Tesi completa sulla Legionella pneumophila caratterizzazione e riscontro epidemiologico nel territorio aretino

Scuola di Scienze della Salute Umana

Corso di Laurea in Scienze Farmaceutiche Applicate - Controllo Qualità

Caratterizzazione e riscontro epidemiologico del batterio Legionella pneumophila nel territorio Aretino

Relatore: Prof. Massimiliano Marvasi

Correlatore: Luana Ghiandai

Candidato: Oreste De Nozzi

Anno Accademico: 2023/2024

Indice

• Introduzione
• Che cosa è la Legionella?
• Dove cresce il microrganismo?
• Contaminazione negli impianti
• Bonifica della Legionella nei vari impianti idrici e la normativa vigente negli ambienti di lavoro
• Storia del genere Legionella
• Legionella spp. Descrizione di alcuni ceppi conosciuti
• Malattie provocate dalla Legionella e sintomi della legionellosi
• Legionella, batterio Gram-negativo
• Patogenesi molecolare delle infezioni causate da Legionella pneumophila
• Meccanismo di azione della L. pneumophila nelle cellule eucariotiche
• La formazione del biofilm, nido di replicazione della Legionella
• La Legionella al giorno d’oggi, monitoraggio epidemiologico e tecnico
• Epidemiologia e sorveglianza nel tempo dei casi di Legionella nel territorio nazionale italiano
• Scopo del lavoro
• Normativa vigente del laboratorio
• Apparecchiature usate
• Terreni di coltura e reagenti usati
• Procedura
• Incubazione e identificazione
• Risultati
• Differenze tra acquedotti e pozzi
• Strutture ricettive
• Istituti riabilitativi
• RSA, RSD, asili
• Luoghi di lavoro
• Condomini
• Comuni
• Cooperative sociali
• Conclusioni
• Bibliografia

Introduzione

Che cosa è la Legionella?

La Legionella pneumophila è un batterio gram negativo, un bacillo flagellato che prolifera in ambienti umidi, come sistemi idrici e impianti di aerazione, ed è il principale responsabile della legionellosi, un’infezione respiratoria che può causare polmoniti gravi (Krause, 2022).

A livello patogenico, si comporta come un parassita intracellulare. Infetta i macrofagi alveolari, ovvero, cellule immunitarie deputate alla rimozione di agenti patogeni e particelle inalate delle vie respiratorie, favorendo così l’insorgenza dell’infezione anche nelle cellule epiteliali (Fields et al., 2002). Il processo patologico della malattia richiede che il batterio raggiunga direttamente i polmoni; di conseguenza, altre vie di esposizione, quali l’ingestione di alimenti o di acque contaminate, non rappresentano la condizione diretta e sufficiente affinché la legionellosi possa svilupparsi. Il contagio può avvenire solo attraverso l’inalazione di aerosol contaminato, prodotto da docce, rubinetti o dispositivi di nebulizzazione dell’acqua (Jamie Bartram, WHO 2007).

Figura 1: Legionella al microscopio ottico dopo la colorazione di Gram, si possono notare bene le strutture filamentose che formano questi aggregati cellulari.

Figura 2: Legionella al microscopio elettronico a trasmissione, si può notare bene la forma a bastoncello e delle inclusioni sferiche più chiare, come vacuoli o granuli di accumulo.

Dove cresce il microrganismo?

Il batterio può proliferare sia in ambienti domestici che in contesti aziendali e pubblici, grazie alla sua notevole capacità di adattarsi a diverse condizioni idriche. In questi ambienti, fattori come il ristagno dell’acqua e la formazione di biofilm (strato di microrganismi aderenti a una superficie, protetti da una matrice vischiosa) ne favoriscono la resilienza e la diffusione. A livello domestico, la Legionella è spesso presente in docce, rubinetti, serbatoi di acqua calda come gli scaldabagni. Negli ambienti aziendali e pubblici, il batterio trova condizioni ottimali di crescita in impianti idrici complessi e soprattutto nei sistemi di climatizzazione dell’aria, che richiedono una manutenzione costante per prevenire la contaminazione. Le condizioni ideali per la crescita di questo microrganismo si riscontrano a temperature comprese tra 20°C e 50°C, rendendo strutture come torri di raffreddamento, serbatoi d’acqua e condizionatori d’aria molto suscettibili alla colonizzazione batterica. In assenza di una manutenzione rigorosa e adeguata, questi impianti possono trasformarsi in vettori di contaminazione ambientale, aumentando notevolmente il rischio di infezione per l’uomo (Jamie Bartram et al., 2007; Krause, 2022).

