Tesi -Terreni selettivi per l'isolamento e la quantificazione di bifidobatteri e lattobacilli da campioni fecali

3.4 ISOLAMENTO DA CAMPIONI FECALI

Per questo studio sono stati utilizzati 3 campioni fecali provenienti da volontari diversi: per il

loro corretto studio, è stato necessario che il recupero avvenisse entro tre ore prima della

lavorazione. Per ogni campione è stata prelevata un’aliquota di 0.5g su bilancia analitica di

precisione (210g, sensibilità 0.0001g) e posta all’interno di un falcon sterile e risospesi tramite

diluzione seriale 1:10 in MRS 0.5X.

La sospensione omogeneizzata in MRS 0.5X è stata diluita tramite diluizioni seriali 1:10 in

fecal water (FW: Bacto Peptone 10 g/L, NaCl 5 g/L, Sodio fosfato monoacido 9 g/L, KH PO 1.5

2 4

g/L, Tween80 1 g/L, Cisteina 0.5 g/L) in tubi sterili e piastrata in De Man Rogosa Sharpe Agar

-8 -7 -6 -5

(piastra 1: 10 , piastra 2: 10 , piastra 3: 10 , piastra 4:10 ), Raffinose-Bifidobacterium (piastra 1:

-8 -7 -6 -8 -7 -6

10 , piastra 2: 10 , piastra 3: 10 ), BSM-Agar (piastra 1: 10 , piastra 2: 10 , piastra 3: 10 ,piastra

-5 -8 -7 -6 -7

4:10 ), MRS-MUP (piastra 1: 10 , piastra 2: 10 , piastra 3: 10 ), LBS-agar (piastra 1: 10 , piastra

-6 -5 -4 -7 -6 -5

2: 10 , piastra 3: 10 , piastra 4:10 ), e Lamvab (piastra 1: 10 , piastra 2: 10 , piastra 3: 10 , piastra

-4

4:10 ), poste a crescere in condizioni anaerobiche in Anaerobic System a 37°C con atmosfera

controllata (N 85%, CO 10%, H 5%). Le prove sono state eseguite in doppio.

2 2 2

Dopo un tempo di 48h sono state analizzate le piastre su cui si evidenziava una crescita,

eseguendo un conteggio per analizzare il numero di CFU sui diversi terreni di coltura. Dalle piastre

di MRS più cisteina sono state prelevate 200 singole colonie in modo stocastico, che sono state

piastrate su piastre numerate contenenti gli stessi terreni della fase precedente e poste a crescere in

condizioni anaerobiche in Anaerobic System a 37° con atmosfera controllata. Dopo 48h è stata

annotata la crescita sulle diverse piastre. 16

3.5 ESTRAZIONE DEL DNA GENOMICO

Il DNA genomico delle colonie isolate da piastra numerata è stato estratto tramite utilizzo di

TM

Instagene Matrix, una matrice composta da una resina contenente residui carichi negativamente e

in grado di legare i cationi bivalenti, portando ad una loro precipitazione e lasciando nel

sopranatante il DNA di interesse. Il protocollo utilizzato è il seguente:

- prelevare la biomassa con un puntale sterile e risospendere in eppendorf sterile contenente 1ml di

acqua bidistillata sterile;

- vortexare accuratamente in modo da effettuare una disgregazione di eventuali residui in

sospensione;

- centrifugare per 5 minuti a 14000 rpm e rimuovere il sopranatante;

- aggiungere 50 μl di InstaGene Matrix al pellet e incubare a 56°C per 30 minuti;

- vortexare ad elevata velocità per 10 secondi;

- collocare le eppendorf in acqua a 100°C per 8 minuti;

- vortexare ad elevata velocità per 10 secondi;

- congelare a -20°C.

Prima dell'utilizzo, i campioni di DNA genomico sono scongelati, vortexati per una decina di

secondi e centrifugati per 5 minuti a 12000 rpm.

