Biochimica - Appunti

STUDIO DELL’EQUAZIONE DI M&M

Dallo studio dell’equazione, il primo parametro da studiare è la Km, una costante che varia in

associazione all’enzima usato e al tipo di reazione che consideriamo, è una costante derivante da

altre costanti di associazione e dissociazione dell’enzima stesso.

È possibile calcolare la Km anche praticamente mediante un grafico, la sua utilità sta nel

determinare se l’enzima è affine o no al substrato: se la Km è molto piccola, l’affinita enzima-

substrato è grande se invece la Km è grande la sua affinità ne risente.

Un'altra costante che possiamo trovare è il numero di turnover, chiamato Kcad, questa costante si

calcola facendo la Vmax/[E], è quindi una costante calcolabile sperimentalmente e non rientra

nell’equazione di M&M.

La Kcad serve per avere un indice della velocità di ricircolo del’enzima nella reazione, in poche

parole serve per capire se l’enzima usato è buono nei confronti del substrato.

Usare queste due costanti è necessario per calcolare l’efficienza dell’enzima.

La formula usata è Kcad/Km, in tal modo possiamo vedere se l’enzima è efficace o no, un ottimo

grado di efficienza lo otteniamo con una Kcad alta e una Km bassa, ma se queste condizioni non

sussistono, può essere che un valore compensi leggermente altro, rendendo comunque efficiente

l’enzima.

È utile poi aggiungere che non tutti gli enzimi seguono la cinetica di M&M

GRAFICO DI LINEWEAVER- BURK 32

Questo ti po di grafico è chiamato anche grafico dei doppi reciproci, è una manipolazione

matematica dell’equazione di M&M, questa equazione graficamente porta all’origine di una

parabola che tende a un valore Y sul grafico. da questo grafico possiamo solo vedere

che la velocità dell’enzima è funzione

della concentrazione del substrato e che

tende a un valore che è la velocità

massima a cui l’enzima può operare.

Da questo grafico non è possibile invece

estrapolare dati come il valore della

velocità, o della costante Km e di

conseguenza sapere il valore

dell’efficienza o il numero di turnover.

Un metodo per calcolare questi dati è sfruttare il grafico dei doppi reciproci che lo si trova

mediante un elaborazione matematica della formula di M&M.

Se facciamo il reciproco della formula di M&M otteniamo:

1/Vo = ( Km +[S])/(Vmax*[S])

Scomponendo la seguente formula otteniamo:

1/Vo = KM/Vmax *(1/[S]) + 1/Vmax

Questa equazione è una retta, quindi tracciando il grafico di questa retta possiamo trovare la Vmax

facendo il reciproco dell’intersezione della retta con l’ordinata Y e trovare la Km con l’intersezione

con l’ascissa X

REAZIONE A DUE SUBSTRATI 33

Alcuni enzimi possono anche reagire con più di un substrato ( solitamente un enzima reagisce con

molti substrati, ma per capirne i meccanismi si considerano quelli che reagiscono solo con uno)

I meccanismi con cui agiscono questi enzimi sono differenti, ma le strade che seguono sono

prevalentemente 2

La prima prevede la formazione di un composto ternario, cioè l’enzima legato ad entrambi i

substrati, facendo entrare in modo ordinato le due molecole o in modo casuale

La seconda non prevede la formazione di un composto ternario

Le due tipologie di reazione le si riconosce dal grafico dei doppi reciproci

Nel’esempio a di vede le rette

incrociano tutte, ed è il caso della

formazione di un complesso ternario,

piu la concentrazione di 1/S cresce e

più la retta è in pendenza per un

aumento dei parametri di

concentrazione e di una km

relativamente piccola.

L’aumento della velocità non è più

proporzionale ( non segue più un

andamento rettilineo) alla

concentrazione di substrato [S2].

Se invece consideriamo il caso b cioè

dove non c’e alcun complesso

ternario allora abbiamo tante rette in

parallelo, l’andamento è lineare,

all’aumentare della concentrazione di

1/S la velocità aumenta

proporzionalmente

Questi grafici sono disegnati tenendo costante S1, che quindi non varia ma facendo variare S2, in tal

modo possiamo rappresentare come tante rette questi grafici e leggerli più semplicemente.

INIBITORE 34

Gli inibitori, sono macromolecole organiche che si legano covalentemente ai substrati degli enzimi.

Queste macromolecole sono essenziali per lo svolgimento delle attività cellulari, un enzima a volte

diventa obsoleto e risulta inutile, quindi è necessario inibire le sue attività enzimatiche per poi

smantellarlo.

Esistono due tipi di inibitori.

Il primo tipo è chiamato inibitore irreversibile, questo inibitore è una macromolecola che ha la

stessa forma del substrato al quale si lega l’enzima, ma con quest’ultimo crea legami covalenti, che

sono più forti e stabili del legame enzima-substrato, in tal modo il sito attivo risulta occupato e

l’enzima non può più compiere la sua attività catalitica (quando un inibitore irreversibile reagisce

con un enzima da il via a reazioni chimiche)

Gli inibitori di tipo reversibile sono differenti, reagiscono con un enzima e lo inibiscono legandosi

al loro sito attivo mediante legami deboli, cosi da poterli scindere se necessario.

