Biochimica - Appunti

Corso di biochimica per biotecnologie

Amminoacidi

Le proteine sono tra le macromolecole che compiono più ruoli nel nostro organismo, hanno molte funzioni, enzimatiche, ormonali, trasportatrici e recettoriali. Il fatto che possano compiere un così gran numero di compiti è determinato dal fatto che esistono migliaia di proteine diverse di diverse lunghezze e con forme tridimensionali che gli permettono di svolgere compiti diversi in vari ambiti cellulari.

Come abbiamo già detto, le proteine sono macromolecole polimeriche, cioè sono formate da diverse sub-unità chiamate monomeri. Questi monomeri sono gli amminoacidi, una struttura formata da un gruppo amminico e uno carbossilico. I due gruppi funzionali sono ciò che caratterizza la struttura come amminoacido, ma ciò che dà le diverse proprietà agli amminoacidi è il gruppo R, questo gruppo è diverso per ogni amminoacido così da avere tanti amminoacidi con caratteristiche differenti.

Gli amminoacidi in natura sono 64, ma l'evoluzione del nostro sistema biologico ha portato a usarne solo 20 di questi. La diversa combinazione di questi 20 amminoacidi genera le migliaia di strutture proteiche che il nostro organismo sfrutta per le sue necessità. Questi 20 amminoacidi si dividono in essenziali e non, cioè alcuni amminoacidi, quelli detti essenziali, il nostro corpo non è in grado di produrli e quindi è necessario introdurli con una dieta corretta.

Studiare gli amminoacidi e cosa determina la loro presenza è a dir poco fondamentale, per esempio un'alta concentrazione dell'acido glutammico nel cervello è segno della possibilità del morbo di Alzheimer. Altri invece sono necessari per le vie biosintetiche fondamentali della cellula. Quindi, gli amminoacidi sono fondamentali anche come monomeri e non per forza come strutture proteiche.

La stereoisomeria degli amminoacidi è importante per lo studio di questi. Con l'eccezione della glicina, per la quale R è un atomo di idrogeno, gli amminoacidi sono molecole chirali, di ciascuna delle quali esistono due enantiomeri. Come convenzionalmente avviene per le molecole di interesse biochimico, gli enantiomeri degli amminoacidi sono contrassegnati dalle lettere D o L a seconda che i sostituenti legati all'atomo di carbonio asimmetrico abbiano disposizione simile a quella della L-gliceraldeide o a quella della D-gliceraldeide.

La stragrande maggioranza delle proteine sintetizzate da organismi viventi è formata da amminoacidi L. Qualche amminoacido D è stato trovato in proteine prodotte da organismi che vivono negli abissi marini e nelle pareti cellulari di alcuni batteri. Amminoacidi D sono presenti anche nel veleno di alcuni animali. La stereoisomeria degli amminoacidi determina anche le strutture che le proteine formano.

Caratteristiche degli amminoacidi

Come abbiamo già detto, gli amminoacidi presentano un gruppo R, questo gruppo è quello che dà la caratteristica acida, basica, o neutra all'amminoacido. L'ingombro dei vari gruppi R che sporgono dalla catena polipetidica, l'affinità reciproca tra gruppi polari e tra gruppi apolari, l'attrazione tra gruppi basici e gruppi acidi sono alcune delle forze che concorrono a modellare la conformazione della proteina nello spazio, conformazione dalla quale dipende in modo essenziale l'attività biologica della proteina stessa.

I gruppi R sono importantissimi perché la loro struttura determina legami intermolecolari importanti. Per esempio, cisteina e metionina possono formare punti a disolfuro avendo zolfo nella loro catena R. Strutture come la prolina con un gruppo R ciclico determinano instabilità in una proteina con struttura secondaria. Molte altre come serina, acido glutammico, acido aspartico o altri fanno legami a idrogeno, fondamentalissimi per la stabilità di una struttura proteica.

La presenza del gruppo amminico e carbossilico determina una protonazione o deprotonazione in ambiente rispettivamente acido e basico, lasciando delle cariche sullo scheletro dell'amminoacido. Oltre alla forma completamente deprotonata o protonata è anche presente una forma chiamata zwitterione, cioè dove il gruppo amminico è a un pH tale da prendere un protone, mentre il gruppo carbossilico è sempre a un pH che gli permette di rimanere nella sua forma deprotonata.

