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BIOCHIMICA

LEZIONE 1

Dogma centrale della biologia: nelle cellule umane si va da DNA a proteine, passando per

RNA, poi ci sono organismi che possono fare processo inverso (es retrovirus), ma il dogma

è che c’è una direzione univoca. Quante proteine contiene una cellula? Circa 5 mila-6 mila,

e i trascritti quanti sono? Circa 40 mila, chi codifica per una proteina nel trascritto? Solo RNA

messaggero, che tra tutti i trascritti è solo l’1% o meno.

Le proteine sono 5 mila circa, ma la cellula non esprime tutte quelle proteine insieme, a

seconda degli stimoli, uno stimolo extracellulare è qualcosa che provoca una risposta nella

cellula. Il DNA si replica grazie ad una serie di enzimi tra cui la DNA polimerasi, il DNA viene

trascritto: il DNA è a doppia elica, il trascritto a singola elica complementare a un filamento e

identico all’altro, tutto ciò avviene nel nucleo. Prodotto RNA, questo esce nel citoplasma, si

forma il ribosoma e avviene la traduzione, la proteina deve poi essere foldata

(impacchettata) cioè bisogna dargli una struttura tridimensionale per svolgere il suo ruolo nel

reticolo endoplasmatico. Quante proteine sono coinvolte in questi processi? Circa 2 mila,

proteine per la replicazione, fattori per la trascrizione.. prodotto RNA messaggero, si produce

il trascritto primario, ma nell’uomo c’è la regolazione data dallo splicing: da un trascritto

posso produrre proteine diverse, che saranno tutte isoforme della stessa proteina. Oltre allo

splicing, c’è la regolazione dell’esporto: altre proteine che si legano per portarlo fuori, per

essere tradotto ci sono sequenze segnale che dicono al ribosoma dove partire. Esistono

almeno 3 RNA: ribosomiale (acidi nucleici a singola elica che si associa alle proteine del

ribosoma, perché il ribosoma ha bisogno di un acido nucleico? Il ribosoma, per incorporare il

filamento, deve riconoscere da dove iniziare a leggere, perché la proteina degli eucarioti

inizia da una metionina codificata dal codone AUG, ma in un RNA non c’è un solo AUG,

come fa il ribosoma a dire parto da qui? Deve trovare l’open reading frame (punto da cui il

ribosoma parte per fare la proteina intera). Altro RNA è il tRNA, RNA di trasporto degli

amminoacidi, quanti ce ne sono? Il codice genetico è degenerato (ci sono più triplette che

codificano per uno stesso amminoacido), perché? I raggi UV possono causare dimeri di

timina, perché il raggio UV interferisce sul DNA, si rompe il legame 5’-3’ fosfodiestere, se si

rompe il legame li, abbiamo estremità 5’ o 3’ libero, interviene la DNA polimerasi (la

polimerasi ha tre attività: una polimerasica, correttore di bozze o proof reading in direzione 5’

3’ quindi controlla di aver messo le basi giuste, riparo).

La polimerasi dove si lega? Al 3’, quindi arrivano le polimerasi, una si lega ad un 3’ libero,

un’altra ad un altro..la direzione della polimerasi è 5’-3’, siccome deve riparare, la prima

cosa che fa è quella di eliminare tutto e copiare sulla base della base che c’è nell’altro

filamento, la mutazione c’è quando la polimerasi sbaglia, le mutazioni sono più frequenti

negli anziani perché le polimerasi sono meno efficienti. Quindi per ogni buco si attacca una

polimerasi, elimina, mette il nucleotide corretto e chiude. Il tumore si ha perché si ha una

mutazione spontanea dovuta al riparo scorretto, per questo gli anziani sviluppano tumori più

facilmente. Quindi ci sono almeno 20 tRNA nel citosol, poi almeno altri 20, perché nella

cellula c’è il DNA genomico e quello mitocondriale, abbiamo più mitocondri in una cellula, a

seconda della cellula abbiamo più o meno copie del DNA mitocondriale. Il DNA

mitocondriale si eredita dalla madre, quindi se la mamma è un’atleta, lo saremo anche noi,

se la mamma ha una mutazione a livello del DNA mitocondriale, la avremo anche noi.

Perché si eredita dalla mamma? È ancora oggetto di studio, la cellula uovo femminile è la

cellula più ricca di DNA mitocondriale, se uno spermatozoo la feconda, ha tanti mitocondri

ma la quantità è inferiore, quindi la cellula uovo attiva enzimi che degradano il DNA

mitocondriale maschile, ma ci sono più risposte.

Il DNA mitocondriale è di origine batterica, infatti è DNA circolare non protetto, più esposto a

mutazioni: quello che avevamo alla nascita è molto diverso da quello che abbiamo ora.