Esistono due categorie di inibitori reversibili, quelli chiamati inibitori competitivi, dove l’inibitore

va a reagire e a inibire l’enzima, cosi fa diminuire la quantità di enzima e porta un aumento di

quella del substrato, questo provoca un aumento della Km e una diminuzione dell’affinità tra

enzima e substrato che porta la catalisi a una completa inibizione.

Usando i grafici dei doppi reciproci è possibile capire quando l’inibizione è competitiva.

la concentrazione di I, l’inibitore aumenta nelle

tre rette, e tutte e tre si incontrano in un

intersezione sull’asse delle Y in corrispondenza

della Vmax.

Dato che però se studiamo il grafico normale

non quello dei doppi reciproci, il grafico è

sempre asintotico alla velocità massima, il che

vuol dire che aumentando la concentrazione di

substrato presente è possibile riattivare l’enzima

inibito.

Questo è lo stesso meccanismo per la cura

dall’intossicazione di metanolo, introducendo

etanolo l’enzima si riattiva e può smaltire

l’alcool correttamente.

L’altra tipologia di inibitore reversibile sono gli inibitori non competitivi, questo genere di inibitore

lega sia con il sito attivo dell’enzima libero sia con altre parti dell’enzima quando è legato al

substrato, la sua efficacia non dipende dalla concentrazione di substrato presente, quindi è un

enzima non competitivo. Questo inibitore porta a una variazione della conformazione della proteina

che costituisce l’enzima, che cosi viene inibita. Dal grafico dei doppi reciproci, si può vedere

come riconoscere questo tipo di inibizione, le

diverse rette a diversa concentrazione di

inibitore intersecano tutte sull’asse delle X.

L’inibizione causa una diminuzione della

Vmax ma non fa variare la Km 35

REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA ENZIMATICA

L’attività di un enzima è una forma di controllo che permette al nostro corpo di inibire o scatenare

certi enzimi, esistono delle forme di controllo che partono già dalla creazione dell’enzima stesso,

alla nascita l’enzima può essere creato sotto forma di zimogeno, cioè una forma non attiva della

proteina enzimatica che successivamente può essere attivata.

Questo lo si fa per poter produrre gli enzimi e conservarli per il momento dell’utilizzo.

Esistono altri sistemi di regolazione che possono prevedere diverse vie di controllo

Una prima via di controllo prevede dei meccanismi lenti che sfruttano la concentrazione

del’enzima, la repressione o l’attivazione della trascrizione della proteina che forma l’enzima o

ancora modificazioni nella traduzione.

Una seconda via di controllo sempre con meccanismi lenti vede la disgregazione dell’enzima

mediante prodotti proteolitici, o la modificazione irreversibile della struttura enzimatica

Una terza e ultima via di controllo è quella della fosforilazione dell’enzima che può attivarlo o

inibirlo, il cambiamento avviene a livello molecolare quando l’enzima fosforilato cambia la sua

conformazione.

ENZIMI ALLOSTERICI

Gli enzimi allosterici sono una classe di enzimi che non segue la cinetica si M&M vista fino ad ora,

sono una classe a parte, la regolazione allosterica avviene mediante effettori allosterici che si legano

all’enzima e ne cambiano leggermente la conformazione permettendo a un substrato di legarsi.

Si dice che il legame di un enzima allosterico sia cooperativo, cioè all’inizio il legame tra l’enzima

e il substrato sia difficile e poco favorita, ma dopo che il primo legame è avvenuto l’affinità

aumenta e quindi la reazione diventa più veloce.

Gli enzimi allosterici sono solitamente strutture quaternarie formate da proteine di struttura

terziaria, e per questo sono chiamate anche oligomeri.

Un esempio di proteina allosterica è l’emoglobina, ma non è un enzima!.

Questo genere di enzimi sono collocati all’inizio di una via biosintetica o durante una sua

diramazione.

Anche questi enzimi subiscono processi di regolazione e di inibizione

REGOLAZIONE DA FEED-BACK

Questo genere di regolazione è una delle più sfruttare dal nostro organismo,

permette a una via biosintetica di sfruttare i prodotti che crea per inibire i

passaggi iniziali in modo tale da non usare altre molecole per inibire gli

enzimi.

Questo genere di regolazione lo si trova in processi come la glicolisi o in altre

vie di tipo fermentativo.

Un feedback può essere negativo come nel caso che avvenga un rallentamento

dell’attività biosintetica o positivo nel caso opposto in cui ci sia un aumento

della velocità dell’attività. 36

ZUCCHERI

Gli zuccheri, chimicamente chiamati carboidrati, sono una struttura formata unicamente da atomi di

carbonio, idrogeno e ossidrili (a volte possiamo trovare anche gruppo fosfato, amminici o solfati

legati a questi zuccheri).

Sono strutture organiche che si presentano suddivise in due classi, zuccheri aldeosi e chetosi, questo

perché nella loro forma lineare troviamo anche questi gruppi carbonilici che determinano diverse

proprietà per uno zucchero.

Il nome che si da allo zucchero è dipendente dal gruppo carbonilico presente e dal numero di atomi

di carbonio che compone la sua struttu