Punto isoelettrico

Un altro concetto fondamentale nello studio delle proteine è il punto isoelettrico. È il valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta (zwitterione). Per un amminoacido avente un solo gruppo amminico ed un solo gruppo carbossilico, il valore di pI può essere determinato dai valori della costante di dissociazione acida (pKa) di ciascuno dei due gruppi calcolandone la media.

A questo punto abbiamo considerato un amminoacido che ha una catena laterale non polarizzabile, ma sappiamo che non tutti gli amminoacidi sono così. Quindi poniamo di avere un amminoacido con catena laterale basica come la lisina: utilizziamo la stessa formula, ma bisogna però considerare unicamente i pKa dei gruppi maggiormente presenti; per esempio, per la lisina si considerano i pKa dei gruppi amminici, essendo un amminoacido basico i gruppi prevalenti saranno quelli basici mentre quello acido sarà trascurabile. Al contrario, invece, succede per l'aspartato il pKa dei due gruppi carbossilici.

La lisina presenta tre pKa: l'α-Carbossile 2,16; l'α-ammino gruppo 9,06 e l'ε-ammino gruppo 10,54. Il calcolo del punto isoelettrico prende in considerazione solamente i pKa dei due gruppi amminici.

È possibile calcolare analiticamente il rapporto tra la quantità di un amminoacido che si presenta in forma deprotonata e quella protonata, a un dato pH, attraverso l'equazione di Henderson-Hasselbalch. Dalla formula possiamo fare anche un'altra considerazione, se la concentrazione della forma protonata fosse 0 avremmo un numero diviso 0 che è matematicamente impossibile, cioè che non esiste un valore di pH per la quale possiamo scrivere il gruppo amminico NH₂ e il gruppo carbossilico come COOH nello stesso momento, infatti scrivere la formula in questo modo è un errore che si vede spesso e da questa equazione vediamo il perché.

Lo studio del punto isoelettrico degli amminoacidi è importantissimo perché ci permette di separarli grazie a una procedura chiamata elettroforesi (L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Nel caso di una cella elettrolitica, il catodo assume carica negativa mentre l'anodo assume carica positiva, per cui le particelle si muovono verso l'elettrodo avente carica opposta rispetto alla carica della particella; in particolare si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa).

Proteine

Legame peptidico

Il legame peptidico si forma nel momento in cui, tramite un processo di condensazione (ovvero l'unione di due strutture molecolari con la perdita di una molecola di H₂O), la parte basica di un amminoacido (il gruppo funzionale amminico -NH₂) si unisce con quella acida di un amminoacido diverso (il gruppo carbossilico -COOH). Quando ciò avviene, uno degli idrogeni (H⁺) legati all'azoto si separa e si unisce al gruppo OH- legato al carbonio formando una molecola d'acqua e permettendo a C e ad N di unirsi con un legame detto appunto peptidico. L'idrogeno e l'ossigeno sono sempre in posizione trans rispetto al legame peptidico.

Questo processo di condensazione può andare avanti ancora perché il nostro dipeptide appena formato contiene ancora un gruppo amminico e uno carbossilico, quindi può dar vita a un nuovo processo di condensazione e allungare la propria catena. Il legame peptidico, non è un legame libero di far compiere rotazioni intorno al proprio assi, infatti è un legame rigido, dovuto a un fenomeno di tautomerizzazione che fa porre il legame tra un ordine di legame semplice e doppio; l'azoto ed il carbonio peptidici sono di fatto ibridati sp², con una struttura quasi planare e angolo di ca. 120°.

Una proteina è un polipeptide di amminoacidi, unito da legami peptidici, e le sue caratteristiche e funzioni sono appunto determinate dalla concatenazione e dal tipo di amminoacido. Se un polipeptide è formato da circa 300 amminoacidi e sappiamo che gli amminoacidi usati per formare proteine umane sono 20, il numero di proteine che possiamo trovare dalla loro combinazione sono pressoché infinite. Per questo motivo, l'evoluzione ha selezionato durante il tempo solo alcune determinate concatenazioni di questi amminoacidi, e sono le proteine più utili per quel determinato organismo.