Ci sono poi gli mRNA che sono la quota più bassa, ma ci sono anche altri tipi di RNA: small

nuclear RNA, miRNA..

Cos’è un gene? È un insieme di nucleotidi che comprende introni ed esoni, che produce un

trascritto, ma un gene funziona sempre? No, chi regola il gene? Il DNA stesso tramite

proteine di regolazione che si legano al DNA nelle sequenze di regolazione che stanno a

monte ma anche a valle ma anche in mezzo agli introni, quindi c’è una regione che si

chiama promotore (regione regolatoria) che sta o prima delle sequenze o negli introni o alla

fine, quanto è lungo un promotore non è possibile definirlo. L’unità trascrizionale comprende

gene e promotore. Il promotore regola l’espressione del gene sia in maniera positiva sia

negativa (inibizione).

Il DNA mitocondriale è policistronico (se ho DNA circolare ho una polimerasi che si attacca in

un punto e produce un unico trascritto, quindi in quel trascritto ci sono tutti i geni che devono

essere codificati in quel trascritto), così è anche il DNA procariotico. Il DNA genomico degli

eucarioti è monocistronico: da un gene una proteina, a parte quando abbiamo splicing (un

gene più proteine).

Per attività trascrizionale si intende la velocità di sintesi di RNA: numero di trascritti

sintetizzati nell’unita di tempo e riflette la velocità di inizio al sito di origine della trascrizione.

Le componenti basali servono al reclutamento dell’RNA polimerasi, permettendo alla

trascrizione di iniziare: la maggior parte dei geni ha la polimerasi già lì sul gene ma non

funziona, devo reclutare qualcosa che attivi la polimerasi, di solito le componenti basali

fanno parte del complesso di pre inizio, quindi la polimerasi può essere reclutata ma anche

essere già lì sul promotore, quindi per funzionare servono le componenti basali per dare

segnale di partenza. I componenti costituitivi ci sono sempre, se tolgo quella proteina, la

trascrizione non avviene più, servono a controllare l’efficienza di trascrizione (quando si

parla di trascrizione basale, un gene ha sempre un minimo di trascrizione, poi posso andare

a regolare in modo da accelerare o diminuire questa trascrizione, ma non andrò mai a 0), i

componenti costitutivi servono a definire i livelli basali dell’attività trascrizionale di ogni gene.

I componenti regolatori alterano l’efficienza dell’inizio di trascrizione, aumentando o

diminuiscono l’attività trascrizionale di un determinato gene.

Tutti i fattori di trascrizione legano il DNA? No, alcuni interagiscono fisicamente con esso,

altri interagiscono con i fattori legati al DNA, quando una proteina interagisce produce una

modifica conformazionale che cambia l’attività, gli elementi che legano direttamente il DNA si

chiamano elementi che agiscono in cis, gli altri che interagiscono con i fattori legati al DNA si

chiamano elementi che agiscono in trans.

Esistono una serie di RNA polimerasi con specificità diverse: la polimerasi 2 si siede sui geni

che codificano per un mRNA, la 3 si lega ai geni che servono per trascrivere il tRNA, quindi

hanno una specializzazione, la 1 lega i geni che codificano per rRNA.

Come procede la trascrizione? Tre fasi. Una fase di legame della polimerasi, se il gene non

ha l’RNA polimerasi reclutata, cosa fa la polimerasi? Deve aprire una bolla da cui inizia la

trascrizione e inizia a produrre l’mRNA (fase di inizio), poi fase di allungamento e fase di

terminazione. Si lega una polimerasi alla volta? No, appena una libera il sito di inizio, se ne

lega un’altra. L’RNA polimerasi non ha bisogno di primer per partire (la DNA polimerasi si),

quindi al suo interno è in grado di fare una piccola denaturazione dell’elica che deve essere

srotolata, come fa a capire dove deve iniziare? Il complesso di inizio si assembla sempre

nello stesso punto in un gene, se c’è la TATA box viene riconosciuta quella, dove si

assembla il complesso di pre inizio è il sito di inizio della trascrizione, con la sequenza AUG,

quindi nella bolla inizia sintesi di RNA, si apre la bolla e la polimerasi inizia a sintetizzare su

uno dei due filamenti, uno dei due a seconda dei geni, e poi inizia l’allungamento. Nei

procarioti c’è un promotore a -35 o -10 (+1 è sito di inizio della trascrizione), il fattore sigma

é un fattore di inizio della trascrizione, quindi posso avere la polimerasi legata, ma senza il

fattore sigma non inizia la trascrizione. Tra tutti i geni, le sequenze a -35 e -10 sono

abbastanza simili, perché i batteri hanno un unico fattore di trascrizione che è il fattore sigma

che si lega sul -10 con la porzione grossa e con la coda sul -35.

