Metodologie biochimiche e cellulari

METODI DI ANALISI DELL’INTERAZIONE TRA MACROMOLECOLE

BIOLOGICHE

Le interazioni proteina-proteina rappresentano

un significativo ostacolo alla comprensione dei

processi biologici complessi. Fino all’80%

delle proteine non funzionano da sole, ma in

complessi utili a regolazione, espressione e

organizzazione di ogni processo cellulare:

• Replicazione del DNA.

• Trascrizione.

• Traduzione.

• Controllo del ciclo cellulare.

• Trasduzione del segnale ect etc...

Interactoma = l'insieme di tutte le interazioni molecolari che avvengono all'interno di una cellula. Queste

interazioni coinvolgono proteine, acidi nucleici, lipidi e altre molecole che interagiscono tra loro per

svolgere varie funzioni all'interno delle cellule.

Occorre comprendere l’interezza del complesso e identificare come i vari interattori influiscono sul

funzionamento della proteina completa e delle varie subunità. Attraverso l’interazione tra proteine può essere

modificata la specificità e l’affinità di una subunità per il suo substrato.

Le tecniche "ChIP" e "RIP" sono entrambe metodi utilizzati in biologia molecolare per studiare le interazioni

tra proteine e DNA/RNA all'interno delle cellule.

• ChIP (Chromatin Immunoprecipitation): La tecnica ChIP è impiegata per studiare le interazioni

tra le proteine e il DNA. Questa tecnica permette di determinare quali proteine si legano al DNA in

vivo. Si basa sulla fissazione delle cellule per preservare le interazioni proteina-DNA, seguita

dall'uso di anticorpi specifici per precipitare la proteina di interesse legata al DNA. Il DNA associato

a quella proteina viene quindi estratto e può essere analizzato tramite PCR, sequenziamento o altri

metodi, permettendo l'identificazione dei siti di legame proteina-DNA.

• RIP (RNA Immunoprecipitation): Questa tecnica è utilizzata per studiare le interazioni tra le

proteine e l'RNA. Come la ChIP, coinvolge l'uso di anticorpi specifici per precipitare le proteine

legate all'RNA. L'RNA associato a quelle proteine viene estratto e analizzato per identificare i tipi di

RNA che interagiscono con la proteina di interesse.

Entrambe le tecniche, ChIP e RIP, forniscono informazioni cruciali sulle interazioni proteina-DNA e

proteina-RNA, rispettivamente. Consentono di comprendere meglio i processi di regolazione genica, la

struttura della cromatina e altre interazioni molecolari all'interno delle cellule.

Co-immunoprecipitazione

Protein-protein interactions play important roles in

both inter- and intracellular signalling. Among the

various methods of detecting protein–protein

interactions, co-IP is cost-saving, easy to handle, and

can be applied to various types of samples, such as

plant cells, mammalian cells, yeast, and nematode

tissue.

Co-Immunoprecipitation (Co-IP) is a powerful method

that is most widely used by researchers to analyze

protein-protein interactions. This process provides a

rapid and simple method to separate a specific protein

from a sample containing thousands of different

proteins, such as serum, cell lysate, homogenized

tissues or conditioned media.

È una derivazione delle tecniche di immunoprecipitazione ed è impiegata per studiare l’interazione tra

proteine. Si tratta di una pratica economica e relativamente semplice. È applicabile a diversi tipi di campioni

(animali, lieviti piante ect).

Rende possibile immunoprecipitare proteine, di cui si conosca l’anticorpo, da una miscela di peptidi, tra i

quali alcuni interagiscono tra loro. “Pescando” uno degli interattori del complesso, se la forza di interazione

è tale da permetterlo, si ottiene l’intero complesso

proteico.Se tra le subunità sono stabilite unioni

covalenti, la tecnica ha una buona probabilità di

riuscita.

Nel caso in cui i domini stabiliscano tra loro

interazioni deboli o siano semplicemente in

prossimità, l’immunoprecipitazione risulterà

difettiva e necessiterà di accorgimenti ulteriori,

come la formazione di cross-links tra peptidi.

Se la proteina di interesse non è nota, è preferibile

utilizzare la spettrometria di massa. Diagramma di come si svolge un

esperimento di immunoprecipitazione.

Il “punto di partenza” cambia a seconda

dell’origine delle proteine coinvolte.

L’utilizzo di plasmidi codificanti per

proteine esogene o sovraesprimenti

proteine endogene richiede ulteriori

passaggi.

Tra questi ci sono: costruzione di un

plasmide di espressione, trasfezione

all’interno dell’ospite…

L’utilizzo di plasmidi di espressione o sovraespressione porta con sé tre problemi! Sovraesprimere una

proteina in una cellula (più tempo ma solitamente non tossico perché è comunque endogena)

1. Informazioni di tipo qualitativo:

È persa la caratteristica quantitativa dell’analisi.

2. Compatibilità dell’ospite:

La trasfezione all’interno di un ospite è un passaggio limitante, in quanto non tutte le cellule sono

competenti e/o in grado di reggere la trasfezione. Occorrerà quindi tarare il plasmide sulla base della

sensibilità dell’organismo bersaglio.

