Biochimica - appunti

Biochimica delle proteine

Chimicamente, le proteine sono delle macromolecole a peso molecolare (PM) variabile (da 5.000 a 10.000 dalton). Sono costituite da C, H, N e O (composti quaternari) organizzate in unità monomeriche chiamate amminoacidi. Essi sono composti organici a funzione mista a causa della presenza dei gruppi –NH₂ e –COOH.

Classificazione basata sulla composizione chimica

• Proteine semplici: se costituite da soli amminoacidi.
• Proteine coniugate: se alla proteina è legato un gruppo non proteico, indicato con il termine di "Gruppo prostetico".
  • Glicoproteine
  • Lipoproteine
  • Nucleoproteine
  • Fosfoproteine
  • Cromoproteine → Flavoproteine [enzima con FAD], Emoproteine (emoglobina)

Classificazione delle proteine basata sulla funzione

1. Catalisi: gli enzimi catalizzano le reazioni, le quali procederebbero troppo lentamente a causa delle temperature in cui le cellule vivono.
2. Trasmissione segnali chimici: gli ormoni regolano le attività dell’organismo attraverso la comunicazione tra cellule. I recettori sono destinati al riconoscimento e alla trasmissione dei segnali chimici (quali neurotrasmettitori, ormoni e fattori crescita).
3. Difesa: gli anticorpi reagiscono all’ingresso di sostanze dall’esterno e dunque riconosciute come “estranee”.
4. Movimento: le proteine contrattili sono in grado di allungarsi e accorciarsi; costituiscono i microtubuli, i microfilamenti e i flagelli. Actina e Miosina sono molto abbondanti nel tessuto muscolare.
5. Trasporto: le proteine di trasporto presenti nei liquidi circolanti o sulle membrane permettono a molte sostanze, spesso non idrosolubili, di migrare da un punto all’altro della cellula o del corpo. Es. L'emoglobina è deputata al trasferimento di O₂.
6. Deposito: le proteine di deposito fungono da materiale di riserva energetica da utilizzare quando serve, oppure come materiale necessario allo sviluppo embrionale. Le proteine muscolari nei periodi di digiuno protratto vengono trasformate in glucosio per sopperire alle esigenze del cervello. Es. Proteine dell’uovo: albumina e le proteine dell’endosperma.
7. Strutturali: le proteine di membrana o la cheratina che si trova nei peli dei mammiferi e nelle fibre dei tessuti connettivi come tendini e legamenti.
8. Offesa: sono i costituenti di numerose tossine e veleni utilizzati da molti animali o piante per danneggiare o uccidere eventuali avversari nell’habitat in cui vivono.

Le proteine possono essere classificate anche in base alla loro struttura (fibrose, globulari o di membrana).

Amminoacidi

Un composto per essere considerato un amminoacido deve avere il gruppo amminico e carbossilico separati da un atomo di C detto carbonio α, al quale sono legati anche un atomo di H e un gruppo laterale R diverso per ogni amminoacido. Il carbonio α (tranne nel caso della glicina in cui il gruppo laterale è costituito da un atomo di H) è un carbonio chirale poiché è legato a quattro atomi diversi.

Gli amminoacidi che costituiscono le proteine presentano perciò isomeria ottica e assumono la configurazione L-α-amminoacido. A pH neutro la maggior parte degli amminoacidi hanno –NH₂ e –COOH sempre ionizzati a formare uno zwitterione. La cisteina, contenendo lo zolfo nella catena laterale, legandosi a un altro amminoacido di cisteina può formare un ponte disolfuro. Il radicale influenza la solubilità: tanto più lungo è -R tanto minore sarà la solubilità dell’amminoacido. Tuttavia anche quelli tendenzialmente idrofobici mantengono sempre un certo grado di solubilità poiché –NH₂ e –COOH formano dei legami idrogeno con l’acqua.

Gli aminoacidi si dividono in:

• Proteici
• Proteici postsintetici (subiscono modificazioni dopo la loro sintesi): cisteina, idrossiprolina, idrossilisina, carbossiglutamico, fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina
• Non proteici (non si ritrovano nelle proteine ma solo come intermedi nei metabolismi): ornitina, citrullina, omocisteina, GABA, β-alanina

Amminoacidi essenziali

Un uomo non è capace di sintetizzarli e deve introdurli con l’alimentazione. Sono 8: Leucina, Isoleucina, Valina, Treonina, Fenilalanina, Triptofano, Metionina e Lisina.