La polimerasi prende nucleotide, stacca il gruppo fosfato e lo attacca costituendo il nuovo

filamento costituendo legame 5’-3’ fosfodiestere. Ci sono una serie di fattori sigma, ognuno

specializzato in qualcosa (ad esempio, uno interviene in caso di shock termico..). Si lega la

polimerasi, si crea la bolla, inizia a trascrivere su uno dei due filamenti finché non viene

trascritto tutto l’RNA, come termina la trascrizione? Nei procarioti ci sono due meccanismi:

terminazione Rho dipendente o terminazione Rho indipendente. Meccanismo Rho

dipendente: la polimerasi arriva alla fine del gene, la proteina Rho è un anello che entra

nell’RNA nascente e prende contatto con la polimerasi, se prende contatto con essa, c’è

cambiamento conformazionale, blocco l’attività della polimerasi e si stacca l’RNA. Su altri

geni invece Rho non è stata trovata, come termina la trascrizione? Alla fine di questi geni,

l’RNA nascente ad un certo punto, facendo il complementare, abbiamo una sequenza che

induce una forma di forcina, impedendo l’avanzamento della polimerasi, quindi la polimerasi

si stacca. Come si forma la forcina? C’è regione ricca di G e C che per diminuire l’entropia si

appaiano.

Negli eucarioti, la questione è un po’ più complessa: sito di inizio della trascrizione, regioni

regolatorie, il sito di inizio è il sito dove si assembla il complesso di inizio, ma non dove inizia

la trascrizione: ci sono elementi regolatori anche dopo. Il promotore è più complesso di

quello procariotico, abbiamo molte regioni su cui si lega qualcosa. Es: gli acidi biliari

(contenuti nella bile che sta nella cistifellea), sono anfipatici, fatti da colesterolo idrossilato.

Gli acidi biliari sono tensioattivi, formano una micella dentro cui mettono i trigliceridi che poi

possono essere assorbiti nell’intestino, il 5% di acidi biliari vengono eliminati tramite le feci, il

resto assorbito nell’ileo. La sintesi degli acidi biliari dipende dalla colesterolo 7 alfa

idrossilasi, gli acidi biliari che tornano al fegato devono inibire questo enzima. Perché questo

enzima viene spento dagli acidi biliari? Quando arrivano gli acidi biliari, un istone deacetilasi

migra nel nucleo andando a togliere i gruppi acetili dagli istoni e il gene si reprime perché si

compatta la cromatina, quindi i fattori di trascrizione non possono più accedere (cromatina

acetilata è aperta).

Negli eucarioti o ho già l’RNA polimerasi o devo reclutarla, in ogni caso, non funziona da

sola, devono essere reclutati altri fattori: la polimerasi ha una coda carbossiterminale su cui

ci sono dei siti di fosforilazione, le proteine reclutate sono in grado di fosforilare la coda, la

prima fosforilazione fa cambiare conformazione alla polimerasi, la seconda la fa spostare.

Oltre a questi fattori, si recluta il complesso del mediatore che serve a prendere contatto con

tutti gli altri elementi regolatori che si trovano a migliaia di paia di basi di distanza, poi sono

reclutati rimodellatori della cromatina che la acetilano per andare ad aprirla e consentire la

trascrizione.

(La trascrizione basale non richiede tutte queste componenti, solo quando devo accelerare o

rallentare la trascrizione di un determinato gene).

Mano a mano che questo avviene, si inizia a trascrivere, si mette un capping che consente

di proteggere da una eventuale nucleasi che potrebbe tagliare questo filamento.

Una volta che sta avvenendo la trascrizione, sull’mRNA devono avvenire modificazioni post

trascrizionali e lo splicing, la prima modificazione è il capping all’estremità 5’ ovvero

aggiungere un segnale, è una modificazione chimica: si metila una guanosina che diventa 7

metil guanosina, quindi ho aggiunto il capping che protegge l’mRNA. Altra modificazione:

quando finisce la trascrizione come faccio a dire la cellula che quello è un mRNA per

mandarlo nel citosol per essere tradotto? Si aggiunge la coda di poli adenilazione, tutte

adenine (poliA, circa 200) solo all’mRNA, mano a mano che si arriva alla fine della

trascrizione, c’è una sequenza che richiama proteine che tagliano e attaccano questa

sequenza di poliA. L’mRNA viene poi legato da altre proteine che lo portano nel citosol.

