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Cromatografie, fluorescenza, spr e spettrometria di massa

Questi appunti contengono varie tecniche utilizzate nella biochimica come le tecniche cromatografiche, spr, spettrometria di massa; derivano da sbobine di lezione del corso metodologie biochimiche tenuto dalla prof. Laura Cendron. studiando da questi appunti la mia valutazione finale all'esame è stata di 27/30
cromatografia, spr, spettrometria di massa, maldi, es, electro-spray.

Esame di Metodologie biochimiche docente Prof. L. Cendron

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LA FLUORESCENZA

LUMINESCENZA= emissione di radiazioni, generalmente cade nell'UV/visibile. Questa

emissione può essere l'effetto di una reazione chimica (pratica detta chemioluminescenza

trova applicazione nell'dentificazione di proteine attraverso uso di anticorpi, quindi nel

WESTERN BLOT, usando come sonda finale un anticorpo secondario legato alla

perossidasi).

Lampada deve emettere una radiazione che in parte deve essere assorbita dal nostro

campione e quello che lui assorbe deve tradursi, almeno in parte, in fluorescenza (qualsiasi

sia la natura del campione) quindi deve restituire energia ad una lunghezza d'onda che non è

la lunghezza d'onda d'eccitazione (questo nella maggior parte dei casi).

La fluorescenza però non è l'unica forma di emissione quando noi irradiamo il nostro

campione, ma può esserci anche la fosforescenza, fenomeno che compete con la

fluorescenza (tempi di decadimenti diversi) e che di fatto ci sottrae parte della radiazione

assorbita.

Cosa succede quando abbiamo della fluorescenza ?

Abbiamo un campione che irradiamo con luce a lunghezze d'onda che cadono nello spettro

dell'UV/visibile (di solito nell'UV, quindi lunghezze d'onda più energetiche e quindi più

corte). Il campione è in grado di assorbire quella radiazione perchè le molecole che lo

compongono subiscono una transizione elettronica degli elettroni che stanno sugli orbitali

molecolari più esterni ed eccitandosi si trasferisce negli orbitali a più alta energia.

L'elettrone però rimane eccitato per poco tempo ritornando nel suo orbitale iniziale,

restituendo l'energia di eccitazione in vari modi possibili, uno dei quali è appunto la

fluorescenza, nella quale l'elettrone ritorna allo stato fondamentale e cede una quantità di

energia pari o inferiore rispetto all'energia di eccitazione. Per un riarrangiamento elettronico

chiamato inter-system crossing, se l'elettrone eccitato cambia di spin, si ha fosforescenza

(fenomeno deleterio e più lento) perdendo parte dell'energia di eccitazione; altra energia si

può perdere qualora la nostra molecola eccitata collida con un altra (dispersione di energia

tramite calore). Dei vari stati eccitati esistono però dei sottolivelli che corrispondono a

vibrazioni di legame (come stretching, bending, etc.) che non cambiano lo stato di

eccitazione dell'elettrone, ma cambiano soltanto i sottolivelli dello stato eccitato.

La fluorescenza ha un tempo in cui permane, in quanto mano a mano tutti gli elettroni

eccitati tornano allo stato fondamentale e con lunghezze d'onda più lunghe (quindi meno

energetiche rispetto alla luce eccitante); inoltre l'energia emessa dal campione dopo

eccitamento non sarà mai al 100% fluorescenza a causa dei fenomeni energetici descritti

prima.

Eccito il mio campione ad una lunghezza d'onda che so essere parte del suo spettro di

assorbimento, e registro la radiazione emessa (questa costituirà uno spettro essendo le

lunghezze d'onda di rilassamento diverse per ogni elettrone eccitato).

ATTENZIONE!!! devo rilevare solo la fluorescenza

Tutte le molecole organiche con anelli benzenici tendono facilmente a fluorescere qualora

eccitate con radiazioni UV.

A qualunque lunghezza d'onda che faccia parte del suo spettro di assrobimento io ecciti il

mio campione esso mi restituirà sempre lo stesso spettro di fluorscenza.

Come usiamo questo fenomeno ?

FLUORIMETRO= strumento che misura la fluorescenza (paragonabile allo

spettrofotometro). Posso avere, come nello spettrofotometro, la capacità di scegliere la

lunghezza d'onda della luce incidente sul mio campione (utilizzo monocromatore). La

differenza grande che si ha con lo spettrofotometro è che il rilevatore era posto in continuità

con il campione colpito, qui invece, a causa della luce non assorbita che verrebbe rilevata,

mi pongo a 90° rispetto al mio campione (sfrutto la non direzionalità della fluorescenza).