Folding delle proteine

Le proteine per esprimere le loro funzioni all'interno della cellula necessitano che la loro conformazione 3D sia quella ideale per svolgere la loro funzione. Il processo che permette la corretta ripiegatura delle proteine lineari uscite dal ribosoma fino alla formazione della proteina 3D attiva si chiama folding. Il processo di folding non è sempre spontaneo, infatti se una proteina formata da una lunga sequenza di amminoacidi si dovesse ripiegare spontaneamente rischierebbe di assumere una conformazione tale da non essere più utile per lo scopo per cui è stata prodotta, per questo motivo a tale processo vengono associate altre proteine chiamate chaperon.

Questa classe di proteine, le chaperon, ha anche l'utile funzione di schermare le proteine neonate dalle molecole di acqua presenti in gran quantità nel citosol (il rischio sta nel fatto che le proteine con gli amminoacidi idrofobici se lasciate in ambiente acquoso si aggregano tra di loro schermando questi tratti dall'acqua, il che impedirebbe il folding delle proteine coinvolte). Le proteine chaperon legano reversibilmente con le proteine in struttura nativa e rilasciano la proteina solo quando il processo di folding è completo.

La loro reversibilità è dovuta al fatto che le proteine chaperon sono formate da due anelli formati a loro volta da alcune sub unità (circa 7-8), uno di questi due anelli serve per il processo di folding, mentre l'altro per permettere l'ingresso della proteina nello chaperon. In uno dei due anelli vi è anche la sede per l'attacco di una molecola di ATP che attua il cambio conformazionale della molecola stessa: quando ATP è legato allo chaperon il complesso chaperon-ATP è poco affine alle proteine, se invece lo chaperon è libero allora l'affinità nei confronti delle proteine di alza.

Lo chaperon non decide “come” ripiegare la proteina ma la tiene al suo interno fino a che tutti i segmenti idrofobici della proteina non sono più esposti all'ambiente citosolico. Questo grafico è chiamato imbuto del folding, le variabili di questo grafico sono “E” energia della proteina alla quale colleghiamo subito “S” l’entropia e poi la percentuale della proteina nativa.

All'inizio vediamo che l'energia della proteina è elevata e anche la sua entropia, questo perché la conformazione denaturata (lineare) ha un numero di conformazioni possibili 3D pressoché infinite, per cui questo indica un alto indice di disordine che appunto è rappresentato dall’entropia. L'energia man mano che la proteina da denaturata passa a nativa diminuisce insieme all'entropia, passando da uno stato totalmente denaturato a una conformazione leggermente ripiegata i possibili stati che la proteina può assumere diminuisce, quindi da una situazione di disordine passiamo a una situazione più ordinata, questa transizione da un'entropia più alta a una più bassa richiede energia e quindi spiegato anche perché l'energia diminuisce.

Alla fine quando la proteina è nativa al 100% abbiamo un picco minimo di energia e entropia, e la proteina è pronta per uscire dallo chaperon e compiere la sua funzione.

Proteine native e denaturate

Una proteina di dice nativa quando svolge la sua funzione effettrice, si dice denaturata quando invece non svolge più la sua attività specifica, quindi per una proteina è necessario avere una conformazione 3D per svolgere una funzione effettrice. La denaturazione è un processo importante per lo studio delle proteine ma anche per disattivare quelle proteine che possiamo definire obsolete e che verranno sostituite da proteine nuove o di maggiore utilità in quel momento.

Gli agenti denaturanti per eccellenza sono mezzi fisici o chimici. Uno dei mezzi fisici per eccellenza è la temperatura, un tipico esempio è l'albume dell'uovo, ricco di proteine che riscaldate cambiano il loro stato passando da una consistenza gelatinosa a una solida, quella è una reazione di denaturazione e in questo caso è una reazione irreversibile.

