapposti difficili da distinguere.

La gascromatografia (tecnica che sfrutta il trasporto attraverso un gas (H₂, He₂) di composti volatili) viene impiegata per separare miscele in fase gassosa o vapore; questo permette di poter introdurre il campione in fase vapore così che i componenti di una miscela possono essere separati e analizzati sequenzialmente.

Sorgente: ionizzazione

In base al campione bisogna usare una sorgente di ionizzazione diversa:

• A impatto elettrico (EI) ➔ Si possono analizzare solo le molecole volatili
• A ionizzazione chimica (CI)
• A bombardamento con atomi veloce (FAB)
• Di campo (FI)
• Per desorbimento mediante plasma (PD)
• Per desorbimento mediante laser (LD)
• Per desorbimento con laser assistito da matrice (MALD) ➔ Si può determinare il peso
• Mediante elettro spray (ESI) o elettro nebulizzazione molecolare di qualsiasi molecola

A impatto elettrico

Una molecola viene bombardata da un fascio di e prodotti da un filamento riscaldato. Dopo l’impatto con e a 70 eV la molecola gassosa può perdere uno dei suoi e e diventare un radicale ionico caricato positivamente. Questa tecnica è molto energetica, e ci può essere il rischio di frammentare la molecola. Porta un elettrone spaiato e può occupare vari stati elettronici e vibrazionali eccitati, che portano alla formazione di frammenti ionici e particelle neutre. Il tipo di frammentazione dello ione molecolare dipende dalla struttura della molecola e strutture simili danno spettri di massa simili. Questa tecnica può essere usata solo fino a 500-600 Da.

A ionizzazione chimica

Produce ioni attraverso un processo di trasferimento di un protone. Le molecole di campione vengono esposte a un forte eccesso di un gas reagente ionizzato. Il trasferimento di un protone a una molecola M del campione da parte di un gas ionizzato produce uno ione positivo. Si possono ottenere anche ioni negativi. Il trasferimento di un protone da parte di M verso altri tipi di ioni reagenti provoca la formazione di ioni negativi. La cattura di un e da parte di M può fornire anche un intenso ione M^-. Tali ioni vengono utilizzati per determinare con elevata sensibilità particolari specie.

A bombardamento con atomi veloci

Il campione viene disciolto su un’appropriata matrice, con un solvente viscoso in modo da mantenere il campione in uno stato liquido. Inoltre, riduce i danni all’analita causati dal bombardamento di particelle ad alta energia. Viene effettuata bombardando la soluzione liquida dell’analita con atomi di C⁺.

Di campo

Il campione è allo stato di vapore e le molecole vengono sottoposte ad un intenso campo elettrico. Gli elettroni di legame più esterni sono sottoposti a forze con energia sufficiente a rimuovere un elettrone. Si forma così il radicale cationico che può essere analizzato.

MALD

Si mette il campione a contatto con una matrice che assorbe energia alla lunghezza d’onda del laser. Per azione del laser si verificano delle piccole microesplosioni che portano la molecola in fase gassosa, sia quella della matrice che della soluzione campione. Con questa tecnica si è in grado di rilevare biomolecole grandi oltre 300,000 Da. La matrice si carica positivamente e trascina via l’analita, e gli trasmette la carica. La molecola target, in questo modo, acquisisce 1 solo protone, quindi l’analisi è molto semplice.

ESI

È una tipologia di ionizzazione che permette di interfacciare un sistema cromatografico di separazione degli analiti allo spettrometro di massa. Viene utilizzato un gas (di solito azoto) per produrre la nebulizzazione. C’è un capillare metallico al cui interno arriva una soluzione del campione. Sulla punta del capillare vi è un campo elettrico di 4000-5000 volt. Le cariche negative restano attaccate al capillare. Sulla faccia opposta del capillare c’è un polo carico negativo che attira gli ioni positivi che si sono prodotti. Le temperature e l’energia non sono stato elevate da distruggere le molecole. Per effetto della temperatura e del flusso di azoto, il solvente evapora e la concentrazione di carica alla superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale. Si formano ioni dell’analita privi di solvente. Le cariche sono statisticamente distribuite tra i siti disponibili dell’analita, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple. Siccome ogni misura di spettrometria di massa è una misura del rapporto m/z ne consegue che all’aumentare di z, il rapporto m/z diminuisce e quindi possono essere analizzate anche sostanze con un’elevatissima massa molecolare.