La fluorescenza inoltre mi ritorna abbattuta in parte da tutti gli altri fenomeni di dispersione

di energia.

Se il campione è molto diluito e la fluorescenza molto bassa, l'intensità della mia

fluorescenza è proporzionale alla concentrazione del campione (la costante di

proporzionalità però non si può sapere in quanto dipende da fenomeni che non possono

essere misurati, cosa che fa dell'intensità di fluorescenza un numero relativo).

N.B. La fluorescenza cade esponenzialmente in funzione del tempo, pH e temperatura a cui

lavoro.

In natura ci sono un sacco di molecole intrinsecamente fluorescenti: nelle proteine ci sono

gli amminoacidi aromatici tirosina e triptofano (fenilalanina ha una resa scadente; tra le due

il triptofano è quello più fluorescente); lunghezza d'onda massima di fluorescenza del

troiptofano è a 320nm. Anche le clorofille ,moltissimi cofattori enzimatici (NADH e

NADPH, FMN) , vitamine, molte molecole aromatiche che sintetizziamo a scopi

farmaceutici danno fluorescenza. Andando oltre possiamo utilizzare delle sonde fluorescenti

che possono essere attaccate alle proteine, produrre GFP attraverso tecniche del DNA

ricombinante, utilizzare intercalanti del DNA per rivelare specifiche bande.

Posso essere utilizzando questo fenomeno, molto sensibile nella mia analisi (posso rilevare

fluorescenza anche con basso segnale) e specifico (con fluorescenza secondaria marco solo

quella specie proteica).

Posso sfruttare l'abbattimento della fluorescenza data dagli altri fenomeni di emissione per

studiare l'interazione tra due macromolecole: se io all'inizio misuro la fluorescenza e poi

aggiungo un composto che lega il sito attivo della proteina; questo fa variare la fluorescenza

emessa, potendo così studiare l'interazione tra esse e determinare a costante d'interazione.

Fenomeno della fluorescenza:

– non istantaneo

– decade nel tempo con percorso di decadimento radioattivo

può così rispondere alla dinamicità del mio sistema: diversamente dall'assorbimento questo

fenomeno si protrae nel tempo, è dinamico (se per esempio stiamo studiando

riarrangiamenti del citoscheletro, localizzazione cellulare di alcune specie,

vescicolalizzazione,mitosi,meiosi, vescicole che passano nel reticolo e nel golgi) definendo

così una tecnica che mi fotografa la dinamica del mio sistema biologico nel tempo; se io

perturbo il mio sistema la fluorescenza muterà con diversa resa (es. alterazione della

temperatura con rilascio dell'energia assorbita in altre vie, fenomeno chiamato quenching di

fluorescenza, e che fa variare la resa quantica).

Quenchers: molecole che riducono rese di fluorescenza. Emanando energia in vie

alternative.

Utilità in campo proteico

– aa tirosina e triptofano emettono fluorescenza: studio equilibrio di folding delle mie

proteine, ovvero il ripiegamento corretto nella sua struttura tridimensionale nativa e

al minimo d'energia; questi aa sono sensibili ai cambiamenti dell'ambiente in cui si

trovano: possono essere, se denaturati, esposti al solvente, cambiando l'efficienza di

fluorescenza ed è proprio questa caratteristica che sfrutto per valutare il folding

proteico. Posso usare anche proteine funzionalizzate con fluorescina o GFP per

valutarne il folding (metodo poco usato). La caduta di fluorescenza sarà dipendente

dalla concentrazione di agente denaturate

attenzione!!! molto spesso il solvente agisce da quencher (molto spesso acqua)

– studio interazione proteina-ligando:

es. veicolazione dei farmaci con albumina sanguigna: albumina ha un sacco di siti di

binding; interazione farmaci-albumina (es. tetraciclina): misuro fluorescenza dell'albumina a

concentrazioni crescenti di tetraciclina in soluzione con la nostra proteina: crollo della

fluorescenza dei triptofani con tetraciclina che funge quindi da quencher. Misuro così la

costante di affinità delle due molecole. Ovvimanente ci sarà una fluorescenza della

tetraciclina, potendo usare così questo parametro per la costante di affinità ( la tetraciclina

assorbe la fluorescenza dell'albumina; inoltre,venendo esclusi al solvente e legandosi in una

tasca idrofobica, può fluorescere).