Bisogna specificare che tutte le parti dell’impiantistica possono essere potenziali incubatori per il batterio, anche nei diffusori delle docce, nei rompigocce dei rubinetti, dove l’accumulo di calcare ne facilita la crescita. Per prevenirla è sufficiente eseguire regolari operazioni di decalcificazione, come anche il controllo dello stato delle guarnizioni dei vari impianti idrici, sostituendole quando usurate. Durante le operazioni di manutenzione delle varie strutture è fondamentale rimuovere ostruzioni e verificare la presenza di rami ciechi o tratti morti (tubi ad U) all’interno delle tubature, poiché sono condizioni che facilitano lo sviluppo del batterio (IRCS Lucia Diella, 2024).

Anche gli impianti di climatizzazione delle automobili necessitano di una regolare revisione, come il controllo periodico del sistema dell’aria condizionata e del serbatoio dell’acqua dei tergicristalli, ove, in assenza di detergenti vari, può creare un ambiente favorevole alla contaminazione. Un’adeguata manutenzione è quindi di fondamentale importanza anche nei mezzi di trasporto, per garantire la sicurezza dell’impiantistica.

Figura 3: Formazione calcarea all’interno di un tubo di ferro, rappresenta l’habitat ideale per la crescita e la proliferazione del batterio.

Contaminazione negli impianti

Con l’urbanizzazione e l’introduzione di sistemi idrici sempre più complessi e diramati, la molteplicità degli habitat e delle varie fonti di contaminazione del batterio sono sempre in costante crescita. Spesso sono difficili da individuare poiché può proliferare in ambienti dove l’acqua è stagnante e di conseguenza non trattata correttamente. È fondamentale comprendere le principali fonti di contaminazione per implementare misure preventive e proteggere la salute pubblica.

Di seguito vengono riportate le principali fonti di contaminazione, che sono soggetto a campionamento, per il controllo della Legionella, nei vari impianti idrici di strutture pubbliche e private:

• Sistemi idrici complessi: spesso si ritrovano utilizzati in ospedali, hotel e impianti industriali; in generale, i contesti lavorativi sono particolarmente vulnerabili alla contaminazione. Questi possono essere sistemi di riscaldamento e raffreddamento, oppure di distribuzione dell’acqua sanitaria, che spesso presentano rischi di stagnazione dell’acqua, come nelle tubature più vecchie o in quelle di difficile accesso. Quando l’acqua rimane stagnante per lunghi periodi, le condizioni di temperatura e pH possono favorire la proliferazione del batterio ed eventuali mancate manutenzioni e/o monitoraggi programmati possono sviluppare potenziali focolai di Legionella in queste strutture (Jamie Bartram, WHO 2007).
• Tubi e serbatoi d’acqua, soprattutto in strutture riabilitative, RSA, RSD e asili: sono un’altra importante fonte di contaminazione. La Legionella si insedia facilmente nei biofilm che si formano sulle superfici interne di tubature, serbatoi e rubinetti, in particolare quando l’acqua non circola bene presentando un flusso ridotto. Il biofilm fornisce protezione per il batterio, che può sfuggire dai trattamenti di disinfettanti, come il cloro, utilizzati nelle tubazioni di acqua potabile (Jamie Bartram, WHO 2007).
• Docce e impianti sanitari: le docce sono tra le fonti più comuni di infezione da Legionella, soprattutto in ambienti ad alta affluenza di persone, come ospedali, alberghi o palestre. Il batterio prolifera facilmente in questi impianti poiché spesso sono presenti temperature favorevoli alla sua crescita. Spesso le fonti principali di sviluppo del batterio sono le formazioni calcaree che nei tubi portano allo sviluppo del biofilm (Jamie Bartram, WHO 2007).
• Sistemi di distribuzione di acqua potabile: la contaminazione di acqua potabile rappresenta un altro vettore fondamentale per lo sviluppo del batterio, soprattutto dove le tubature appartengono a strutture vecchie, o anche se lasciate ferme per tanto tempo, favoriscono maggiormente il ristagno di acqua e spesso sono accompagnati da malfunzionamenti nella circolazione dell’acqua, alimentando le condizioni di sviluppo del germe (Jamie Bartram, WHO 2007).
• Torri di raffreddamento: sono una delle principali fonti di Legionella in ambienti industriali e urbani. Questi impianti utilizzano l’acqua per raffreddare i circuiti e, se non vengono mantenuti correttamente, possono facilmente accumulare biofilm e sedimenti che favoriscono la proliferazione batterica. In particolare, il processo di raffreddamento comporta la vaporizzazione dell’acqua e di conseguenza alla dispersione di piccole goccioline d’acqua infetta nell’aria, che possono essere inalate dalle persone presenti nelle immediate vicinanze, come lavoratori o civili residenti nelle zone limitrofe. Come tipologia di struttura, sono spesso sottoposte a rigorosi controlli, dato che l’uso improprio di questi impianti rappresentano potenziali rischi per contrarre la malattia causata dalla Legionella (Jamie Bartram, WHO 2007).
• Spa naturali, idromassaggi e piscine: sebbene l’acqua delle piscine e delle spa venga trattata con disinfettanti come il cloro, una gestione inefficace della qualità dell’acqua può comportare il rischio di contaminazione. In questi ambienti, vanno tenuti sotto rigoroso controllo i sistemi di riscaldamento e di filtrazione dell’aria e dell’acqua. I bagni di vapore e le piscine termali sono particolarmente rischiosi, poiché rappresentano l’habitat perfetto per il contagio, attraverso le fini goccioline d’acqua costantemente disperse nell’aria (Jamie Bartram, WHO 2007).

