Biochimica

Biochimica lezione 1: Trascrizione e maturazione dell'RNA

Dogma centrale della biologia

Nell'uomo il flusso dell'informazione genica è unidirezionale: DNA → RNA → proteine, per ogni cellula ne abbiamo circa 5-6 mila. Nel DNA è conservata l'informazione genetica, l'RNA "esprime" il DNA nella cellula, mentre le proteine rappresentano la forma "operativa" del genoma. Si passa dal DNA all'RNA con la trascrizione, mediata dalla RNA polimerasi; mentre il processo che permette di passare dall'RNA alle proteine è la traduzione, che avviene nei ribosomi, qui avviene anche il "folding" delle proteine. Inoltre il DNA viene replicato dalla DNA polimerasi; in tutti questi processi sono coinvolte circa 2000 proteine (es. fattori di trascrizione).

Tipi di RNA

Esistono più tipi di RNA:

• mRNA → rappresenta l'1% dei trascritti
• rRNA → è associato ai ribosomi, permette il riconoscimento della tripletta AUG (open reading frame) da cui ha inizio la traduzione
• tRNA → trasportano gli aminoacidi nella traduzione

Il codice genetico è degenere: ogni aminoacido è codificato da più di una tripletta, così si è protetti dalle mutazioni. In seguito all'esposizione prolungata ai raggi UV, per esempio, il filamento di DNA si rompe e interviene la DNA polimerasi con attività di riparo: questa taglia le basi del filamento sovrastante, per poi replicare usando il filamento sottostante. La mutazione si ha nel momento in cui la DNA polimerasi sbaglia.

L'unità trascrizionale

Gene = RNA-coding region → insieme di nucleotidi, codifica per un trascritto che può essere mRNA o altro; è regolato dal DNA stesso, grazie a sequenze che si trovano a monte o a valle, a cui si legano i fattori di regolazione. Promotore = regione regolatoria, si può trovare a monte, a valle, oppure tra gli introni, regola l'espressione del gene. Unità trascrizionale = gene + promotore.

Distinzione del DNA

Si distinguono DNA:

• Cromosomale → è monocistronico, 1 gene = 1 proteina, ovvero da un trascritto otteniamo una proteina, senza contare i fenomeni di splicing;
• Mitocondriale → come il DNA dei procarioti è policistronico, il trascritto mRNA può produrre più proteine diverse.

Componenti dell'attività trascrizionale

Componenti basali → servono al reclutamento dell'RNA polimerasi, es. fattore sigma. Componenti costitutivi → sono sempre presenti, controllano l'efficienza dell'inizio di trascrizione, definendo i livelli minimi di trascrizione. Componenti regolatori → alterano l'efficienza dell'attività trascrizionale, aumentandola o diminuendola.

Si distinguono:

• Cis-acting elements → fattori di trascrizione che legano direttamente il DNA
• Trans-acting factors → legano i cis-acting elements, variandone la conformazione e quindi l'attività

RNA polimerasi

Abbiamo vari tipi di RNA polimerasi, con specificità diverse:

• RNA polimerasi I → trascrive gli rRNA
• RNA polimerasi II → è l'enzima che codifica per i geni, trascrive gli mRNA
• RNA polimerasi III → si lega ai geni che codificano per i tRNA

Fasi della trascrizione

• Inizio → avviene il legame tra l'RNA polimerasi e il promotore, oppure l'RNA polimerasi può essere già presente sul promotore, ma inattivo.
• Allungamento → nel momento in cui la RNA polimerasi si attiva, apre una bolla, denaturando l'elica e sintetizza l'RNA. Non abbiamo solo una RNA polimerasi, se è attivo abbiamo più enzimi in sequenza.
• Fine → l'RNA polimerasi si stacca. L'RNA polimerasi non ha bisogno di un primer (=innesco), a differenza della DNA polimerasi a cui servono i frammenti di Okazaki (primer) per replicare. Come fa l'RNA polimerasi a capire da dove iniziare? L'enzima inizia a trascrivere dal punto in cui si assembla il complesso di inizio, parte da uno dei due filamenti e da qui si allunga.

Procarioti

I procarioti hanno un promotore situato a 35 e 10 pb dal punto di inizio della trascrizione (convenzionalmente indicato con +1); queste sequenze prendono anche il nome di sequenze consensus. Essenziale è il fattore sigma, che si lega all'RNA polimerasi formando l'oloenzima, altrimenti l'enzima non riesce a riconoscere il sito di inizio.