3. Generazione di aspecifici e perdita della specificità della localizzazione:

La localizzazione della proteina e i complessi di cui è parte sono inficiati dalla sovraespressione della

stessa. Anomali livelli di un peptide possono forzare la formazione di complessi, anche anormali, e

possono far sì che venga trasportato in distretti cellulari che non siano quelli comuni.

Il passaggio di pre-clear è svolto poi con delle beats a cui l’anticorpo è ancorato. Ad esse la proteina target si

lega in modo specifico. Seguono l’incubazione, il lavaggio di proteine aspecifiche e l’SDS-PAGE (si

frammenta il complesso, ma una dopo la fase di precipitazione rimane solo quello, non si rischiano

contaminazioni). Si conclude con:

- Spettroscopia di massa per identificare una proteina ignota.

- Western-blot per un peptide noto.

Pull down essay

Pull down essay = tecnica biochimica che consente di identificare i peptidi che interagiscono con una

proteina specifica.

La procedura coinvolge la fissazione della proteina bersaglio su una superficie solida, come per esempio

perline magnetiche o un supporto di gel.

Successivamente, si aggiunge un campione contenente proteine potenzialmente interagenti con la proteina

bersaglio. Le proteine target si legheranno alla proteina bersaglio fissata, mentre quelle non interagenti

verranno lavate via.

Infine, le proteine legate vengono identificate e analizzate tramite tecniche biochimiche come

l'immunoblotting o la spettrometria di massa per determinare la presenza e la natura delle interazioni

proteina-proteina.

Pull down assay is an in vitro method to detect protein-protein interaction. The

commonly used bait protein is a purified tag protein (GST, Biotin, ect). Pull

down assay is usually followed by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MS)

analysis to identify the interactor, and further genetic approaches or Western

Blot analysis can be implemented to confirm the direct interaction.

Rispetto alla co-immunoprecipitazione si utilizza una proteina bait. Lo si fa utilizzando un tag, di cui una

parte, legandosi in modo specifico al target, permette di purificare la proteina di interesse in modo veloce e

l’altra media il legame alle beats magnetiche.

È un saggio facile, la cui unica complicazione è la sintesi dell’esca. È prodotta e poi unita alle beats

attraverso un linker. Seguirà l’aggiunta dell’estratto cellulare.

La preda si legherà all’esca e, dopo il lavaggio degli aspecifici, si può eluire il complesso beats-preda-esca

purificata. Segue la corsa su gel che ci si aspetta mostri due bande: target (preda) e linker (esca).

Parallelamente è svolta una prova analoga ma con beats senza bait.

All necessary control groups will be included according to the following table to verify interaction

specificity.

Cross-linking

Cross-linking = tecnica impiegata per legare chimicamente due molecole o più tra loro, creando dei legami

covalenti che fissano le relazioni tra le strutture molecolari. Nel contesto della biologia e della biochimica, il

cross-linking può essere utilizzato per:

• Stabilizzare le interazioni proteina-proteina: Questo aiuta a determinare le complessità proteiche e

le interazioni all'interno di una cellula.

• Fissare il legame tra proteine e acidi nucleici: Può essere impiegato per studiare l'interazione tra

proteine e DNA/RNA.

• Fissare le strutture proteiche: Aiuta a stabilizzare e studiare la struttura di proteine complesse o di

complessi proteici.

Il processo coinvolge l'aggiunta di agenti cross-linking, come formaldeide o agenti bifunzionali, che formano

legami chimici tra le molecole bersaglio. Questi legami possono essere reversibili o irreversibili a seconda

del tipo di cross-linker utilizzato e del contesto sperimentale.

Metodo basato su reazioni chimiche che formano legami irreversibili tra proteine che interagiscono,

immobilizzandole in forma di complesso. È un metodo semi-quantitativo per l’interazione proteina-proteina.

I cross-linker sono molecole lineari o ramificate che possiedono alle estremità gruppi funzionali che

reagiscono con le proteine (sia libere che in complesso) formando legami covalenti.

La pratica può essere svolta da sola o in associazione alle tecniche viste finora. Si basa sul fatto che proteine

che interagiscono tra loro saranno sono abbastanza vicine. Risulta possibile bloccarle in tale interazione

utilizzando un linker in grado di legarsi in modo covalente all’una e all’altra proteina.

Esistono molecole cross-linkers lineari e ramificati. Sono linker

chimici con estremità reattive e in grado di generare legami

covalenti. Un peptide di cui non si conosce la funzione può essere in

questo modo identificato come interattore di un complesso più

grande.

Questa metodologia può essere utilizzata per:

1. Interazioni proteina-proteina.

2. Determinare struttura quaternaria.

3. Identificare interagenti sconosciuti.

Dato che la spettrometria di massa funziona su peptidi

relativamente piccoli, occorre frammentare complessi di grande

massa molecolare.

Tale frazionamento può essere svolto a seguito della purificazione

o antecedentemente ad essa.

Tabella con diversi gruppi reattivi dei cross-linker. Possono

essere uguali alle due estremità o anche no. La solubilità è

variabile e dipende da qual è la natura del gruppo

spaziatore.

La lunghezza media è di 40 nm, ma hanno una grande

variabilità. La scelta di quel