I metodi migliori per ridurre i rischi di contaminazione sono quelli di adottare misure preventive e garantire un corretto e costante monitoraggio degli impianti, sia in contesti aziendali che pubblici e privati.

Bonifica della Legionella nei vari impianti idrici e la normativa vigente negli ambienti di lavoro

La Legionella rappresenta un serio problema per la salute pubblica in tutti gli impianti idrici nella loro complessità di costruzione e varietà di habitat, visto che, come già citato, può proliferare in qualsiasi contesto umido. Il miglior modo per evitare che le impiantistiche idriche possano sviluppare il germe prevede un costante monitoraggio delle condizioni igieniche e attuare pronti interventi di manutenzione. La normativa vigente in termini di salute e sicurezza dei lavoratori nei luoghi di lavoro è strettamente regolata da un unico testo normativo.

In particolare, sia la Legionella pneumophila che le rimanenti specie di legionelle patogene per l’uomo (Legionella spp.) sono classificate come agente biologico del gruppo 2, ossia, come definito nell’articolo 268 (classificazione degli agenti biologici) un “agente che può causare malattie in soggetti umani e costituire un rischio per i lavoratori; è poco probabile che si propaghi nella comunità; sono di norma disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche”. Pertanto, il datore di lavoro ha l’obbligo di valutare il rischio legionellosi presso ciascun sito di sua responsabilità, secondo l’Art 271.

Le linee guida atte alla prevenzione e il controllo della legionellosi, emendate dal Ministero della Salute, prevedono due tipologie di misure preventive/eradicazione, in particolare una nel breve termine e l’altra nel lungo termine (Linee guida Ministero della salute-Allegato 13).

Nel breve termine:

In assenza di interventi strutturali, per prevenire la contaminazione, vengono applicate buone pratiche di manutenzione dell’impianto idrico, come:

• Decalcificazione degli elementi usurati, come rubinetti e soffioni, attraverso l’immersione in soluzioni acide (acido solfammico, acido acetico) seguita da una disinfezione in acqua fredda con cloro libero (50mg/L per almeno 30 minuti).
• Sostituzione di giunti, filtri e tubi flessibili usurati, in funzione della qualità dell’acqua (l’acqua dura accelera la formazione di calcare).

Tutte le operazioni devono rispettare il D.lgs. 81/2008 per garantire la sicurezza degli operatori e degli utenti (Linee guida Ministero della salute-Allegato 13).