3.6 TIPIZZAZIONE DEI CEPPI TRAMITE RAPD-PCR

La tecnica della PCR permette la produzione di un elevato numero di copie di un filamento di

DNA specifico utilizzato come stampo a singola elica. Questa tecnica sfrutta la capacità dell’enzima

DNA polimerasi di amplificare sequenze geniche di lunghezze specifiche, che per il funzionamento

richiede di una sequenza di DNA stampo, di due inneschi o primers di lunghezza compresa tra le 18

e le 35 paia di basi, e dei nucleotidi necessari alla polimerizzazione del nuovo filamento. E’ la

complementarietà dei primers per le sequenze consenso situate sul filamento stampo che

determinano il corretto appaiamento e quindi la selezione delle sequenze da amplificare, ed è quindi

nei primers che risiede la specificità di sequenza della reazione di PCR. 17

La RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR) è una particolare tecnica che

permette l’amplificazione di DNA genomico frammentato utilizzando un singolo primer di 12-18

nucleotidi, in grado di fornire un impronta digitale specifica (fingerprint) del ceppo analizzato.

Per la caratterizzazione dei ceppi isolati da campioni fecali è stato utilizzato il primer M13-RAPD

(5' -GAGGGTGGCGGTTCT-3') in una mix di PCR composta da: 10X Dream Taq Green Buffer

(con MgCl22mM) 1.5 μl, dNTP mixture (10mM) 0.15 μl, Dream Taq (2mM) 0.15 μl, primer (2 μM)

3.75 μl, PCR Water sterile 6.45 μl e DNA genomico 3 μl. Il volume finale di ciascuna reazione è di

15 μl, processati attraverso il seguente termociclo: Tabella

4

Termociclo utilizzato per processo RAPD-PCR

Terminata l’amplificazione è stata eseguita una corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2%

in tampone di TAE 1X (ottenuto diluendo una soluzione stock di TAE 50X: 242 g Tris base, 57.1 ml

acido acetico glaciale, 100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0, ddH2O a volume fino a 1 litro), preparato

prelevando 60 ml e portando a volume in una fiasca da 3L (comprende i 400ml per il gel, con

aggiunta di 8 g/L di agarosio, e 2.6 L per tampone di camera di corsa). La camera di corsa

elettroforetica è connessa al supplier “Power PAC”,impostata ad un voltaggio costante di 120V per

150 minuti. Il marcatore di peso molecolare utilizzato è GeneRuler DNA Ladder Mix (100-10000

bp) . Successivamente il gel è stato colorato per 30 minuti su piano inclinato in una soluzione di

bromuro di etidio (0.5g/L) , cui fa seguito un ciclo di decolorazione di 30 minuti su piano inclinato

in ddH2O e quindi osservato al transilluminatore UV (“UV Transilluminator 2000”) a 254 nm per

analizzare il pattern di bande ottenuto.

L’acquisizione dell’immagine è stata ottenuta mediante l’utilizzo di un supporto digitale ottico

fotografico “Lumix DMC-LC40 Camera” (Panasonic). L’analisi delle bande ottenute è stata

effettuata attraverso l’utilizzo del software “Gene Directory”. Questo programma consente

l’individuazione automatica e standardizzata delle tracce di corsa elettroforetica, individuando le

18

bande corrispondenti ai diversi prodotti di PCR. La successiva estrapolazione dei valori di peso

molecolare avviene attraverso la comparazione con marcatori di peso molecolare standardizzati,

generando dei tracciati elettroforetici virtuali normalizzati che vengono comparati e raggruppati

tramite analisi di cluster con algoritmo di calcolo UPGMA (unweighted pair group method with

averaging).

3.7 FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION (FISH)

La quantificazione dei gruppi batterici di nostro interesse (eubatteri, batteri lattici,

bifidobatteri) presenti nei campioni fecali avviene attraverso FISH (Fluorescent In Situ

Hybridation). Si utilizzano particolari sonde oligonucleotidiche legate a marker fluorescenti,

specifiche per i ceppi microbici di cui vogliamo visualizzare la presenza. La complementarietà si

osserva grazie alla presenza di fluorescenza ad una determinata lunghezza d’onda (variabile a

seconda del marker utilizzato). Per l’ibridazione la sospensione cellulare, la sonda specifica e il

buffer di ibridazione sono miscelati ed incubati ad una temperatura specifica e per un tempo

appropriato, previsto per ogni probe (Tabella 4; Walker et al. 2005).