Amminoacidi semiessenziali = sono amminoacidi essenziali solo per i bambini che ne producono una quantità insufficiente al suo fabbisogno: Arginina e Istidina.

Le proteine vegetali sono povere o prive di alcuni amminoacidi essenziali, es.: il mais è povero di lisina e triptofano. Proteine animali (proteine nobili) contengono tutti gli amminoacidi essenziali.

Legame peptidico

Il legame fra due amminoacidi è una reazione di condensazione che porta all’eliminazione di una molecola d’acqua. Esso si instaura tra il carbossile di un amminoacido ed il gruppo amminico di un altro.

≤10: oligopeptidi

≥10: polipeptidi

Il legame peptidico è un legame semplice ma ha le caratteristiche di un doppio legame, e pertanto è rigido e planare. Il doppietto di N si sposta verso il legame C-N poiché gli elettroni si spostano verso O (che è il più elettronegativo). I gruppi α-amminico e α-carbossilico liberi alle estremità della molecola sono considerati, per convenzione, rispettivamente l’inizio e il termine della catena, e i rispettivi amminoacidi vengono detti N-terminale e C-terminale. Il legame peptidico ha una configurazione trans.

Struttura delle proteine

Struttura primaria

Le caratteristiche chimiche e funzionali di ogni proteina derivano da due elementi: la composizione in amminoacidi e, più in particolare, la sequenza degli amminoacidi nella molecola. Per composizione in amminoacidi si intende il numero di unità di ciascun tipo di amminoacido presenti nella molecola. La struttura primaria è rappresentata dalla sequenza lineare con cui gli amminoacidi sono legati, la quale sequenza non è casuale ma dipende dalle sequenze dei nucleotidi del DNA. Si individua lo scheletro dato dall’insieme degli atomi di carbonio alfa e dai legami peptidici mentre i gruppi R sono proiettati al di fuori dello scheletro. Alterazioni anche minime della sequenza amminoacidica possono avere conseguenze spesso molto gravi sull’attività biologica di una proteina ed essere causa di gravi malattie. Per esempio, l’anemia falciforme è caratterizzata dalla presenza, nel sangue, di globuli rossi a forma di mezzaluna contenenti una forma anomala di emoglobina nella quale due amminoacidi sono sostituiti con altri due a causa di una mutazione nel gene che codifica le due subunità interessate.

Struttura secondaria

È data dall’avvolgimento della struttura lineare della catena polipeptidica. Si ripiega perché si formano dei legami a H tra il gruppo C=O (rimanente dal –COOH) con il gruppo –NH (rimanente da –NH₂).

• α elica: se il legame a H avviene tra gruppi della stessa catena e l’avvolgimento è in senso antiorario. È una struttura costante e l’ampiezza del raggio rimane uguale. I gruppi R sono rivolti verso l’esterno. L'unità ripetuta è rappresentata da un solo giro, che contiene 3,6 residui amminoacidici e si estende per lunghezza di 0,54 nm (passo). In alcune proteine, due o più filamenti avvolti ad alfa-elica possono ulteriormente avvolgersi a formare una struttura a cordone intrecciato, come nel collagene. Il collagene è molto presente nella pelle, di fatti quando i legami della proteina si rompono, con l’avanzare dell’età, si formano dei legami meno duraturi ed è per questo che si vengono a formare le rughe (perché la pelle perde sostegno). La sua struttura viene chiamata “Tripla elica”.
• β foglietto: se i legami avvengono tra filamenti β diversi ciascuno dei quali risulta più disteso dell’alfa-elica, con una forma a zig-zag e con i gruppi laterali posti perpendicolarmente al filamento in modo da sporgere con direzione alternativamente opposta. I filamenti adiacenti possono avere tra loro direzione parallela, antiparallela o in parte parallela e in parte antiparallela; di conseguenza il foglietto si definisce parallelo, antiparallelo o misto. Molte proteine presentano tratti che assumono strutture alternate (alfa e/o beta) e tratti in cui non è riconoscibile alcun tipo di struttura.

Struttura terziaria

Conformazione tridimensionale complessiva assunta dalla catena polipeptidica.