Analizzatore

È un sistema per separare i diversi valori di m/z, generando un campo elettrico o magnetico. Utilizza metodi di dispersione o di filtro per separare gli ioni sulla base del rapporto massa/carica:

• Settori magnetici ed elettrici
• Quadrupoli sistema con 4 barre che genera un campo elettrico
• Trappola ionica
• FT-ICR
• TOF tempo di volo (il più usato)
• Orbitrap

Settori magnetici

Sono calamite enormi che servono a dare un’altissima risoluzione. Deviano le traiettorie degli ioni in percorsi circolari il cui raggio dipende dal rapporto momento/carica dello ione. Ioni con m/z più elevato seguono traiettorie di raggio più ampie rispetto a quelle con m/z più basso, così che ioni con differenti valori di m/z vengono dispersi nello spazio. Cambiando le traiettorie degli ioni mediante variazioni del campo magnetico, ioni di diverso rapporto m/z possono essere focalizzati sul rivelatore.

Settori a doppia focalizzazione

Utilizzano la combinazione di campi magnetici ed elettrici per separare gli ioni. Lo scopo del settore elettrostatico è quello di focalizzare gli ioni avendo lo stesso valore di m/z, ma con una distribuzione non omogenea di energia cinetica. La fenditura agisce da filtro per selezionare uno specifico rapporto m/z. La doppia focalizzazione consente una risoluzione abbastanza elevata per separare gli ioni aventi la stessa massa nominale, ma differente composizione chimica.

Filtro di massa a quadrupolo

Chiamato anche setaccio molecolare, consiste di quattro poli o barre di acciaio disposte parallelamente. L’analisi di massa dipende dal moto degli ioni risultante dall’applicazione di una combinazione di campi elettrici continui e alternati a radiofrequenza. Offrono una risoluzione inferiore, ma sono più facilmente collegabili a diversi sistemi di introduzione del campione, e hanno un costo inferiore. Solo gli analiti in risonanza con il quadrupolo possono attraversarlo, gli altri vengono setacciati via.

A trappola ionica

Opera su un principio simile a quello del quadrupolo, però esso non agisce da filtro, ma permette agli ioni di attraversare il campo quadrupolare. La trappola ionica può trattenere tutti gli ioni al suo interno per successivi esperimenti. Essa usa campi generati da radiofrequenze applicati agli elettrodi disposti a sandwich con un elettrodo anulare nel centro e due “coperchi” sopra e sotto di esso. Il dispositivo intrappola nello spazio tra gli elettrodi gli ioni aventi un dato intervallo di rapporti m/z, determinato dai potenziali applicati. È molto usata per l’analisi delle diossine negli alimenti. Lo spettro viene prodotto variando il potenziale a radiofrequenza in modo da espellere sequenzialmente verso un rilevatore gli ioni secondo un ordine di rapporto m/z crescente (escono prima quelli più leggeri), attraverso un’apertura pratica in un elettrodo “coperchio”.

Spettrometro a risonanza ionica ciclotronica in trasformata di Fourier (FT-ICR)

Gli ioni vengono intrappolati elettrostaticamente in una cella cubica posta all’interno di un campo magnetico costante. L’applicazione di un impulso a radiofrequenze tra due piastre della cella, che fungono da trasmettitore, induce un moto orbitale. Tali ioni generano un debole segnale “immagine” che viene raccolto dalle piastre della cella che agiscono come ricevitore. La frequenza del segnale generato da uno ione è inversamente correlata al suo rapporto m/z. L’intensità del segnale per una data frequenza è proporzionale al numero di ioni aventi il corrispondente valore di m/z. Il segnale totale viene amplificato e scomposto nelle varie componenti di frequenza generando così lo spettro di massa.

A tempo di volo (TOF)

Spesso si usa in abbinamento al MALD. Separa gli ioni in virtù del tempo da essi impiegato per percorrere una certa distanza nota. Un pacchetto di ioni (che non hanno la stessa velocità) viene emesso da una sorgente in un tempo molto breve; gli ioni vengono accelerati a un’energia cinetica costante e focalizzati verso un “tubo di volo”. A seconda del tempo di arrivo si può determinare il peso. Dato che l’energia cinetica è data da mV²/2, minore sarà la massa dello ione, maggiore sarà la sua velocità. Il tempo impiegato per percorrere il tubo viene misurato in microsecondo, e questo tempo viene trasformato nel valore di massa dello ione. Gli spettrometri di massa TOF offrono elevata sensibilità e elevata velocità di analisi, dato che per ogni “pacchetto” vengono rilevati tutti gli ioni che lo compongono.