Nel lungo termine:

• Microfiltrazione: Va a rimuovere la Legionella dall'acqua al punto di utilizzo, mediante filtri con una barriera meccanica da 0,2 µm. Questo sistema è facile da installare e richiede sostituzioni regolari a causa dell'intasamento progressivo del filtro. È particolarmente utile in ambienti ad alto rischio, come ospedali.
• Trattamento termico: Il riscaldamento dell'acqua a temperature tra 50 e 55°C inibisce la proliferazione di Legionella. Temperature superiori a 60°C (pastorizzazione) riducono il numero di colonie in funzione del tempo di esposizione. I metodi di disinfezione termica comprendono lo shock termico e la disinfezione termica.
• Irraggiamento UV: La luce ultravioletta a 254 nm inattiva i batteri dimerizzando la timina nel DNA, impedendone la replicazione. È un metodo di disinfezione efficace vicino al punto di applicazione, ma non ha effetto residuo. Pertanto, non è adatto come unica soluzione per trattare un intero edificio, poiché il batterio può persistere nel biofilm, nei punti morti e nelle aree stagnanti dell'impianto.
• Clorazione: Il cloro, un agente ossidante, è efficace nel controllo igienico-sanitario delle acque potabili e nell'inattivazione di Legionella pneumophila. Per eliminare il batterio, è necessaria una concentrazione costante di cloro tra 1 e 3 mg/L. Esistono due approcci di disinfezione: Iperclorazione shock, che prevede un aumento rapido della concentrazione di cloro, e l’iperclorazione continua, che invece va a mantenere una concentrazione costante nel tempo. Questi metodi aumentano anche la concentrazione di cloro residuo e dei sottoprodotti di disinfezione. La concentrazione ottimale dipende dalle caratteristiche chimiche e fisiche dell'acqua e dalla struttura dell'impianto. Inoltre, poiché l'attività biocida del cloro diminuisce in ambiente alcalino, è importante mantenere il pH tra 6 e 7 per garantirne l'efficacia.
• Disinfezione con biossido di cloro: il biossido di cloro è efficace nel controllo della contaminazione da Legionella, utilizzato inizialmente in acquedottistica e poi anche negli impianti per la produzione di acqua sanitaria. Rispetto al cloro, ha il vantaggio di essere più attivo contro il biofilm. La sua efficacia varia a seconda dei materiali delle tubazioni: è più efficace sulla gomma rispetto alla plastica, mentre non sembra adatto per tubazioni in rame (Linee guida Ministero della salute).

Storia del genere Legionella

I batteri del genere legionella furono scoperti nel 1976, quando si verificò un’epidemia di polmonite grave tra i partecipanti al raduno dei veterani della Legione Americana al Bellevue Stratford Hotel di Philadelphia; la fonte di contaminazione fu identificata nel sistema di aria condizionata. Quell’anno, l'America celebrava il bicentenario della separazione dalla Gran Bretagna e di 200 anni come nazione libera. In quella occasione, più di 200 persone si ammalarono e 34 morirono. Questi casi di infezione destarono delle osservazioni scettiche: prima dell’estate era stato prodotto un bollettino, dove si citava la scoperta di una nuova malattia, spesso fatale, chiamata Pantosomatite, che si stava diffondendo negli Stati Uniti orientali. Ma in realtà, questi casi non erano connessi a questa malattia.

Inizialmente, nessun test di laboratorio riuscì a scoprire la causa scatenante dell’epidemia, ma passarono mesi e mesi di indagini e analisi per portare Joseph McDade all’individuazione di un nuovo batterio, poi chiamato Legionella pneumophila, come agente eziologico di questa misteriosa epidemia, da cui successivamente presero nome la “malattia del legionario” o “legionellosi”; i due tipi di infezioni vennero isolati per la prima volta dai tessuti polmonari di una delle vittime (Paula H. Vance, et al. 2015).

Studi successivi hanno poi dimostrato che in realtà questo microrganismo era presente in precedenza all’interno di numerose fonti ambientali, come anche citato in sistemi idrici artificiali e tubature degli impianti vari, e che soprattutto, la trasmissione avviene attraverso l’inalazione di aerosol contaminato (Paula H. Vance, et al. 2015).

Figura 4: Foto dall’alto del Bellevue Stratford Hotel di Philadelphia, 1976.

Dopo la scoperta del batterio, si comprese che non era un nuovo agente patogeno, ma piuttosto un organismo misconosciuto. Nel 1965, presso il St. Elizabeth’s Hospital, un ospedale psichiatrico di Washington DC, 81 pazienti iniziarono a manifestare sintomi da malattia respiratoria, per cui purtroppo 14 di essi morirono. La causa dell’infezione venne attribuita alla polvere contaminata, alzatasi da uno scavo nel cortile dell’ospedale che, con il vento, venne diffusa nell’aria (Thacker, SB, Bennett, et al. 1978).

Attualmente, la legionellosi è considerata una patologia endemica in numerose aree.