Tesi Legionella - Riscontro epidemiologico del batterio legionella

INDICE

1.Introduzione 4

1.1 Che cosa è la Legionella? 4

1.1.2 Dove cresce il microrganismo? 5

1.1.3 Contaminazione negli impianti 6

1.1.4 Bonifica della Legionella nei vari impianti idrici e la normativa vigente negli ambienti

di lavoro 8

1.2 Storia del genere Legionella 9

1.3 Legionella spp. descrizione di alcuni ceppi conosciuti 12

1.4 Malattie provocate dalla Legionella e sintomi della Legionellosi 13

1.5 Legionella, batterio Gram-negativo 15

1.6 Patogenesi molecolare delle infezioni causate da Legionella pneumophila 16

1.6.1 Meccanismo di azione della L.pneumophila nelle cellule eucariotiche 16

1.7 La formazione del biofilm, nido di replicazione della Legionella 18

1.8 La Legionella al giorno d’oggi, monitoraggio epidemiologico e tecnico 19

1.8.1 Epidemiologia e sorveglianza nel tempo dei casi di Legionella nel territorio nazionale

italiano 20

2. Scopo del lavoro 22

3. Normativa vigente del Laboratorio 23

3.1 Apparecchiature usate 23

3.2 Terreni di coltura e reagenti usati 25

3.3 Procedura 26

3.4 Incubazione e identificazione 26

4.Risultati 31

4.1 Differenze tra acquedotti e pozzi 34

4.2 Strutture ricettive 35

4.3 Istituti riabilitativi 38

4.4 RSA, RSD, asili 41

4.5 Luoghi di lavoro 43

4.6 Condomini 49

4.7 Comuni 50

4.8 Cooperative sociali 53

5.Conclusioni 57

6. Bibliografia 60

3

2. Scopo del lavoro

L’obbiettivo della ricerca è identificare e analizzare la presenza di Legionella pneumophila in

acque del territorio aretino, evidenziando le tipologie di strutture che hanno evidenziato valori

positivi, per comprenderne le possibili cause e i motivi della diffusione. E’ stata condotta

un’analisi epidemiologica nell’anno 2024, fornendo un indagine atta alla prevenzione,

eradicazione e per contribuire al miglioramento della sicurezza di strutture, per la salute

pubblica. 22

3. Normativa vigente del Laboratorio

Per effettuare le analisi di laboratorio si eseguono le metodiche UNI EN ISO 11731:2017.

3.1 Apparecchiature usate

• Rampa filtrante con pompa a vuoto; necessita di un'accurata sterilizzazione mediante

fiamma ossidrica, viene utilizzata per permettere la filtrazione dei campioni di acqua

su filtri di carta.

• Pompa da vuoto regolata ad una pressione di circa 500-550 mm Hg; viene collegata

attraverso un tubo di gomma alla rampa di filtrazione per generare un gradiente di

il movimento dei fluidi deposti all’interno dei vari bicchieri.

pressione per permettere

• Membrane filtranti di policarbonato o PES sterili aventi pori di diametro 0.22

micrometri, da utilizzare quando la membrana su cui il campione è filtrato è sottoposta

a lavaggio.

• Vortex; dispositivo elettronico che attraverso un gommino in ripetuta vibrazione

(intensità regolabile) permette di staccare il particellato (deposizione in acqua sterile)

presente nei filtri precedentemente raccolti dalla rampa di filtrazione.

• Bagno termostatico regolabile a 50 ±1 °C; viene usato per mantenere i terreni di coltura

allo stato liquido, per prevenire la loro solidificazione a temperatura ambiente.

• Incubatore termostato regolabile alla temperatura di 37±1°C; in pratica delle piccole

camere termostatiche, regolate a temperatura costante, permette la crescita ottimale

dei vari microrganismi attesi nelle analisi.

• Autoclave; apparecchiatura sigillata e chiusa, viene usata per mantenere al suo interno

una combinazione di pressione e temperature elevate, con lo scopo di sterilizzare

strumenti, materiali e liquidi contenuti nei recipienti (bottiglie di vetro).

• Cappa sterile; detta anche cappa a flusso laminare, è un piccolo ambiente di lavoro

privo di contaminanti grazie alla filtrazione dell’aria.

estremamente controllato

• di vetro sterilizzati all’interno dell’autoclave,

Barattoli di vetro o polistirene; recipienti

servono per contenere i terreni allo stato solido-liquido, acqua sterile o talvolta,

campioni di analisi. 23

• Micropipette 100-1000 µL e relativi puntali sterili, pipette sterili; strumentazione in vetro

l’asetticità.

usate per prelevare piccole aliquote di campioni preservandone

• Spatole ad “L” monouso sterili; piccole anse di plastica, monouso e sterili, usate per

spatolare campioni di legionella sui terreni di coltura specifici.