Gruppo microbico Probe Sequenza (5’-3’) Temperatura Fluorocrom

di ibridazione o

Dominio Bacteria Eub338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT Over-night FITC

Genere Bif164 CATCCGGCATTACCACCC Over-night FITC

Bifidobacterium

Gruppo Lab158 GGTATTAGCA(C/T)CTGTTTCCA Over-night FITC

Lactobacillus-Enter

ococcus

Tabella 5 Tabella comprendente i diversi probe e le diverse condizioni di utilizzo

Le sonde oligonucleotidiche utilizzate sono state Eub338 (dominio Bacteria, sequenza 5’-3’

GCTGCCTCCCGTAGGAGT), Bif164 (genere Bifidobacterium, sequenza

5’-3’CATCCGGCATTACCACCC) e Lab158 (gruppo Lactobacillus-Enterococcus , sequenza 5’-3’

GGTATTAGCA(C/T)CTGTTTCCA).

Le soluzione utilizzate sono PBS Buffer 1X (PBS 1X: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1.44 g Na HPO ·

2 4

2H O oppure 1.25 g di Na HPO anidro, 0.24 g KH PO , 0.5 g Cisteina · HCl per le sole colture

2 2 4 2 4

anaerobiche) portato a pH 7.4, PBS 3X (PBS 3X: 2.4 g NaCl, 0.06 g KCl, 0.43 g Na HPO · 2H O,

2 4 2

19

0,072 g KH PO ) portato a pH 7.4, Paraformaldeide 4% (PFA:2 g paraformaldeide in 30 mL di

2 4

ddH O, 100 µL NaOH 1N, 16,6 mL di PBS 3X, aggiungere ddH O fino a 50 mL) sterilizzata per

2 2

filtrazione (filtro 0.2 µm) e conservata max 5 gg a 4°C, Hybridization buffer (2.422 g Tris-HCl pH

7.2 20 mM, 52.596 g NaCl 0.9 M, 10 g SDS), Washing Buffer (2.422 g Tris-HCl pH 7.2 20 mM,

52.596 g NaCl 0.9 M).

Per la preparazione dei vetrini si è proceduto lavandoli in acqua distillata bollente con alcune

gocce di HCl per 5 minuti e successivamente lavandoli altri 5 minuti in acqua distillata bollente

senza HCL. Sono stati asciugati a temperatura ambiente e immersi 30 min in una soluzione filtrata

di Gelatina 0.1 % e CrK(SO ) 0.01 % (≈ 100 ml per ogni vaschetta) e asciugati a temperatura

4 2

ambiente.

Per la fase di fissaggio si è pesato 0.5 g del campione che è stato diluito e pesato in tampone

PBS pH 7.4 (10 volte) a cui sono state aggiunte una spatola di palline di vetro e vortexato

accuratamente per 3 minuti. Centrifugare il campione a 300 rpm per un minuto e prelevare 250 µl

del surnatante. Aggiungere 750µl di paraformaldeide 4% e lasciare incubare a 4 °C overnight (per la

conservazione dei campioni trattare solo con PFA 4% e portarli a -80°c)

Per la preparazione del vetrino si è diluito il campione in modo appropriato con PBS 1X

(indicativamente 1600X con EUB, 400X con Bac, Bif, Erec, 40X con le altre sonde). Pipettare 10

µL del campione sul pozzetto del vetrino e spargere in modo omogeneo. Asciugare a temperatura

ambiente e deidratare per 10 minuti immergendo in etanolo 96%. Per la sonda Lab158 è necessario

un ulteriore step di permeabilizzazione, quindi occorre pipettare 10 µL di lisozima 1 mg/ml in

soluzione buffer TS, coprire con un coprivetrino e incubare 15 min a 37°C. Deidratare nuovamente

le slides permeabilizzate altri 10 minuti in etanolo 96% . I vetrini ottenuti possono essere conservati

un mese a temperatura ambiente.

La fase di ibridazione è stata effettuata preparando la soluzione di hybridization buffer con la

sonda specifica (per 100 µl di buffer, 1 µl di sonda (75 µM)) preriscaldando il buffer a 53°C e

dispensando 100 µl di soluzione sul vetrino, coprendo con un copri vetrino 22X50 e incubando

overnight in una camera buia e umida a 53°C. I vetrini sono stati lavati per 30 minuti in Washing

Buffer a 53°C, immersi in ddH O e asciugati velocemente con un phon. Pipettare 6 µl di Mounting

2

Fluid (vectashield) su ogni pozzetto, coprire il tutto co