Cromatografie, fluorescenza, spr e spettrometria di massa

Cromatografia a scambio ionico

La cromatografia a scambio ionico è una tecnica che ha molte caratteristiche comuni con la cromatografia ad affinità in quanto:

• Entrambe le tecniche sfruttano l'arricchimento su matrice della proteina per separarla dalla miscela proteica
• Per l'eluizione della proteina separata si sfrutterà la capacità di una molecola competitrice con la matrice per far staccare la macromolecola da essa.

Questo tipo di cromatografia però sfrutta una proprietà intrinseca delle molecole proteiche: la loro distribuzione di carica, essendo essi dei poli-ioni (a diversi pH presentano una certa carica di superficie).

N.B. Ricordiamo che al P.E. la somma delle cariche di superficie della proteina è 0.

Cosa differenzia le proteine in una miscela proteica?

La loro struttura primaria e quindi la loro sequenza amminoacidica che presenterà più o meno amminoacidi carichi positivamente o negativamente quindi, a diversi pH, le proteine avranno carica superficiale diversa e con diversa intensità (proteine più cariche positivamente o negativamente di altre ad un dato pH).

N.B. Questa tecnica è ottima qualora si debba separare una miscela di poche proteine, altrimenti è meglio utilizzare una cromatografia ad affinità.

Lo scambio ionico sfrutta le interazioni elettrostatiche tra molecole grazie al quale la nostra proteina di interesse viene arricchita in matrice (ovviamente con carica opposta alla nostra proteina così che possa legarvisi).

Scambiatori ionici

Sono di due tipi:

• Cationici: resina di sfere cariche negativamente, trattengono molecole cariche positivamente (cationi)
• Anionici: resina di sfere cariche positivamente, trattengono molecole cariche negativamente (anioni)

Anch'essi, essendo delle molecole organiche, a diversi pH daranno diversi equilibri acido-base, per cui non sempre potrebbero essere carichi positivamente o negativamente; per cui per entrambe le classi di scambiatori possiamo distinguerne altre due:

• Forti: mantengono la loro carica superficiale uguale a qualunque pH si lavori. Sono costituiti da specie chimiche derivanti da acidi o basi forti (es. ione solfonato, anione dell'acido solforico che può essere al massimo monoprotonato a meno che non si lavori a pH<1, ma di solito sono valori di pH non considerati).
• Deboli: hanno un range di pH nel quale essi mantengono la loro carica superficiale uguale e quindi funzionale. Specie chimiche che derivano da acidi o basi deboli (es. ione carbossilato o ione ammonio).

Supporto costituito da sfere di cellulosa o comunque da sfere di materiale tendenzialmente inerte e polidisperso quindi penetrabile da tutte le macromolecole e ben reticolato (non volendo selezionare per dimensione il supporto avrà spazi abbastanza larghi da poter essere attraversato da tutta la miscela proteica) che va funzionalizzato attaccandogli un braccio costituito da molecole organiche che presenta al termine il nostro gruppo carico (al termine possiamo avere ad esempio un gruppo carbossilato carico (COO-) aggiunto come sale, quindi in equilibrio con il suo catione; ovviamente il gruppo carbossilato non sarà sempre carico negativamente ma può essere protonato diventando neutro qualora si lavori a pH acidi. Oppure braccio organico con al termine una ammina, quindi con carica positiva avendo un gruppo NH₄⁺. Sono entrambe scambiatori ionici deboli).

Posso progettare una resina che presenta al termine un azoto tetrasostituito (azoto legato al braccio della resina da una parte e tre metili da un'altra); esso non potrà mai perdere la carica positiva presente sull'azoto almeno che non si riesca a scindere un gruppo metile ad esso legato (condizione molto difficile) e costituirà così uno scambiatore anionico forte.

Perché preferire scambiatori ionici deboli?

• Posso sfruttare i cambiamenti di pH per cambiare l'interazione tra la mia macromolecola e la resina e quindi eluirla facilmente dalla matrice.
• Uno scambiatore forte trattiene con molta forza le macromolecole, così fortemente che a volte le proteine che vi fluiscono saturano la resina.
• Più economici degli scambiatori forti.

Se la proteina ha P.E. acido (avendo più amminoacidi carichi negativamente che positivamente in sequenza primaria) sarà carica positivamente a pH < P.E. e carica negativamente a pH > P.E.

N.B. Il P.E. è un valore teorico; bisogna considerare per calcolare la pKa della proteina, oltre agli amminoacidi basici e acidi presenti in struttura primaria, anche la struttura con cui si ripiega nello spazio la proteina (se un amminoacido è “nascosto” nella struttura tridimensionale della proteina il suo contributo di carica sarà completamente diverso rispetto a qualora esso si trovi in superficie).