• Pipette graduate 2-10 mL sterili o monouso sterili; strumenti di vetro usa e getta, (tubi

cavi) spesso usate per il trasporto di acqua sterile tra i vari recipienti di vetro o per il

prelevamento di campioni di acqua.

• pH metro; apparecchiatura elettronica per il controllo e la misurazione del pH di liquidi

vari. 24

3.2 Terreni di coltura e reagenti usati

TIPO PREPARAZIONE DURATA PERICOLO

Riportata

Terreno in piastre nell’etichetta

BCYE AGAR -

pronto all’uso della confezione

Sciogliere 8 g di Lab-

Lemco Broth (CM0015)

in 1 litro di acqua

distillata aggiungendo

anche 5 g di Sodium

Chloride (LP 0005), 15 g

NUTRIENT AGAR Agar 1 mese -

(NUT) Bacteriological(LP0011)

Sterilizzare in autoclave

a 121°C per 15’,

distribuire in piastre petri

in ragione di 15 ml

ciascuna. Stoccare in

frigorifero. Riportata

GVPC AGAR -

Terreno in piastre nell’etichetta

pronto all’uso della confezione

20 ml di acido

concentrato (densità Preparata al

–

ACIDO CLORIDRICO 1.16 e concentrazione momento Corrosivo e irritante

soluzione A dell’utilizzo

minima 31.5%) in 1 L di

acqua sterile distillata

CLORURO DI 14.9 g di polvere in 1 L Preparata al

–

POTASSIO soluzione di acqua distillata momento -

dell’utilizzo

B sterile

Miscelare 3.9 ml di

soluzione A in 25 ml di 1 mese al buio in

Miscela soluzione A+B soluzione B. Portare il bottiglia di vetro Corrosivo e irritante

(SOLUZIONE ACIDA) pH 2.2 +/- 0.2 con a temperatura

soluzione di idrossido ambiente

di potassio. Riportata -

Test pronto all’uso nell’etichetta

TEST AL LATTICE della confezione

Tabella 2: Categorizzazione del materiale usato 25

3.3 Procedura

La procedura qui descritta si esegue nel caso di campioni di acqua potabile provenienti da

strutture che applicano le misure di prevenzione indicate nelle linee guida e per le quali quindi

ci si aspetta una concentrazione di Legionella non molto elevata. Essa si applica inoltre

quando non è ben nota, o comunque non è possibile prevedere, la possibile concentrazione

di Legionella nel campione di acqua potabile, oppure nel caso in cui la struttura oggetti di

campionamento abbia effettuato dei trattamenti di bonifica nei confronti di Legionella

Il campione d’acqua deve essere ben agitato manualmente per staccare

pneumophila. le

legionelle che aderiscono alle pareti del contenitore, soprattutto se questo è di plastica.

Il campione d’acqua viene poi filtrato attraverso membrane sterili di policarbonato o PSE con

porosità pari a 0,22 µm poste su apparati filtranti.

La filtrazione avviene attraverso una pompa da vuoto, esercitando preferibilmente una

pressione di circa 500-550 mm Hg.

Al termine della filtrazione la membrana viene prelevata con pinzette sterili e posta in un

contenitore di vetro o plastica monouso sterile di capacità adeguata e richiudibile. Si

aggiungono 10 ml di diluente o acqua sterile. Si procede poi ad una agitazione vigorosa per 2

minuti con il vortex, ottenendo così il campione concentrato. Si suddivide il campione in tre

non subisce trattamenti, una viene trattata con il calore (3 mL in provetta

aliquote: Un’aliquota

sterile) e una con soluzione acida (3 mL in provetta sterile). Per quanto riguarda il trattamento

al calore l’aliquota di campione concentrato è mantenuta a 50±1 °C per 30±2 minuti. Per

quanto riguarda il trattamento all’acido, l’aliquota di 3 mL viene diluita con 27 mL di soluzione

acida, mescolata bene e lasciata agire per (5±0.5) minuti.

Vengono quindi inoculati 0.1 mL del campione concentrato (non trattato, trattato con calore e

trattato con acido) su terreno di coltura selettivo per Legionella BCYE AGAR e GVPC AGAR

e si procede a spatolare (semina per spatolamento).

Qualora si preveda una contaminazione estremamente bassa di Legionella è opportuno

effettuare meno diluizione possibile per garantire un maggior recupero; pertanto

tendenzialmente si seminano 0.5 mL del concentrato, ottenuto mediante sospensione della

membrana in 5 mL di acqua sterile.

