Metodologie biochimiche e cellulari

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Esame Metodologie biochimiche

Facoltà Scienze matematiche fisiche e naturali

Dal corso del Prof. Leanza Luigi

Università Università degli Studi di Padova

Publisher RiccardoMattiaColombo

A.A. 2022-2023

125 pagine

Appunti esame

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Estratto del documento

Metodi di analisi dell'interazione tra macromolecole biologiche

Interazioni proteina-proteina

Le interazioni proteina-proteina rappresentano un significativo ostacolo alla comprensione dei processi biologici complessi. Fino all'80% delle proteine non funzionano da sole, ma in complessi utili a regolazione, espressione e organizzazione di ogni processo cellulare:

Replicazione del DNA.
Trascrizione.
Traduzione.
Controllo del ciclo cellulare.
Trasduzione del segnale.

Interactoma

L'interactoma è l'insieme di tutte le interazioni molecolari che avvengono all'interno di una cellula. Queste interazioni coinvolgono proteine, acidi nucleici, lipidi e altre molecole che interagiscono tra loro per svolgere varie funzioni all'interno delle cellule.

Occorre comprendere l'interezza del complesso e identificare come i vari interattori influiscono sul funzionamento della proteina completa e delle varie subunità. Attraverso l'interazione tra proteine può essere modificata la specificità e l'affinità di una subunità per il suo substrato.

Tecniche ChIP e RIP

Le tecniche ChIP e RIP sono entrambe metodi utilizzati in biologia molecolare per studiare le interazioni tra proteine e DNA/RNA all'interno delle cellule.

ChIP (Chromatin Immunoprecipitation): La tecnica ChIP è impiegata per studiare le interazioni tra le proteine e il DNA. Questa tecnica permette di determinare quali proteine si legano al DNA in vivo. Si basa sulla fissazione delle cellule per preservare le interazioni proteina-DNA, seguita dall'uso di anticorpi specifici per precipitare la proteina di interesse legata al DNA. Il DNA associato a quella proteina viene quindi estratto e può essere analizzato tramite PCR, sequenziamento o altri metodi, permettendo l'identificazione dei siti di legame proteina-DNA.
RIP (RNA Immunoprecipitation): Questa tecnica è utilizzata per studiare le interazioni tra le proteine e l'RNA. Come la ChIP, coinvolge l'uso di anticorpi specifici per precipitare le proteine legate all'RNA. L'RNA associato a quelle proteine viene estratto e analizzato per identificare i tipi di RNA che interagiscono con la proteina di interesse.

Entrambe le tecniche, ChIP e RIP, forniscono informazioni cruciali sulle interazioni proteina-DNA e proteina-RNA, rispettivamente. Consentono di comprendere meglio i processi di regolazione genica, la struttura della cromatina e altre interazioni molecolari all'interno delle cellule.

Co-immunoprecipitazione

Le interazioni proteina-proteina svolgono ruoli importanti sia nel segnalamento inter che intracellulare. Tra i vari metodi di rilevazione delle interazioni proteina-proteina, la co-immunoprecipitazione (Co-IP) è economica, facile da gestire e può essere applicata a vari tipi di campioni, come cellule vegetali, cellule di mammifero, lieviti e tessuti di nematodi.

La co-immunoprecipitazione è un metodo potente ampiamente utilizzato dai ricercatori per analizzare le interazioni proteina-proteina. Questo processo offre un metodo rapido e semplice per separare una specifica proteina da un campione contenente migliaia di proteine diverse, come siero, lisato cellulare, tessuti omogeneizzati o media condizionata.

È una derivazione delle tecniche di immunoprecipitazione ed è impiegata per studiare l'interazione tra proteine. Si tratta di una pratica economica e relativamente semplice. È applicabile a diversi tipi di campioni (animali, lieviti, piante, ecc.).

Pull down assay

Il Pull down assay è una tecnica biochimica che consente di identificare i peptidi che interagiscono con una proteina specifica. La procedura coinvolge la fissazione della proteina bersaglio su una superficie solida, come per esempio perline magnetiche o un supporto di gel.

Successivamente, si aggiunge un campione contenente proteine potenzialmente interagenti con la proteina bersaglio. Le proteine target si legheranno alla proteina bersaglio fissata, mentre quelle non interagenti verranno lavate via.

Infine, le proteine legate vengono identificate e analizzate tramite tecniche biochimiche come l'immunoblotting o la spettrometria di massa per determinare la presenza e la natura delle interazioni proteina-proteina.

Rispetto alla co-immunoprecipitazione si utilizza una proteina bait. Lo si fa utilizzando un tag, di cui una parte, legandosi in modo specifico al target, permette di purificare la proteina di interesse in modo veloce e l'altra media il legame alle beats magnetiche.

Cross-linking

Il cross-linking è una tecnica impiegata per legare chimicamente due molecole o più tra loro, creando dei legami covalenti che fissano le relazioni tra le strutture molecolari. Nel contesto della biologia e della biochimica, il cross-linking può essere utilizzato per:

Stabilizzare le interazioni proteina-proteina: Questo aiuta a determinare le complessità proteiche e le interazioni all'interno di una cellula.
Fissare il legame tra proteine e acidi nucleici: Può essere impiegato per studiare l'interazione tra proteine e DNA/RNA.
Fissare le strutture proteiche: Aiuta a stabilizzare e studiare la struttura di proteine complesse o di complessi proteici.

Il processo coinvolge l'aggiunta di agenti cross-linking, come formaldeide o agenti bifunzionali, che formano legami chimici tra le molecole bersaglio. Questi legami possono essere reversibili o irreversibili a seconda del tipo di cross-linker utilizzato e del contesto sperimentale.

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