1. Fibrose: hanno una forma lunga e stretta dovuta ai legami a H o ai ponti disolfuro. Sono insolubili poiché presentano un elevato numero di gruppi R idrofobici presenti sull’alfa-elica. Es. La cheratina dei capelli ha una struttura particolarmente forte in quanto è organizzata su più livelli: 3 catene di α-elica si avvolgono per formare le protofibrille, le quali, formando dei legami duraturi danno origine alle macrofibrille. La disposizione ordinata delle macrofibrille dà origine al capello.
2. Globulari: è la conseguenza di numerose interazioni idrofobiche o idrofile, della formazione di ioni tra radicali di segno opposto e ponti disolfuro tra i gruppi sulfidrilici di un amminoacido. Sono, per lo più, solubili in acqua.

Struttura quaternaria

Non tutte le proteine possono avercela, infatti è presentata solo da quelle che presentano più subunità (oligomeriche) (proteine con struttura 3 si uniscono per formarne una con struttura 4). La proteina più importante è l’emoglobina la quale è formata da 4 subunità (2α e 2β unite da interazioni non covalenti in una struttura quasi sferica).

Quando più proteine si legano, i legami preesistenti vengono modificati e si vengono a formare nuovi legami che determinano nuove strutture, nuove funzioni e proprietà. Le singole subunità dell’emoglobina sono capaci di legarsi e trasportare l’O₂ ma non di rilasciarlo (questo è il caso della mioglobina, formata da una sola subunità). Il presentarsi di nuove proprietà determina il fenomeno dell’allosterismo. Ogni subunità contiene al suo interno una molecola non proteica, l’eme, costituita da un anello tetrapirrolico al centro del quale si trova uno ione Fe²⁺. Per il corretto funzionamento dell’emoglobina, il ferro deve sempre essere in forma di catione bivalente, tuttavia, a causa dell’elevata concentrazione di O₂, il Fe²⁺ tende spontaneamente ad ossidarsi e a diventare Fe³⁺; in questo caso l’emoglobina diventa metemoglobina, perdendo la sua attività biologica. Nei globuli rossi, però, esistono sistemi che provvedono continuamente a ridurre il Fe³⁺. La caratteristica principale delle proteine allosteriche consiste nel comportamento di ogni subunità, la cui attività risente dello stato funzionale delle altre subunità. Nel caso dell’emoglobina questo determina un aumento dell’affinità delle subunità per l’ossigeno (considerato un effettore positivo o un attivatore allosterico). Tale comportamento è chiamato cooperatività positiva e assicura l’attività ottimale della molecola nelle condizioni fisiologiche. In altri casi vi è un comportamento opposto in cui il legame dell’effettore alla prima subunità riduce l’affinità delle altre subunità (cooperatività negativa); in questo caso si parla di effettore allosterico negativo o inibitore allosterico. I più importanti effettori allosterici dell’emoglobina sono l’acido 2,3-bisfosfoglicerico (BPG), H⁺ e il CO₂. Questi effettori, che riducono l’affinità per l’ossigeno, hanno un’enorme importanza fisiologica; infatti essi permettono all’emoglobina ossigenata nei capillari polmonari di rilasciare l’ossigeno ai capillari periferici dove vi è un pH leggermente inferiore rispetto a quello arterioso e una maggiore pressione parziale di CO₂. L'azione degli ioni H⁺ e quindi l’effetto del pH, sull’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno, è noto come effetto Bohr ed è riconducibile al fatto che l’emoglobina quando lega l’ossigeno libera ioni idrogeno.

Denaturazione delle proteine

Ogni proteina deve la sua funzione alla struttura che ha. La proteina che mantiene la sua struttura, qualunque essa sia, si dice che è in forma nativa. Se intervengono dei fattori che possono alterare la struttura, la proteina si dice denaturata, ovvero non è più in grado di svolgere le sue caratteristiche funzioni in quanto la sua conformazione si discosta significativamente dalla sua forma nativa.

