Valutazione della caratterizzazione di tumori polmonari tramite metodica fish

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”

Dipartimento di Medicina Molecolare

Laurea Triennale in Scienze Biologiche

Valutazione della caratterizzazione di tumori polmonari

tramite metodica FISH

Relatore:

Prof.ssa Paola Perucca

Correlatore:

Dott.ssa Gabriella Gaudioso Tesi di

Leonardo Minestra

Anno Accademico 2019/2020

INTRODUZIONE

Il tumore al polmone è la causa principale di morte nei paesi industrializzati, dovuto non solo a

fattori genetici, ma anche ambientali. Il fumo di tabacco costituisce il più importante fattore di

rischio per l’insorgenza di dell’85% dei casi

questo tumore, e si ritiene sia responsabile

osservati. Gli ultimi studi evidenziano inoltre, per i fumatori passivi, un aumento del rischio tra

il 20% ed il 50% rispetto ai non fumatori. Nella tesi che andrò a discutere sarà esposto uno dei

l’adenocarcinoma del polmone, ovverosia la tecnica

più importanti metodi di diagnostica per

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) per individuare il riarrangiamento del gene ALK

(Anaplastic Lymphoma Kinase) in una sottopopolazione equivalente al 3-7% di carcinomi non

a piccole cellule.

I pazienti con neoplasia ALK+, età media alla diagnosi di circa 50 anni, in maggioranza non

fumatori di sesso maschile, traggono benefici da trattamenti in grado di inibirne selettivamente

il meccanismo patogenetico. Infatti, è ormai confermata l’efficacia di Crizotinib, inibitore

competitivo della fosforilazione del dominio tirosino-chinasico di ALK rispetto alla

chemioterapia. Nonostante, la sopravvivenza a cinque anni sia migliorata, il tumore al polmone

permane, ancora oggi, come una neoplasia a prognosi particolarmente sfavorevole.

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Sommario 1

INTRODUZIONE 4

Capitolo 1 4

DEFINIZIONE 4

CARATTERISTICHE GENERALI 6

Capitolo 2 6

EPIDEMIOLOGIA 7

CLASSIFICAZIONE 9

EZIOPATOGENESI 10

DIAGNOSI 12

TRATTAMENTO 14

Capitolo 3 14

STORIA DEL GENE 15

MECCANISMO D’AZIONE 15

CORRELAZIONE TRA ALK E DIVERSI TUMORI 16

RIARRANGIAMENTO DEL GENE ALK NEI TUMORI POLMONARI 17

TRATTAMENTO E RESISTENZA AI FARMACI ANTI-ALK 19

Capitolo 4 19

METODICA FISH 20

VANTAGGI E SVANTAGGI DELLA FISH 21

TIPOLOGIA DI SONDE 22

VALUTAZIONE DEL RIARRANGIAMENTO DEL GENE ALK TRAMITE FISH 24

Capitolo 5 24

RISULTATI 26

Capitolo 6 26

CONCLUSIONI 28

BIBLIOGRAFIA 28

SITOGRAFIA 30

RINGRAZIAMENTI 2

FISH FLUORESCENCE IN SITU

HYBRIDIZATION (IBRIDAZIONE IN SITU

FLUORESCENTE)

ALK ANAPLASTIC LYMPHOMA KINASE

(CHINASI ANAPLASTICA DEL LINFOMA)

ATP ADENOSINA TRIFOSFATO

DNA DEOXYRIBONUCLEIC ACID (ACIDO

DESOSSIRIBONUCLEICO)

WHO WORLD HEALTH ORGANISATION

ADC ADENOCARCINOMA

CS CARCINOMA SQUAMOSO

CGC CARCINOMA A GRANDI CELLULE

NSCLC NON-SMALL-CELL LUNG CANCER

(CARCINOMA A NON PICCOLE CELLULE)

TFF-1 THYROID TRANSCRIPTION FACTOR-1

(FATTORE DI TRASCRIZIONE TIROIDEO)