3.4 Incubazione e identificazione

Viene effettuata l’incubazione a 36±2 °C per 10 giorni. Si posizionano le piastre all’interno di

una giara (contenitore con chiusura a clip, in vetro borosilicato) per prevenire la disseccazione

del terreno di coltura. Si controlla la crescita nelle piastre dopo 4 giorni di incubazione, in modo

tale da valutare eccessiva crescita di colonie e registrare il valore di lettura nel foglio di lavoro;

per il risultato finale si devono attendere comunque 10 giorni di incubazione, al termine dei

26

quali si effettua la lettura definitiva registrandola nel foglio di lavoro. Qualora dopo 4 giorni vi

sia crescita batterica eccessiva nelle piastre, e quindi le colonie presenti non risultino contabili,

si effettueranno diluizioni sul concentrato o sul campione (stoccati in frigorifero per non più di

4 giorni a partire dalla data di campionamento); oppure in alternativa sarà ripetuta l’analisi

dell’acqua, che sarà nuovamente campionata, apportando opportune diluizioni. –

Le colonie di Legionella si possono presentare in vario modo, ed in generale sono bianche

grigie. Le colonie inoltre appaiono lisce, con margini netti e aspetto a vetro smerigliato. Alla

lampada ultravioletta alcune specie di Legionella sviluppano fluorescenza bianco brillante (ad

esempio Legionella anisa, Legionella bozzemanii, Legionella parisiensis). Legionella erythra

e Legionella rubrilucens alla lampada ultravioletta mostrano fluorescenza rossa, mentre

Legionella pneumophila verde scuro con delle sfumature gialle. Non si devono esporre per un

tempo eccessivo le colonie alla lampada ultravioletta poiché ciò potrebbe causare la morte

dei batteri.

Nel caso di presenza di colonie di Legionella tipiche, per avere una discreta rappresentatività

delle colonie presenti in un campione vengono analizzate 3 colonie per ogni piastra seminata,

qualora nella suddetta piastra sia presente un solo tipo di colonia. Se invece, vi sono nella

piastra colonie aventi differente morfologia, per ciascuna tipologia se ne semina una colonia,

per avere conferma viene effettuato un isolamento, mediante la semina su BCYE AGAR e

NUTRIENT AGAR (privo di cisteina). Si mettono a incubare le piastre a (36±2) °C per 2-5

giorni.

Si procederà quindi alla identificazione. Si potrà effettuare una valutazione quantitativa (unità

formanti colonia/litro, UFC/l) in base al numero di colonie contate per piastra, al numero delle

colonie confermate tra quelle sottoposte a conferma e al volume filtrato. Per determinare il

numero di UFC di Legionella presenti nel campione, si deve considerare la piastra che

presenta il maggior numero di colonie confermate. Se attraverso le procedure di analisi e

identificazione si ottengono dati di quantificazione prima dei 10 giorni si possono comunicare

al committente al fine di consentire le idonee misure di prevenzione e controllo a tutela della

salute pubblica. Tali dati saranno indicati come “preliminari” e dovranno essere

successivamente confermati.

La conferma avviene nel modo seguente. Le colonie di Legionella presenteranno crescita su

BCYE AGAR e assenza di crescita su NUTRIENT AGAR, per l'incapacità di Legionella di

moltiplicarsi in assenza di L-cisteina. L. oakdrigensis e L. spiritensis richiedono L-cisteina e

ferro per l’isolamento primario, ma possono crescere debolmente anche in terreno privo di L-

cisteina. Pertanto, deve essere accuratamente osservata la differenza di crescita nel terreno

con e senza cisteina (semina per isolamento).

Questa identificazione presuntiva deve essere confermata attraverso l’utilizzazione di reagenti

specifici. Si effettua dunque il test di agglutinazione al lattice. I reagenti di agglutinazione per

27

il sierogruppo Legionella pneumophila consistono di una sospensione tamponata di particelle

di lattice rivestite con anticorpi purificati. Gli anticorpi sono specificamente indirizzati contro gli

antigeni di superficie del sierogruppo L. pneumophila. Quando una goccia di una sospensione

di colonie sospette di Legionella è miscelata con una goccia di reagente al lattice e l'organismo

in questione è uno dei sierogruppi di L. pneumophila, essa si legherà al lattice sensibilizzato

anti-Legionella specifico. La miscela determinerà un'agglutinazione visibile e l'aggregato

risultante viene graduato ad occhio nudo.