Come termina la trascrizione negli eucarioti? Due modelli:

-torpedo model, quando l’RNA passa sulla sequenza per il segnale per la poli adenilazione,

si legano le proteine che tagliano subito dopo la sequenza di poli A e aggiungono le adenine

e rimane questo mRNA che non ha più il capping, arriva una nucleasi che lo degrada fino a

toccare la polimerasi modificandola conformazionalmente, così perde la polimerasi e si

stacca

-modello allosterico, abbiamo sempre poli A, l’RNA polimerasi riconosce che un pezzo è

stato tagliato e quindi è stato visto che questo pezzo tagliato si ripiega e forma una sorta di

gomitolo che blocca la polimerasi e la fa staccare, il pezzo tagliato viene poi degradato.

C’è poi lo splicing, se ho un trascritto primario di RNA, questo comprende sia intorni che

esoni, il trascritto maturo deve essere formato solo da esoni (porzione codificante). Nel

trascritto maturo si tengono le regioni 5’ non tradotta e 3’ non tradotta perché sono quelle

che scortano l’RNA nel citosol. Come avviene lo splicing? Ci sono sequenze che lo

inducono, c’è un’adenina che fa attacco nucleofilo ad una guanina formando un cappio,

quindi un OH che è rimasto libero si lega ad un ad un fosfato, si perde un introne e si attacca

l’esone all’altro esone.

Per fare questo, sono coinvolte 150 proteine che atterrano sull’introne e favoriscono la

reazione, servono per riconoscere per complementarietà le strutture necessarie

(riconoscono le guanine in fondo e l’adenina in mezzo).

Nel 75% dei geni circa, avviene lo splicing alternativo: posso produrre una serie di RNA

maturi, se ho ad esempio esone 1, esone 2 e esone 3, posso produrre RNA 1-2, 2-3, 1-

3..oppure abbiamo casi di introne mantenuto. Ci sono siti di splicing strong o siti weak, dove

lo splicing può o non può avvenire, dipende dalla sequenza degli introni.

Es: la troponina, trascritto primario, con uno splicing posso avere mRNA dell’alfa troponina T

o con un altro mRNA della beta troponina T.

Lo splicing è un meccanismo di regolazione post trascrizionale, altro esempio è l’RNA

editing, di cui c’è un solo esempio. Le apolipoproteine (le lipoproteine sono trasportatori di

acidi grassi e trigliceridi nel nostro organismo poiché il plasma è idrofilico, le apolipoproteine

sono la porzione proteica di queste lipoproteine), quando mangiamo l’intestino produce i

chilomicroni che prendono i trigliceridi, nel tessuto adiposo i trigliceridi passano li e liberano i

chilomicroni che lasciano colesterolo nella lipoproteina che diventa LDL (low density

lipoprotein) che va in periferia e deposita il colesterolo. Anche il fegato produce lipoproteine

a bassissima densità, ricche di trigliceridi. Se mangio una torta e non ne ho bisogno, i

trigliceridi sono accumulati per riserva, ma lo zucchero viene trasformato in acido grasso

attraverso il fegato e sono trasportati con le very low density lipoprotein, andando a costituire

tessuto adiposo.

Sia i chilomicroni sia il fegato hanno come principale apolipoproteina l’apoB100, solo che

l’intestino, pur avendo lo stesso gene, produce una proteina tronca, che è apoB48.

Il gene sono 26 esoni, nel fegato, se faccio traduzione di questa ho l’apoB100 che serve a

mandare l’eccesso di energia al tessuto adiposo sottoforma di trigliceridi, l’intestino, dovendo

produrre i chilomicroni che sono molto più grossi delle very low density lipoprotein, ha

bisogno di questo gene per l’apoB100, ma nell’esone c’è una tripletta CAA che nell’intestino

viene convertita in UAA, perché nell’intestino c’è la citidina deaminasi che deamina la

citosina e la fa diventare uracile, quindi quando il messaggero va nel citosol degli enterociti,

quando arriva li, il ribosoma si ferma generando una proteina tronca: apoB48.

LEZIONE 2: TRADUZIONE

Negli eucarioti il codone di inizio è sempre AUG e amminoacido è sempre metionina, chi

sono gli attori della traduzione? mRNA e ribosomi, leggermente diversi tra procarioti ed

eucarioti anche se fanno la stessa cosa, cambia la massa molecolare, circa 2 milioni e

mezzo per i procarioti e il doppio negli eucarioti. Sono come un panino dell’hamburger con

una parte superiore grande e una piccola, questa è la parte proteica, i ribosomi sono

associati a rRNA, diversi se consideriamo eucarioti e procarioti. Altro attore nella traduzione

sono i tRNA, normalmente rappresentati a trifoglio,