CK7 CYTOKERATIN-7 (CITOCHERATINA 7)

SCLC SMALL CELL LUNG CANCER

(CARCINOMA A PICCOLE CELLULE)

OMS ORGANIZZAZIONE MONDIALE DELLA

SANITÀ

TAC TOMOGRAFIA ASSIALE

COMPUTERIZZATA

CLASSIFICAZIONE TNM TUMOR-NODES-METASTASIS

TBNA TRANSBRONCHIAL NEEDLE ASPIRATION

NPM NUCLEOPHOSMIN (NUCLEOFOSMINA)

ALCL ASSOCIATED ANAPLASTIC LARGE CELL

LYMPHOMA (LINFOMA A GRANDI

CELLULE ANAPLASTICO)

IMT INFIAMMATORY MYOFIBROBLASTIC

TUMOR (TUMORE INFIAMMATORIO

MIOFIBROBLASTICO

EML4 ECHINODERM MICROTUBULE-

ASSOCIATED PROTEIN-LIKE 4

IHC IMMUNOISTOCHIMICA

RT-PCR REAZIONE A CATENA DELLA

POLIMERASI A TRASCRIZIONE INVERSA

SCF FATTORE DELLE CELLULE STAMINALI

4’,6-DIAMIDIN-2-FENILINDOLO

DAPI

N.A. APERTURA NUMERICA

CCD CHARGE COUPLED DEVICE

FDA FOOD AND DRUG AMMINISTRATION

MET MESENCHYMAL EPITHELIAL

TRANSITION FACTOR

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Capitolo 1

I TUMORI DEFINIZIONE

La definizione più corretta per descrivere la parola “tumore” è quella coniata dall’oncologo

“una

Rupert Allan Willis, accettata a livello internazionale che afferma: neoplasia o un tumore

è una massa di tessuto che cresce in eccesso ed in modo scoordinato rispetto ai tessuti normali,

e che persiste in questo stato dopo la cessazione degli stimoli che hanno indotto il processo”.

(1) CARATTERISTICHE GENERALI

I tumori possono essere divisi in due grandi gruppi: maligni e benigni; essi si differenziano per

alcune caratteristiche fondamentali. I primi sono tumori infiltranti, che possono, cioè,

attraversare lo stroma e raggiungere varie vie per disseminare, al contrario dei benigni che sono

espansivi e rimangono incapsulati. Di fondamentale importanza, per distinguere un tumore

l’esame

maligno da uno benigno, è citologico ed istologico, effettuato al microscopio da un

anatomopatologo (1). l’evasione dall’apoptosi;

Tra le principali caratteristiche delle cellule tumorali troviamo: un

ciclo cellulare alterato, in quanto si riproducono in maniera incontrollata e con maggiore

la

frequenza rispetto a una popolazione di cellule sane; capacità di auto-produrre i fattori di

crescita - se un antagonista di questi fattori viene somministrato ad una delle cellule,

quest’ultime non risponderanno adeguatamente-.

una caratteristica importante delle cellule sane, ossia l’inibizione da

Inoltre, viene persa

contatto: un meccanismo che consiste nella cessione della crescita, quando le cellule sane

entrano in contatto tra di loro.

Si tratta di una peculiarità piuttosto rilevante, perché è grazie a questa perdita che la cellula

tumorale può crescere e dividersi in maniera incontrollata, anche rimanendo a contatto con le

cellule vicine.

Ultimo aspetto, ma non meno importante, è che le cellule dei tumori maligni generalmente sono

poco o indifferenziate presentandosi quindi con un livello di maturazione diverso da quelle sane

del tessuto d’origine, e con un elevato grado di malignità a differenza dei tumori ben

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differenziati che saranno quindi, meno aggressivi. Infine, mostrano alcune caratteristiche

la crescita incontrollata, grazie all’accumulo di nutrienti

aggiuntive atte a promuoverne

derivanti dal sangue dell’organismo ospitante per mezzo dell’angiogenesi- un processo

fondamentale in un organismo sano che consiste nella formazione di nuovi vasi sanguigni- da

quelli preesistenti, volto alla cicatrizzazione delle ferite, alla crescita del tessuto e a molti

processi fisiologici. Nel caso delle cellule tumorali si ha una generazione incontrollata di vasi

sanguigni, con lo scopo di raccogliere la maggiore quantità di nutrienti, ma con crescita

disordinata e maggiore fragilità strutturale.