Per separarla lavoro a un punto di pH in meno rispetto al suo P.E.; la proteina sarà così carica positivamente e utilizzerò uno scambiatore cationico per legarla ad esso (posso però ragionare diversamente lavorando a pH in cui vengono trattenute tutte le proteine della mia miscela tranne quella da purificare così da farla eluire prima di tutte e ottenere il mio obiettivo).

N.B. La maggior parte delle proteine ha P.E. acido e sono più facili da separare rispetto alle proteine basiche.

Per purificare la mia proteina di interesse posso sfruttare anche la forza con cui le diverse proteine della mia miscela si legano alla matrice essendo la carica di diversa intensità nelle diverse macromolecole (più distanti ci troviamo dal loro P.E. più sono cariche e quindi con più forza si legheranno alla matrice). Questo significa che questa tecnica non funziona in modalità isocratica (facendo scorrere il tampone con cui ho lavorato non riesco a staccare le mie proteine dalla matrice).

Come staccare le proteine dalla matrice?

• Sfruttando i diversi P.E. delle proteine legate e istituendo così gradienti di pH per eluirle a causa della loro perdita di carica perdendo di affinità per la matrice (via più complicata).
• Utilizzo gradienti salini crescenti; soluzione più semplice che sfrutta la competizione degli ioni dei sali utilizzati per staccare le proteine dalla matrice. Verranno scalzati prima le proteine debolmente associate alla resina e mano a mano le altre. Sali che solitamente si utilizzano sono NaCl e (NH₄)₂SO₄ (dalla serie di Hoffmeister risultano essere i sali meno denaturanti e che solubilizzano di più le proteine).

IMPORTANTE: le miscele proteiche separabili con scambio ionico devono avere concentrazione salina (forza ionica) molto bassa altrimenti gli ioni del sale competono per il legame alla matrice con la nostra proteina.

Cromatografia ad interazione idrofobica (HIC)

Residui idrofobici non sono solitamente esposti in superficie perché la proteina tende a “seppellire” questi residui all'interno della sua struttura (nel core, con grado di accessibilità al solvente molto ridotto). Ci sono però delle regioni della nostra proteina che potrebbero comunque esporre dei residui apolari o con un certo grado di idrofobicità (meno frequentemente fenilalanine, più probabilmente leucine e valine); inoltre le proteine di membrana cellulare hanno residui idrofobici esposti essendo inserite in membrana quindi in un contesto idrofobico (ambiente esterno non prettamente acquoso). Questa tecnica quindi sfrutta il grado di idrofobicità della nostra macromolecola.

Si funzionalizza la fase stazionaria con molecole idrofobiche (con diverso grado di idrofobicità) così che le proteine possano avere un diverso grado di affinità per la matrice; si possono usare per questa operazione anche amminoacidi apolari o braccetti alifatici (ripetizioni di gruppi -CH₂) o benzene (composti aromatici) per sottolineare la versatilità delle resine che presenteranno un diverso grado di idrofobicità a seconda del materiale con cui sono costituite.

Criterio di adsorbimento ed eluizione dalla resina

Ci serviamo della forza ionica della soluzione giocando con la sfera di idratazione delle proteine (salting in e salting out):

• A basse/medie concentrazioni saline le proteine non tendono ad aggregare tramite le loro regioni idrofobiche, la loro sfera di idratazione è tale da consentire di tenere in soluzione le molecole proteiche
• Ad alte concentrazioni saline le regioni idrofobiche proteiche tendono ad associarsi tra loro e a schermarsi dall'ambiente in cui sono presenti molte cariche negative e positive e sono quindi poco propense ad essere solubilizzate

Ponendomi quindi ad una concentrazione salina elevata ma non troppo da denaturare la mia proteina e da mantenerla in soluzione, creo una condizione molto simile al salting out con le regioni idrofobiche che si associano; quindi caricando la resina di specie chimiche idrofobiche essa legherà la proteina.

Procedura

• Equilibrio la mia colonna con soluzione ad alta concentrazione salina (2M di NaCl) e posso così purificare (forza ionica non troppo alta da far precipitare la proteina).
• Dopodiché eluisco man mano con soluzioni a più bassa forza ionica: calando la forza ionica cala anche la schermatura dei gruppi polari proteici sfavorendo l'interazione con la fase stazionaria; le proteine che debolmente si erano attaccate alla mia resina eluiranno per prime (saranno le proteine provviste di meno regioni idrofobiche) mentre le proteine ricche in regioni idrofo...