Fattori di denaturazione

• Variazione di pH
• Cambiare solvente
• Aumento della temperatura
• Agitazione violenta
• Aggiunta di sostanze ioniche
• Aggiunta di ioni di metalli pesanti

Gli enzimi

Gli enzimi sono dei catalizzatori biologici e sono costituiti da proteine globulari; la loro funzione è quella di accelerare le trasformazioni chimiche all’interno delle cellule senza consumarsi, indirizzando, poi, le reazioni alla produzione di un solo prodotto. A differenza dei catalizzatori non biologici che devono essere rimossi per interrompere la reazione, gli enzimi possono, infatti, essere spenti a seconda delle condizioni in cui la reazione avviene. Negli organismi viventi le reazioni avvengono in sequenza e i composti che introduciamo con gli alimenti devono subire numerose reazioni di trasformazione prima di poter essere utilizzati.

Nomenclatura

• Comune: si aggiunge il suffisso “-asi” al nome del substrato oppure a una fase che descrive l'azione catalitica dell'enzima.
• IUB: serie di quattro numeri. Ad esempio l’enzima ATP D glucosio-6-fosfato transferasi, secondo la IUB risulta: 3.7.1.10.

Processo di catalisi enzimatica

1. L’enzima si lega al substrato (più specificamente nel sito attivo dell’enzima). Le molecole di substrato urtano continuamente contro l’enzima, ma solo alcune di esse collidono con la parte “giusta” (ovvero il sito attivo). Gli eventi fortunati sono urti casuali. In alcuni casi, alcuni enzimi presentano dei radicali R di amminoacidi nella zona del sito attivo che attraggono le molecole di substrato. In questa prima fase si viene a formare il complesso enzima-substrato.
2. L’enzima trasforma il substrato nel prodotto. In questa fase, invece, convivono sia il complesso E-S che enzima-prodotto, poiché le reazioni di trasformazioni sono in via di completamento.
3. I prodotti della reazione si separano dall’enzima, il quale assume nuovamente la sua conformazione originale ed è così pronto a una nuova trasformazione.

Proprietà degli enzimi

• Non modifica la propria struttura.
• Agisce in piccole quantità.
• Interagisce in modo specifico con il substrato (ad ogni substrato corrisponde un enzima specifico).
• Non modifica la costante d’equilibrio della reazione.
• Non si consuma nella reazione.

Energia di attivazione

È la quantità di energia necessaria affinché l’urto fra due molecole di reagenti possa risultare un urto efficace. Quando la reazione non è catalizzata, l’energia di attivazione che il substrato deve superare per subire la trasformazione in prodotto è molto elevata. Quando la reazione è catalizzata, invece, nonostante l’energia totale rimanga invariata, viene frazionata in modo da creare degli stadi intermedi, ciascuno con un’energia di attivazione più bassa (dunque più accessibile).

Fattori che influenzano l’attività catalitica degli enzimi

Attività catalitica

È il numero di reazioni catalizzate nell’unità di tempo; nella maggior parte dei casi catalizzano da 10 a 1000 cicli di reazioni al secondo. Esso è un indice indiretto della purezza degli enzimi: tanto esso è maggiore tanto l’enzima risulta inquinato da altre proteine.

L’attività catalitica dipende da diversi fattori:

• Variazione della concentrazione del substrato: con l’aumentare della concentrazione del substrato l’attività dell’enzima aumenta, raggiunge un valore massimo e poi rimane costante. Tale situazione porta al raggiungimento di un punto in cui l’enzima è utilizzato al massimo delle sue possibilità (l’enzima si dirà, allora, SATURO). A questo proposito viene consultata la costante di Michaelis-Menten, la quale indica a quale concentrazione di substrato l’enzima raggiunge ½ della velocità massima.
• Concentrazione enzima: in una soluzione che contiene un eccesso di substrato rispetto alla velocità di saturazione dell’enzima.
• pH: la maggior parte degli enzimi è attiva entro un range di pH molto ristretto. Es. pepsina si attiva nello stomaco a pH 2, mentre la chimotripsina si attiva a pH 7-8.
• Temperatura: la temperatura ottimale di un ambiente coincide con la massima attività catalitica di un enzima. Un aumento eccessivo della temperatura porta alla denaturazione della proteina, la quale, il più delle volte, risulta irreversibile, causando poi una diminuita attività catalitica (perché il sito non è più capace di svolgere la sua funzione). L’effetto distruttivo delle temperature elevate sugli enzimi batterici è sfruttato nella sterilizzazione. Il limite di temperatura massima accettabile dagli enzimi umani è dai 40 ai 50 gradi Celsius, mentre la temperatura ottimale è di 37 °C. Un abbassamento eccessivo della temperatura, invece, com