Nel grafico (a) sono riportati due esempi di proteine in fase di denaturazione, sull'asse delle x abbiamo la temperatura su quello delle y la % di denaturazione della proteina, il grafico fa notare che diversi tipi di proteina hanno un andamento diverso sulla curva. Il caso A è la ribonucleasi A, in questo caso si vede che la curva ha una pendenza maggiore del caso B, cioè l'apomioblobina, questo dipende da che tipo di interazioni deboli intercorrono nella struttura nativa, se sono tutti legami deboli, cioè è avvenuto unfolding di tipo cooperativo, appena alziamo la temperatura, la proteina degrada completamente. Il caso B invece porta alla luce una possibilità opposta, per esempio se la proteina è ricca di ponti a disolfuro che sono legami covalenti, la differenza di temperatura da usare per degradare la proteina è di molto maggiore, e quindi serve una maggior energia per degradarla (questo fa notare che proteine con legami intramolecolari forti danno vita a una proteina stabile).

La denaturazione di tipo chimica, grafico (b), invece avviene con un diverso andamento, che dipende molto dal tipo di reagente che andiamo a usare. Due reagenti denaturanti molto usati sono il mercaptoetanolo e urea 8M, questi reagenti rompono i legami deboli come legami a idrogeno o interazioni di carica tra gli amminoacidi della proteina, e i legami più forti come quelli covalenti dei ponti a disolfuro e inoltre un agente denaturante non permette il ripiegamento della struttura proteica.

Denaturazione delle proteine nei laboratori

Di seguito un esempio pratico che si attua nei laboratori per denaturare una proteina sfruttando agenti chimici. Dall'immagine si vede che la proteina in esame viene denaturata con due agenti chimici ma che togliendoli questa proteina torna alla sua conformazione nativa, questo succede ma non è una regola, non tutte le proteine dopo essere state denaturate tornano ad essere alla conformazione nativa (per esempio dopo aver scaldato o acidificato l’albume dell’uovo esso rimarrà così sia che noi lo raffreddiamo che riportiamo il pH nei suoi range standard).

Struttura delle proteine

Le proteine come abbiamo visto possono assumere diverse conformazioni dovute al loro ripiegamento 3D nello spazio, ma ciò non è tutto, infatti esiste una classificazione sui tipi di ripiegamento e conglomerazioni delle proteine.

Proteina con struttura primaria

È una proteina che non ha subito un ripiegamento e la possiamo trovare quindi in una forma lineare.

Proteine con struttura secondaria

Questo genere di conformazione è un po’ più complesso rispetto a quella vista precedentemente e prima di noi la spiego un celebre scienziato padre della scoperta delle proteine, cioè Pouling, enunciò dei postulati che devono verificarsi per far sì che una struttura in conformazione 3D possa essere stabile e non crollare

• Una conformazione proteica 3D deve avere la lunghezza di legame e i loro angoli devono il più possibile simili alla loro struttura se fosse lineare.
• Due gruppi R di due amminoacidi di una catena proteica ripiegata non devono avvicinarsi troppo e rispettare i raggi di van der Waals (la distanza dei due atomi di due gruppi R deve essere maggiore della somma dei due raggi atomici, se così non fosse si creerebbe un fenomeno di repulsione).
• Il legame peptidico deve rimanere in una conformazione planare e in configurazione trans.
• La struttura deve essere stabilizzata dalla presenza di legami a idrogeno e in generale legami non covalenti.

La struttura secondaria delle proteine non è una struttura univoca ma bensì è presente in 2 diverse forme, la forma alfa elica e beta foglietto, queste due forme hanno una diversa conformazione, diverse proprietà e diversi effetti quando si trovano all’interno di una proteina. La struttura secondaria è determinata dagli angoli diedrici dei legami peptidici. È importante considerare che la rotazione lungo questi legami è limitata dall’ingombro sterico che il gruppo carbonilico dà nel momento della sua rotazione con il gruppo R dell’amminoacido vicino, questo fa sì che solo alcuni valori di angoli possano verificarsi quando la proteina si trova in una determinata conformazione 3D.

Per determinare se la struttura secondaria è di tipo alfa elica o beta foglietto è necessario conoscere gli angoli diedrici, successivamente grazie a un grafico chiamato grafico di Remachedran si inseriscono i valori degli angoli diedrici dei legami N-Calfa e Calfa-C (come si vede in figura) e in base alla posizione nel grafico si stabilisce l’ipotetica struttura.