– Rilevazione di bande di DNA estratto in elettroforesi

uso intercalanti del DNA, che fluorescono in quanto esclusi al solvente e aumentando la

resa di fluorescenza

– uso di sonde ricombinanti

spesso la sola fluorescenza intrinseca delle proteine non basta per studiarle al meglio;

utilizzo proteina clonata in frame con sonda fluorescente (quasi sempre GFP clonata al C-

/N- terminale della proteina di interesse; essa avrà fluorescenza a lunghezze d'onda diverse

rispetto a triptofani e tirosine, potendo così effettuare un'analisi selettiva della sola proteina

da studiare): posso così seguirne la localizzazione cellulare sia della proteina wt che mutata

(magari causa di una patologia).

– Colocalizzazione di proteine

ingegnerizzata la sequenza amminoacidica della GFP, si sono create nuove sonde

che emettono fluorescenza a lunghezze d'onda diverse (come CFP o YFP). Posso studiare le

proteine in contemporanea essendo preciso e selettivo e determinando la loro

colocalizzazione o meno

– FRET

studio di interazione proteica: cessione di energia da una molecola che fluoresce ad un

quencher che ne spegne la fluorescenza ed emette a sua volta grazie all'energia assorbita. Si

utilizzano due sonde: accettore primario e quencher; la condizione fisica affinchè si abbia

questa cessione di energia è che le due sonde siano vicine tra loro (altrimenti vediamo solo

la fluorescenza dell'accettore primario).

Attenzione!!!

1- la lunghezza d'onda alla quale l'accettore primario emette fluorescenza deve essere parte

dello spettro di assorbimento del quencher.

2- la FRET riesce a rilevare vicinanze di qualche nm in condizioni ottimali

3- la fluorescenza è influenzata dalla geometria spaziale delle molecole studiate

4- l'aggiunta di una sonda è ingmbrante e può causare un ripiegamento non corretto della

proteina studiata.

THERMOFLUOR

Studio dei profili di denaturazione proteica:

– creo gradiente di temperatura scaldando il campione gradualmente fino a 95-100°C

(denaturazione proteica totale).

Leggiamo in continuo la fluorescenza del nostro campione sottoposto a denaturazione

termica crescente; si utilizza un piccolo composto che fluoresce con una resa di fluorescenza

molto maggiore rispetto alla fluorescenza intrinseca della proteina in esame (detecting di

fluorescenza anche a concentrazioni molto basse).

COMPOSTO: sypro-orange

piccola molecola con porzioni aromatiche coniugate; non fluoresce particolarmente in

ambiente acquoso, ma la loro fluorescenza cresce drasticamente quando si lega ad un

ambiente idrofobico; affini alle catene laterali idrofobiche degli amminoacidi della proteina

in esame: quando la proteina si denatura espone al solvente acquoso le suo regioni

idrofobiche che verranno legate da questo composto.

Picco di fluorescenza: proteina completamente denaturata.

Dopo il picco : continuando a scaldare, la proteina continua a denaturarsi precipitando con

dissociazione del colorante e crollo della fluorescenza.

Temperatura di melting: temperatura alla quale il 50% del campione è denaturato.

Attenzione!!! il colorante potrebbe interferire nella misura

STRUMENTO: REAL TIME PCR

Come possiamo rilevare la temperatura di melting ?

-Fitting di Boltzmann

-Derivata della curva (massima pendenza alla Tm)

Studio di come la mia proteina si comporta in determinate condizioni ambientali

– carico nei miei tubini la mia proteina in ambienti diversi (pH, salinità, dtergenti) e la

analizzo contemporaneamente scaldandola e determinando la Tm.

N.B. Più la Tm è alta più la proteina è stabile

Usato anche per determinare interazione proteina-ligando:

confronto curva di denaturazione della mia proteina a parità di condizioni ma aggiungendo

in una provetta un suo possibile ligando: Tm si sposta a seconda che il ligando la

destabilizzi (verso il basso) o meno (verso l'alto).

ASSUNZIONE :colorante non deve interagire con il sito di legame del ligando.

Se invece interferisce, egli stessa è un ligando della proteina (es. proteine con domini

idrofobici esposti a tasca).

Stato di energia più basso se c'è interazione proteina-ligando = devo scaldare di più per

denaturare

es. legame chinasi-ATP

disegno molecola che interagisca con la chinasi al posto di ATP: utilizzo librerie di composti

che siano simili all'ATP e valuto l'affinità della proteina con il mio composto calcolando la

costante di affinità e valutarne la sua eventuale proprietà inibente.