• Slide 13 → si nota che le sequenze situate a 35 e 10 pb sono molto simili tra loro, questo perché i procarioti hanno un solo fattore sigma che lega entrambe le sequenze.
• Slide 14 → si notano gli aspartati all'interno dell'enzima, se questi dovessero mutare l'enzima non funziona.
• Slide 15 → abbiamo diversi fattori sigma, a seconda della risposta che la cellula mette in atto.

Allungamento e fine nei procarioti

Allungamento → si crea la bolla e il filamento si allunga a mano a mano che l'enzima si sposta.

Fine → può avvenire in 2 modi:

• Rho-dipendente → avviene grazie a proteine rho, proteine ad anello che si legano al trascritto e scorrono lungo di esso fino ad arrivare all'RNA polimerasi, la toccano, l'enzima cambia conformazione e si stacca.
• Rho-indipendente → non c'è rho, alla fine di questi geni sono trascritte delle basi con struttura a forcina → sequenza ricca di G e C che per abbassare l'entropia si appaiano. La forcina provoca un impedimento isterico che impedisce all'RNA polimerasi di continuare.

Eucarioti

Tutto è più complicato, abbiamo varie regioni a ognuna delle quali si lega qualcosa, in più abbiamo i fattori generali di trascrizione (es. TFIIA, TFIIB).

• Slide 22 → architettura di un promotore → gene PEPCK, codifica per la fosfoenolpiruvato carbossichinasi → ci sono diversi fattori della trascrizione, che regolano la trascrizione del gene.

Gene Cyp7a1 → codifica per la colesterolo-7-alfa-idrossilasi, connessa al metabolismo degli acidi biliari. Gli acidi biliari sono molecole anfipatiche, con una porzione idrofila e una idrofoba, sintetizzati dal fegato a partire dal colesterolo; funzionano da tensioattivo con i grassi → il 95% degli acidi sono riassorbiti, mentre il 5% sono eliminati con le feci. Nel momento in cui gli acidi biliari tornano al fegato, inibiscono l'enzima → quando arrivano la proteina mira nel nucleo, toglie i gruppi acetile dagli istoni, così la cromatina si compatta e la trascrizione non avviene.

Ci possono essere vari scenari, ma servono altri fattori → se questi mutano, la trascrizione non parte. Uno di questi fattori è la fosforilazione della coda carbossi-terminale dell'RNA polimerasi, questo consente un cambiamento conformazionale nell'enzima e quindi la sua attivazione.

Oltre a questi abbiamo il complesso del mediatore (700 proteine) che prende contatto con gli altri elementi regolatori, più distanti, e i fattori di rimodellamento della cromatina, necessari per allentare la cromatina, rendendola accessibile.

• Slide 21 → struttura del promotore "minimo", troviamo sequenze BRE, TATA, DPE. Tutto ciò avviene quando devo rallentare o potenziare la trascrizione di un gene e tutti questi elementi contribuiscono a formare il complesso di pre-inizio.

Maturazione

Si distinguono:

• Modificazioni post-trascrizionali → abbiamo l'aggiunta del capping all'estremità 5', che permette alle nucleasi di non demolire l'RNA che deve essere tradotto, avviene per metilazione della guanosina. Abbiamo poi la poliadenilazione → si aggiunge una coda di adenine, così l'mRNA è indirizzato a fare una proteina.
• Splicing

Dopo queste modificazioni l'mRNA è portato fuori nel citosol.

Modelli di terminazione della trascrizione

• Torpedo model → sul DNA c'è sequenza per il segnale di poliadenilazione; questa sequenza viene trascritta ed è riconosciuta da una proteina che si lega, taglia il filamento e fa l'adenilazione. Resta quindi un DNA senza cap, questo viene demolito dalle nucleari fino ad arrivare all'RNA polimerasi → toccano l'enzima facendole cambiare conformazione e quindi staccare dal filamento.
• Allosteric model → c'è sempre la sequenza per la poliadenilazione, questa viene come prima trascritta e la proteina taglia il filamento; a questo punto il filamento rimasto si arrotola e interagisce con l'RNA polimerasi, che si stacca.