Un processo correlato all’angiogenesi, il quale è una caratteristica intrinseca dei tumori maligni,

è la formazione di metastasi, costituite da cellule, originarie del tumore primario, che si staccano

da esso e migrano nel torrente circolatorio o linfatico, per raggiungere distretti fisici lontani

dalla neoformazione originaria. La cascata metastatica è molto complessa in quanto comprende

diverse fasi e può variare da tumore a tumore.

Un altro tratto distintivo delle cellule tumorali è la loro capacità di manipolare e riprogrammare

il metabolismo. In condizioni normali, la cellula sana, in presenza di ossigeno, predilige la

–un

glicolisi processo che da una molecola di glucosio produce, prima piruvato e poi, grazie

alla fosforilazione ossidativa, origina 38 molecole di ATP (Adenosina Trifosfato), le quali sono

la fonte di energia principale della cellula.

Le cellule tumorali, anche in presenza di ossigeno, preferiscono la glicolisi aerobica o effetto

Warburg (dal suo scopritore): nonostante questa via risulti, meno efficiente essa produce una

maggiore quantità di metaboliti secondari, i quali vengono utilizzati dalle cellule neoplastiche

per produrre i costituenti principali dell’unità biologica, al fine ultimo di potersi accrescere.

caratteristica, che è comune a tutte le cellule neoplastiche è l’instabilità genomica.

Altra

Il DNA può subire dei danni, causati da agenti esterni, ma anche interni, di vario tipo: chimici,

fisici, biologici, causati dal metabolismo cellulare oppure dalla replicazione del DNA. Tutti

questi agenti possono causare mutazioni, ovvero modificazioni nella composizione della

struttura del DNA stesso, alterando di conseguenza il suo messaggio.

Le cellule hanno sviluppato meccanismi di protezione del DNA, in grado di riparare il danno

subito. Molto spesso le mutazioni nelle cellule tumorali avvengono proprio nei geni

appartenenti ai sistemi di riparazione: questo fa sì che nelle cellule vengano accumulate più

mutazioni che conferiscono vantaggi alle cellule, quali maggiore capacità proliferativa o

promozione dell’angiogenesi e del processo metastatico (1-2).

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Capitolo 2

I TUMORI POLMONARI

EPIDEMIOLOGIA

Il tumore al polmone rappresenta la prima causa di morte per neoplasia nei Paesi sviluppati. In

all’anno.

Italia il numero di nuovi casi si attesta intorno ai 35-40.000 Esso ha una maggiore

incidenza negli individui di sesso maschile, 100-110 nuovi casi al giorno su 100.000 abitanti,

mentre nelle donne il tasso è circa 20-30 nuovi casi su 100.000.

L’incidenza della malattia aumenta con l’avanzare degli anni, dunque, alla diagnosi, l’età media

dei pazienti è di sessanta anni.

All’inizio del secolo scorso, il tumore al polmone era poco considerato a causa della sua bassa

incidenza, ma, verso la fine del ventesimo secolo, l’attenzione della ricerca si è spostata su di

l’elevato incremento del

esso per tasso di mortalità (Fig.1).

Ad oggi il tumore al polmone rappresenta una neoplasia con una prognosi, generalmente,

infausta (3). grafico a mappa colorata, in base all’incidenza

Figura 1: in questo dei tumori ai polmoni, possiamo osservare come nella

maggior parte dei paesi europei il cancro al polmone è molto diffuso su base continentale.

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CLASSIFICAZIONE

La classificazione istopatologia raccomandata è quella della World Health Organization

(WHO).