Orbitrap

Gli ioni mobili sono intrappolati in un campo elettrostatico dove iniziano a ruotare su traiettorie ellittiche attorno all’elettrodo interno. L’aumento del campo elettrostatico induce la formazione di ioni ad anello che si muoveranno avanti e indietro lungo l’asse del cilindro centrale. È la traiettoria che viene trasformata nel risultato finale (m/z). Analiti diversi con diversa m/z avranno diverse traiettorie di oscillazioni. Permette di avere un’informazione qualitativa unica, di campioni che sono rappresentati in tracce all’interno dell’alimento. Spesso si può usare il quadrupolo prima dell’orbitrap, che funge da filtro di massa, cioè fa sì che alcune molecole vengano eliminate mentre altre giungono all’orbitrap. Si ottiene un’elevata accuratezza, con anche il vantaggio legato alla tracciabilità.

Rivelatore

Negli spettrometri di massa gli ioni vengono rilevati dopo essere stati separati, trasformando l’energia prodotta dalla collisione degli ioni sulla superficie del rivelatore, in modo da provocare l’emissione da parte di essa di altri ioni, elettroni. La rivelazione degli ioni negli strumenti FT-ICR, in cui gli ioni orbitanti generano un segnale che si ripete nelle piastre del ricevitore, costituisce un’eccezione. Nelle camere dello spettrometro di massa viene fatto un vuoto spinto perché se ci fossero molecole di aria urterebbero gli ioni, che cambierebbero traiettoria.

Sistema di elaborazione

Un calcolatore è praticamente indispensabile per il controllo dello spettrometro di massa e per l’acquisizione, memorizzazione e presentazione degli spettri. I sistemi di elaborazione dati presentano programmi per l’analisi quantitativa, l’interpretazione degli spettri e l’identificazione di composti mediante ricerca di banche dati di spettri.

Analisi strutturale

Uno spettro di massa consiste in un diagramma di abbondanza ionica in funzione del rapporto m/z. Gli ioni e la loro intensità relativa permettono di stabilire peso molecolare e struttura del composto in esame. Un’altra informazione per determinare la composizione molecolare si ottiene dalla misurazione di masse accurate. Ogni isotopo di ogni elemento ha una carica caratteristica, non intera. Misure di massa accurate consentono la determinazione della composizione chimica.

Applicazioni della spettrometria di massa

• Identificazione e caratterizzazione strutturale delle molecole
• Modificazione post-traduzionale delle proteine
• Varianti genetiche delle proteine
• Modificazioni di proteine in seguito a trattamenti tecnologici

Proteina incognita

La prima informazione che si ottiene è il PM. Viene fatta digerire (idrolisi proteolitica) da un enzima specifico, ad esempio la tripsina che riconosce l’arginina e la lisina; si misurano tutte le masse ottenute e la loro somma sarà caratteristica della proteina che dipende dalla sequenza degli amminoacidi. Se si ha un’idea della proteina, per confermare, si impone al software di tagliare la proteina con tripsina (o con un altro enzima) e si ottengono frammenti teorici di cui il software calcola i PM teorici.

Calcolo “manuale” della massa esatta di una proteina

M+n M+n+1x = e x =1 2n n+1x e x sono due valori di m/z adiacenti, ed n è il numero di protoni preso da ciascuna specie. Si tratta di un sistema lineare in due incognite (M e n). Risolto il sistema si ottiene il valore di M, cioè la massa molecolare della proteina. Ci sono dei software che elaborano automaticamente il sistema di equazioni. Dato che la molecola deve essere ionizzata, più è grande minore è la capacità di ionizzazione. Quindi, anche se si possono analizzare intere proteine, spesso si preferisce analizzare i peptidi. Man mano che aumenta la massa dei peptidi diminuisce l’intensità.

Cromatografia

Può essere divisa in 2 grandi rami in base alla fase mobile (liquido o gas). Serve per separare i componenti di una miscela complessa. Se la fase mobile è gassosa si parla di gascromatografia (GC). Se la fase mobile è liquida si parla di cromatografia liquida (LC).

Legame ione-dipolo: L’ossigeno è parzialmente negativo, mentre l’idrogeno è parzialmente positivo. Un composto ionico (NaCl) quando viene circondato da molecole di acqua si dissocia in Na⁺ e Cl^-, perché si legano con le cariche di segno opposte dell’acqua. Questo è il motivo del perché il sale si scioglie in acqua.

Legame dipolo-dipolo: Avviene tra le molecole in cui l’idrogeno è legato ad un atomo elettronegativo (HCl). Dato che in queste molecole c’è l’idrogeno, che è positivo, le fa legare all’ossigeno o al Cl di un’altra molecola. Le molecole di H₂O si attraggono tra loro, formando un legame dipolo-dipolo. Questo tipo di legame è più debole del legame covalente, ma è abbastanza forte da permettere all’acquisto di rimanere solido a temperatura ambiente.