Splicing

Processo in cui vengono tolti gli introni e restano solo gli esoni, ovvero le porzioni codificanti. Nel processo, le regioni 5’ e 3’ UTR (ovvero untranslated region) sono mantenute, perché qui si legano le proteine che portano l’mRNA nel citosol. Il meccanismo avviene grazie alla formazione di un cappio, dopodiché l’OH in 3’ sulla guanina lega il gruppo fosfato dell’altra guanina (slide 35). Lo splicing è mediato da circa 150 proteine chiamate snRNA, che favoriscono la reazione (non dal punto di vista catalitico) perché riconoscono per complementarietà le strutture evidenziate.

Nel 75% dei geni abbiamo lo splicing alternativo → posso riarrangiare in più modi esoni e introni, in modo da ottenere più mRNA a partire da un unico trascritto. Es. slide 40 → ho tre introni sul gene, posso tagliarlo in modo da ottenere più trascritti diversi; oppure posso mantenere frammenti intronici negli esoni, che funzionano da regolatori.

Esempio → troponina, a partire da un unico trascritto possiamo avere troponina alfa o beta. In base alla sequenza aminoacidica, abbiamo:

• siti strong → lo splicing avviene sicuramente
• siti weak → lo splicing può avvenire o non avvenire

Editing dell’mRNA

Es. apolipoproteina B → proteina con core lipidico, ha il compito di trasportare trigliceridi e acidi grassi nel plasma. Il fegato e l’intestino, pur avendo lo stesso gene, producono due proteine diverse, grazie all’editing dell’mRNA.

• Fegato → produce apoB100, proteina con 4563 aminoacidi
• Intestino → dallo stesso gene produce una proteina tronca apoB48, con 2153 aminoacidi

Questo perché a livello dell’intestino nell’esone 26 nel gene avviene un processo di editing: la citidina deaminasi deamina la citosina, ottenendo in questo modo l’uracile. Si passa così da CAA, che codifica per un aminoacido, a UAA, codone di stop → la traduzione si ferma, proteina tronca.

Lezione 2: La traduzione

Il codone di inizio è sempre AUG, che codifica per la metionina, la quale poi viene tolta durante o dopo la traduzione. Al processo partecipano rRNA e ribosomi, diversi tra procarioti ed eucarioti per massa molecolare → negli eucarioti abbiamo ribosomi 60S e 40S, dove S è la velocità di sedimentazione in ambiente viscoso.

tRNA → sono sintetizzati a partire dal genoma e sono rappresentati da una struttura a trifoglio, importante è la loro specificità, infatti ne abbiamo almeno 20, uno per ogni aminoacido. Sul tRNA abbiamo l’anticodone, tripletta complementare a quella sull’mRNA. Importante è il legame tra il tRNA e l’aminoacido corretto → questo legame avviene a livello dello stelo accettore, dove c’è un’adenina in 3’, qui si attacca in maniera specifica l’aminoacido. È l’enzima che carica l’aminoacil-tRNA sintasi, catalizzando un legame estereo ad alta energia, la rottura di questo legame fornisce l’energia necessaria per formare il legame peptidico.

I tRNA sono specifici per l’aminoacido che portano e per il codone che leggono → es. se uno stesso aminoacido è codificato da due codoni diversi, avremo due aminoacil-tRNA sintasi, ognuno dei quali riconosce un codone. Indispensabile alla formazione del legame è la reazione di idrolisi di ATP, ricavata dalla fosforilazione ossidativa → la sintesi proteica avviene in presenza di energia. Se non ci sono le condizioni nutrizionali, la traduzione non avviene, es. perdita del ciclo mestruale. Sull’aminoacil-tRNA sintasi c’è un sito di legame per l’ATP.

• Slide 7 → nel 1966 Crick formula la wobble hypothesis → è sufficiente che il tRNA riconosca due basi, la terza non è importante; anche se muta, l’aminoacido viene comunque codificato; la mutazione causa problemi quando interessa le prime due basi. In questo modo la sintesi proteica viene velocizzata.

Caratteristiche del codice genetico

• I codoni vengono letti in direzione 5’ → 3’
• Non è ambiguo ed è degenerato
• I codoni non si sovrappongono ed il messaggio non contiene interruzioni
• La reading frame è fissa, determinata dal codone iniziale AUG, altrimenti troverei codoni di stop e avrei proteine tronche. Il significato del codice può cambiare in presenza di mutazioni.

Struttura dell’mRNA

Procarioti → l’rRNA ribosomale 16S è complementare alla sequenza di Shine-Dalgarno, importante per il riconoscimento di RBS (= ribosome binding site). RBS dista circa 3-9 pb da AUG, da cui ha inizio la traduzione.