Generalmente, la maggior parte dei casi di tumore al polmone è divisa in quattro istotipi

principali: adenocarcinoma (ADC), carcinoma squamoso (CS), carcinoma a grandi cellule

(CGC) e il carcinoma a piccole cellule o microcitoma. Negli ultimi anni si è avuto un netto

incremento della frequenza degli adenocarcinomi, mentre i restanti istotipi neoplastici sono in

diminuzione. Una successiva classificazione delle neoplasie polmonari si è avuta negli ultimi

anni con il raggruppamento di tutti quei tumori non a piccole cellule (ADC, CS e microcitoma),

sotto un unico istotipo: NSCLC (Non-Small Cell Lung Cancer), il quale è divenuto importante

per la valutazione di nuove terapie specifiche per un determinato isotipo, come per esempio

l’adenocarcinoma, che di solito è positivo per TFF-1 (Thyroid Transcription Factor-1),

citocheratina 7 (CK7) e napsina; mentre il carcinoma squamoso è positivo per le proteine p63,

p40, citocheratine ad alto peso molecolare e desmocollina-3 (4).

Procederò, ora, con l’elencare alcune caratteristiche fondamentali per distinguere tra di loro i

diversi istotipi (Fig.2):

● Carcinoma squamoso o squamo cellulare.

Si tratta di uno dei più diffusi tumori che colpiscono il polmone, circa il 25-30% delle

diagnosi di neoplasie appartengono a questo istotipo.

Solitamente esso si sviluppa nelle vie aeree di maggiore interesse, come per esempio i

bronchi e, ovviamente, con l’avanzare della malattia, esso si potrà diffondere ai linfonodi

circostanti e ad altre parti del corpo, creando quindi delle metastasi. Gli organi più colpiti

da questo processo sono il cervello, le ossa, il fegato, le ghiandole surrenali e varie parti del

polmone stesso (5)

• Carcinoma a grandi cellule.

Il 9% dei casi, è costituito da strati o agglomerati di cellule giganti con forma poligonale.

Questo tipo di tumore, che si sviluppa nella periferia del sistema respiratorio, forma grandi

masse, le quali sono facilmente identificabili tramite una radiografia. Esso è scarsamente

differenziato, cioè è privo delle caratteristiche molecolari e citologiche del tessuto di origine

e, di conseguenza, la diagnosi risulta più complessa e facilmente confondibile con altre

neoplasie polmonari (6)

● Carcinoma a piccole cellule o microcitoma.

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Rappresenta una delle più aggressive tra le neoplasie maligne che colpiscono il polmone. È

diffusa nel 10-15% dei casi totali di tumori diagnosticati al polmone, ed è caratterizzata da

una crescita rapida e da metastasi precoci, impedendone la diagnosi tempestiva.

Macroscopicamente viene identificata tramite una massa ilare di notevoli dimensioni.

Generalmente, ne risentono pazienti anziani con storie di serio tabagismo. A livello

microscopico questo tumore presenta delle piccole cellule ovali, con alta conta mitotica, (il

numero totale di mitosi visualizzabile attraverso l’osservazione del vetrino) e necrosi

tissutale (7)

● Adenocarcinoma.

È il tumore più frequente, con una percentuale di diagnosi del 30-40% ed è molto comune

nelle persone di sesso femminile e non fumatrici. Si sviluppa nella periferia dell’apparato

respiratorio, vicino alle pleure, crescendo più lentamente rispetto al carcinoma a piccole

cellule.

Microscopicamente, osserviamo la presenza di strutture simil ghiandolari, mentre,

macroscopicamente, si nota una massa bianca e spugnosa, che occupa la parte periferica del

sistema respiratorio. Se diagnosticato in tempo, è possibile curare questo tumore.

Si ha, però, anche una spiccata dote metastatica, che si sviluppa attraverso tre vie principali:

diffusione per contiguità, ematogena e linfatica (4)

A B

D

C 8

Figura 2: Possiamo osservare, esempi di tessuti patologi