N.B.

-Non so però dove la molecola si leghi

-possibile presenza di falsi negativi

-possibili studi di un sistema ternario

possibile calcolo della costante di dissociazione :

-proteina incubata con diverse concentrazioni di ligando

-curva di melting per ogni diversa condizioni

-in grafico metto la concentrazione di substrato (x) e le temperature di melting (y)

es. GTPasi

misurazione dell'affinità per il GTP: binding ligando-proteina induceva processi di

cooperatività con cambio della conformazione proteica; rilevazione di una cooperatività

negativa data dalla dissociazione del dimero quando esso lega GTP.

Kd = costante di dissociazione in un sistema reversibile

Kd è il rapporto tra (proteina-ligando)/(proteina + ligando)

interazione proteina ligando è rapporto tra siti occupati dal ligando/siti totali per binding al

ligando della proteina

concentrazioni da sapere

-ligando

-proteina

-complesso

Kd= 1/Ka quindi più è piccola più è forte il legame

quindi kd=0.5 vuol dire che il 50% dei siti titali per binding al ligando della proteina sono

occupati e si definisce come concentrazione di ligando alla quale riesco ad occupare il 50%

dei siti di binding sulla proteina.

RISONANZA PLASMONICA DI SUPERFICIE (SPR)

– versatile

– sfrutta chip (quindi piccole superfici) combinate con microfluidi

è una tecnica che permette di seguire in tempo reale la dinamica e l'intensità delle

interazioni (studi sia in campo termodinamico che cinetico).

Si basa su un fenomeno ottico. Le specie di cui studiamo l'interazione sono una

immobilizzata sul chip e una in soluzione. Posso distinguere i due stati (aggregazione e non)

valutando le caratteristiche del chip.

1) IMMOBILIZZAZIONE DEL LIGANDO

CHIP:

costituito da una parte in vetro e una lamina d'oro (dove attacco la mia specie ma non

direttamente, devo mimare il fatto che si trovi in soluzione; inoltre se legata direttamente

all'oro si denaturerebbe e non legherebbe la proteina in soluzione).

Funzionalizzo l'oro con un anticorpo; creo sistema di canali controllato con pompe

pressurizzate in cui faccio scorrere un fluido sopra la mia superficie funzionalizzata (il

fluido può essere tampone, soluzioni a pH diversi, ligandi).

Prisma irraggiato con luce polarizzata: se il mio chip non ha attaccato la proteina fatta fluire

la luce emerge con un certo angolo; se invece si attacca, cambia lo spessore del chip e della

lamina e la luce riflessa cambia angolo di rifrazione (sfrutto le differenze ottiche della sola

proteina e della proteina legata).

N.B. La luce viene riflessa in modo diverso a causa della perturbazione del movimento degli

elettroni nell'oro e della loro distribuzione nello spazio.

Pulisco poi con qualcosa che stacchi la proteina legata all'anticorpo legato all'oro (tampone

puro).

Oro funzionalizzato con polisaccaride (strato di linker) così che l'anticorpo non si denaturi e

che assomigli ad uno stato in soluzione (polisaccaridi attirano solvente e rendono l'ambiente

ben idratato). Generalmente di usano destrani che possono essere attivati e che reagiscano

attaccando così la proteina (anticorpo)

es. destrani funzionalizzati con nichel è affine alle istidine (grazie agli anelli imidazolici):

posso attaccare alla proteina da far fluire una coda di istidine.

Posso usare anche il sistema biotina-streptavidina

Nella maggior parte dei casi però la proteina si attacca covalentemente all'oro: si fa cross-

linking per attaccare gruppi amminici proteici (N-terminale, lisina, arginina, ecc.) con

reazione di gruppi carbossilici attivati.

N.B. Non devo né denaturare né rendere troppo rigida la mia molecola

Le interazioni covalenti tendono ad irrigidire il sitema e blocca la regione attorno al legame

covalente e la allontana dalla condizione di proteina in soluzione, ma la proteina ha diversi

punti di attacco (la proteina esplora n orientazioni diverse) così il sistema è statisticamente

valido: è il sistema che si avvicina di più alla condizione di proteina in soluzione; inoltre il

chip con la proteina legata dura molto tempo se conservato opportunamente.

LIGANDO= proteina legata al chip

ANALITA= specie libera in soluzione che interagisce con il ligando


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biologia molecolare
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Dottoreincallito di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Metodologie biochimiche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Cendron Laura.

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