Eucarioti → c’è la sequenza di Kozak, la quale riconosce che a breve ci sarà AUG. Sul ribosoma si possono individuare tre siti:

• P → peptidilico
• A → aminoacilico
• E → exit

A questi siti sono legati fattori della traduzione → nei procarioti abbiamo IF1 e IF3, negli eucarioti hanno altri nomi ma svolgono la stessa funzione.

Il codone AUG si trova nel sito P, nel sito A arriva il secondo codone e qui arriva il tRNA con il secondo aminoacido → tra i due aminoacidi si forma il legame peptidico; dopodiché il tRNA scarico va nel sito E e da qui viene rilasciato nel citosol.

Essenziale è il corretto appaiamento tra mRNA e tRNA (slide 18) → il legame tra il tRNA e l’mRNA (sopra) è più forte del legame tra l’mRNA e l’rRNA (sotto); questo perché tra tRNA e mRNA i legami sono tra basi complementari → si trova il giusto equilibrio per mettere il giusto aminoacido e per permettere il corretto scorrimento in avanti.

Terminazione

Si ha quando nel ribosoma entra un codone di stop: le subunità del ribosoma vengono riciclate e la proteina viene portata al RER per ulteriori modificazioni.

Lezione 3: Regolazione della trascrizione

La regolazione della trascrizione è un processo che esiste a vari livelli. Es. se una proteina è continuamente degradata, cosa avviene? Ci può essere effettore bound, per cui l'mRNA continua ad essere trascritto; al tempo stesso se c'è il trascritto non è detto che ci sia la proteina.

Trascrizione e traduzione sono accoppiate → la sintesi e la degradazione del trascritto avvengono quasi contemporaneamente, per cui se il trascritto non va nei ribosomi viene degradato dalle RNA-asi. I geni regolatori svolgono un ruolo essenziale nella regolazione della trascrizione; la regolazione può essere positiva o negativa, inducibile o reprimibile. I circuiti regolatori consentono di controllare l'espressione genica, non inducendo o reprimendo del tutto, ma modulando la risposta.

Induzione negativa

Abbiamo una proteina regolatrice prodotta da un gene regolatore, la proteina regolatrice si lega al gene bersaglio, sul gene strutturale. In questo caso la proteina è un repressore, lo troviamo nella forma attiva; nella forma attiva il repressore si lega al DNA, impedendo la trascrizione del DNA. Se qualcosa si lega al repressore, questo cambia conformazione e non è più in grado di legare il DNA → il gene risulterà essere quindi trascritto.

Induzione positiva

Il gene regolatore ora produce un attivatore inattivo, non in grado di legarsi al DNA → il gene strutturale non sarà represso. Se qualcosa si lega all'attivatore, questo passa da una conformazione inattiva a una conformazione attiva → si lega quindi al DNA e il gene risulterà trascritto.

Repressione negativa

Il gene regolatore codifica per un repressore inattivo, non è in grado di legarsi al DNA e il gene sarà trascritto. Se qualcosa si lega al repressore, la sua conformazione cambia, si attiva ed è in grado di legarsi al DNA → il gene risulta represso.

Repressione attiva

Il gene regolatore codifica per un attivatore attivo, si lega al DNA inducendo la trascrizione del gene. Se qualcosa si lega all'attivatore, questo cambia conformazione perdendo il legame con il DNA → il gene risulta represso.

• Slide 12 → alcuni regolatori trascrizionali inducono cambiamenti conformazionali nell'RNA-polimerasi, queste modificazioni allosteriche attivano l'enzima.
• Slide 13 → alcuni regolatori inducono cambiamenti strutturali nel DNA: in questo caso si ha la presenza di una proteina che curva il DNA, rendendo così possibile l'interazione tra il DNA e l'attivatore.

Esempio di regolazione della trascrizione: Operone lac

L'operone lac ha tutti e quattro i tipi di regolazione. Operone → sequenza di nucleotide che servono a determinare l'espressione genica di determinati set di geni. I batteri ottengono il carbonio di cui necessitano dagli zuccheri, preferibilmente dal glucosio e in assenza del lattosio (glucosio + galattosio). L'operone Lac consente ai batteri di metabolizzare il lattosio, questo comprende 3 geni:

• LacZ → gene strutturale per β-galattosidasi → produce glucosio, galattosio e allolattosio.
• LacY