Procedimento:

• Portare i reagenti a temperatura ambiente;

• Agitare bene i reagenti;

• Dispensare una goccia di tampone all’interno dei 4 cerchi presenti sul cartoncino di

reazione;

• Dispensare nei quattro cerchi i reagenti, ovvero in un cerchio il reagente di controllo,

nel secondo il reagente per l’identificazione di Legionella spp., nel terzo il reagente per

e nell’ultimo il reagente per l’identificazione di

Legionella pneumophila sier. 1

Legionella sier. 2-15. Assicurando che in questa fase il lattice ed il tampone non

vadano a contatto tra di loro;

• Con ansa sterile si preleva una colonia di almeno 1 mm di diametro (se colonie sono

più piccole prelevarne due o più) ed emulsionarla accuratamente con la soluzione

tampone in modo tale da ottenere una soluzione omogenea. Ripetere la procedura per

ciascuno dei reagenti;

• Mescolare i reagenti al lattice con la sospensione, spandendo la miscela sull’intera

area di reazione. Per ciascun reagente utilizzare una nuova ansa;

• Roteare il cartoncino di reazione e osservare l’eventuale comparsa di agglutinazione,

che deve apparire dopo massimo 1 minuto; 28

L’interpretazione del test avviene nel modo seguente:

• Risultato positivo: agglutinazione e quindi comparsa di granuli blu nel cerchio di

reazione in cui è presente reagente per Legionella pneumophila sier. 1 o sier. 2-15 e

assenza di agglutinazione nel cerchio dove è presente il reagente di controllo.

Qualora si vengano a creare formazioni fibrose-viscose o granulose anomale considerare la

reazione positiva qualora il colore blu di fondo del reagente presenti una marcata limpidezza.

• Risultato negativo: non si verifica agglutinazione nel cerchio di reazione in cui è

presente reagente per Legionella pneumophila sier. 1 o sier. 2-15 e assenza di

agglutinazione nel cerchio dove è presente il reagente di controllo.

Qualora si vengano a creare formazioni fibrose-viscose o granulose anomale considerare la

reazione negativa qualora il colore blu di fondo del reagente non presenti una marcata

limpidezza.

• Risultato non interpretabile: se si verifica agglutinazione nel reagente di controllo, il

ceppo in questione è auto agglutinante e quindi il risultato non è interpretabile. Inoltre,

il risultato non è interpretabile qualora si verifichi agglutinazione sia nel cerchio con

reagente per Legionella pneumophila sier. 1 e per sier. 2-15, poiché è possibile che si

sia verificata una reazione crociata tra Legionella pneumophila sier. 1 e sier. 2-15.

Figura 12: Nel cerchio 4 si osserva agglutinazione, segno che il test è positivo. Nel cerchio 5

invece il test è negativo 29

Il numero delle unità formanti colonia di Legionella presenti in 1 litro (UFC/1000 mL) viene

calcolato in base al numero delle colonie contate sulla piastra considerata, al numero delle

colonie confermate tra quelle sottoposte a conferma, alla diluizione eventualmente effettuata

sul campione e al fattore di concentrazione secondo la seguente formula:

×

= ×

×

dove:

Cs = numero di Legionella pneumophila UFC/l;

a = (numero di colonie confermate / numero totale di colonie testate) x conta totale;

V =volume di liquido concentrato in mL;

c

V = volume di campione inoculato nelle piastre in mL;

V = volume testato totale del campione analizzato in mL;

tot

V = volume di riferimento scelto per l’espressione della concentrazione dei microrganismi nel

s

campione, espresso in millilitri;

Figura 13: Esempio di piastra risultata positiva alla legionella (terreno BCYE-AGAR) si

possono notare tutte le colonie formate con una colorazione tra il giallo e il bianco 30

Figura 14: Esempio di piastra risultata positiva alla legionella (terreno GVPC-AGAR) qui

invece la colorazione delle colonie formatosi è tendente al bianco/grigio bluastro

4.Risultati

Nel corso del 2024 è stato condotto uno screening approfondito sulla presenza della

Legionella pneumophila in campioni di acqua raccolti da un ampio spettro di strutture situate

nel territorio aretino. L’indagine ha coinvolto diverse tipologie di ambienti, tra cui:

• Strutture ricettive (tra cui piscine e palestre)

• Istituti riabilitativi

• RSA, RSD, asili

• Luoghi di lavoro, come aziende pubbliche e/o private

• Condomini

• Comuni

• Cooperative sociali

I campioni sono stati distinti in base alla fonte di provenienza (se acqua di acquedotto o di

dell’acqua (calda o fredda), al fine di comprendere al

pozzo) e alla temperatura di prelievo

meglio le caratteristiche ambientali che possono influenzare la presenza e la proliferazione

del batterio. Questa