Spettrometria di massa - Cromatografia - Gascromatografia - HPLC

ISOTERMA DI ADSORBIMENTO:

Il coefficiente di distribuzione k = C / C dovrebbe essere costante e indipendente dalla concentrazione del soluto (isoterma di equilibrio). Se così fosse avremmo bande simmetriche di forma gaussiana.

Nelle colonne reali, tuttavia, k cambia all'aumentare della concentrazione del soluto e le bande si presentano codate. Per ogni gas è possibile avere dei grafici di vanDeemter diversi, e quindi anche minimi diversi. Questo permette di scegliere la velocità migliore, ma anche il tipo di gas che dà il minimo più minimo.

Ad esempio, da molte prove è stato visto che gas ottimi per fare la fase mobile sono l'azoto, l'elio o l'idrogeno.

I fenomeni che sono dovuti all'allargamento dei picchi sono:

• Tailing (scodamento): il tracciato sale bruscamente e raggiunge il suo massimo per poi scendere lentamente verso la linea di base. Si verifica quando la fase stazionaria si satura e l'analita

tende a scappare con la fase mobile. k tende a diminuire all'aumentare della concentrazione del soluto. → Fronting si verifica perché la fase mobile si satura del soluto e non riesce a staccare altre quantità di soluto dalla fase stazionaria. k tende ad aumentare all'aumentare della concentrazione del soluto.

Tipo di matrici utilizzate: La matrice serve a sostenere e a tenere la fase stazionaria ferma, oppure è la fase stazionaria stessa. Quindi è un supporto. → AGAROSIO è un polisaccaride derivante da particolari alghe rosse, costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose CL (cross-linking con 2,3-dibromopropanolo), superiore, Bio-Gel A. Limiti di esclusione 10 - 40000 kD. Può essere usato per la cromatografia a esclusione molecolare. (l'agar è un additivo, è usato come addensante ma anche per stabilizzare le

di affinità (antigene e con anticorpo).

SCELTA DELLA FASE ADORBENTE (per la cromatografia di adsorbimento): Usato per la rimozione di impurità

SCELTA DELLA FASE MOBILE: → Serie eleutropica potere di eluire dalla fase stazionaria. Si basa sulla polarità.

Nella cromatografia liquida le fasi mobili sono molte, possono essere anche delle miscele.

Cromatografia su strato sottile (TLC)

La cromatografia su strato sottile opera con gli stessi parametri visti per la cromatografia su colonna. In questo caso la fase stazionaria è supportata su un supporto solido inerte con uno spessore che varia a seconda dell’utilizzo di questa tecnica:

• Analitico: spessore 0,25–0,5 mm, carico fra i 5 ed i 10 μg di miscela
• Preparativo (recupero di prodotti): spessore 2-5 mm, carico fino a 250 mg di sostanza

Nella TLC di tipo analitico viene impiegata una granulometria minore di quella usata negli adsorbenti per colonna, per le TLC si usano misure dai 5 ai 40 μm.

Queste granulometrie solitamente garantiscono delle buone efficienze. Questo è legato al supporto in vetro tramite un collante (solfato di calcio) ed in genere contiene una sostanza fluorescente, solfuro di zinco, che assorbe a 251 nm (frequenza ultravioletta). Le lastre commercializzate garantiscono una buona omogeneità della granulometria ed una buona densità di impaccamento. Questo consente di avere buone efficienze e buone riproducibilità. Il campione potrebbe essere una miscela di 3 analiti (A, B e C). Su una delle estremità viene caricata la miscela. Poi questa lastrina viene immersa in una vasca di vetro, sulla cui base c'è uno strato di fase mobile, e per capillarità questa fase mobile risale lungo la lastrina, e man mano si trascina i 3 componenti con velocità diverse in base alla differente affinità tra fase mobile e fase stazionaria. In questo caso il componente C è più affine per la fase mobile, ed

corsa effettuata dal solvente (che solitamente si lascia salire per capillarità sino ad 1 cm dal bordo superiore della lastra) e quella dei componenti caricati sulla lastra stessa.

Difatti nella TLC l'eluente risale la fase stazionaria per capillarità, ed in questo momento contro la gravità trascina il soluto. In questo processo, chiamato sviluppo della lastra cromatografica, si instaurano gli stessi equilibri visti per la cromatografia in colonna fra la fase stazionaria e quella mobile.

Maggiore è la corsa o R, minore è la selettività dell'adsorbente per quel composto. fR dipende da:

• Natura dell'adsorbente
• Struttura dei pori delle particelle (la presenza di pori sulla superficie aumenta l'area superficiale, e quindi la selettività; la struttura dei pori viene individuata nel diametro medio di questi, dal loro volume, dalla loro distribuzione e dalla loro superficie)
• Spessore dello strato

Temperatura - Grado di saturazione dell'ambiente di sviluppo della lastra

In genere le lastre da sviluppare vengono introdotte in una camera di sviluppo nella quale viene posto l'eluente. Il livello dell'eluente deve essere tale da non superare la linea di partenza (~1mm sotto tale linea). La fase stazionaria, possedendo un'elevata superficie, facilita l'evaporazione del solvente che sale per capillarità. Questo fenomeno deve essere ridotto al minimo per evitare che quando si usano miscele di elementi, si abbia evaporazione del solvente più volatile o meno polare, e quindi alterazione della porosità dell'eluente; ed è facilmente ottenuto usando camere di sviluppo chiuse, in cui la fase liquida ha raggiunto l'equilibrio con la fase vapore. In questo modo la superficie della lastra è a contatto con un ambiente saturo di vapore eluente, e questo riduce l'evaporazione dell'eluente stesso dalla superficie.

della lastra. Si raggiunge velocemente la saturazione della camera introducendo strisce di carta da filtro nella camera di sviluppo. Queste, imbevendosi di eluente ed aumentando la superficie a disposizione del liquido, consentono una veloce saturazione della camera.

ANALISI DI UNO STRATO SOTTILE SVILUPPATO:

In genere le lastre commerciali sono fornite di un indicatore a fluorescenza che emette luce a 254nm. Tutte le sostanze organiche che presentano assorbimenti a lunghezze d'onda maggiori assorbono la radiazione al posto di ZnS e danno come risultato una lastra verde chiaro (ZnS in fluorescenza) punteggiata con macchie blu scuro (l'analita). Assorbono radiazioni a 254 nm tutte quelle sostanze che presentano cromofori insaturi (dieni, composti carbonilici da α o β in so, derivati aromatici). È sufficiente porre la lastra sotto una lampada UV. Sostanze che non assorbono a 254 nm o che presentano assorbimenti a lunghezze d'onda minori (composti saturi, o con una

sola insaturazione– alcheni, compositi carbonilici, ecc) non possono essere rilevate esponendo la lastra a lampadaUV. In questo caso la lastra viene sottoposta all’azione di vari agenti specifici per la rilevazionedelle macchie. Il più usato è esporre la lastra ai vapori di I , che sublima facilmente dando vapori2viola, i quali vengono assorbiti dalla lastra ed in genere in corrispondenza delle zone dove èpresente della sostanza organica si formano aree di colore marrone più scuro rispetto al coloreassunto dal gondo. Il colore deriva dalla parziale reazione di I con la sostanza organica o per2adsorbimento preferenziale di I nel composto organico rispetto alla fase stazionaria.2Quando si fa una vera reazione tra composto organico (ad esempio olefina) ed I , può verificarsi il2fenomeno opposto: zone più chiare su fondo scuro.Tempo di esposizione: da pochi minuti a ore.Cromatografia per s