Dalla terapia genica alla riparazione cartilaginea

‎CONCLUSIONI

‎problema di biosicurezza ‎coinvolte in replicazione ed espressione del genoma virale

‎sfruttano le proprietà dei virus

‎nella veicolazione degli acidi nucelici ‎1. infezione ‎virus inietta materiale genetico nella cellula ospite

‎progressi

‎nell'identificazione di geni con potenzialità terapeutica ‎virus virulenti

‎ciclo litico ‎1. batterio replica e trascrive il materiale genetico virale ‎produzione proteine virali

‎nei batteri ‎processo ‎2. virus si assemblano e provocano la lisi della cellula ospite

‎3. infezione di nuove cellule

‎2. replicazione ‎virus temperati ‎1. DNA virale integrato nel cromosoma batterico

‎ciclo lisogeno ‎processo

‎replicazione virale ‎2. cellule figlie contengono un DNA con mat genetico virale

‎cambiamenti cellulari possono provocare l'abbandono dello stadio temperato ‎attivazione ciclo litico

‎1. adsorbimento virione dalla membrana cellulare

‎METODI VIRALI ‎2. penetrazione nella cellula

‎3. apertura del capside e liberazione mat genetico

‎nelle cellule eucariotiche ‎4. replicazione, trascrizione e traduzione mat genetico ‎sintesi proteine virali

‎5. assemblaggio proteine virali con mat genetico ‎creazione nuove particelle virali

‎infezione altre cellule

‎6. rilascio nuove particelle fuori dalla cellula ‎lisi ‎non più capace di replicarsi

‎sostituzione sequenze TRANS con gene terapeutico ‎eliminati elementi virulenti

‎separazione fisica delle sequenze in TRANS da quelle in CIS ‎sovrapposizione sequenze

‎impossibile separazione perfetta

‎virus trasformati in vettori ‎limita la biosicurezza ‎rischio ricostituzione genoma con geni virali capace di replicare

‎infezione abortiva

‎settore interdisciplinare

‎definizione ‎obiettivo: produzione tessuti/organi che crescano con il paziente

‎donatori << richiedenti

‎1. allotrapianto ‎limiti

‎autologa ‎terapia immunosoppressiva tutta la vita VS rigetto

‎ustioni ‎da sito sano a malato

‎2. autotrapianto

‎danni alla cartilagine ‎utilizzo per: ‎allogenica ‎non avrà tutte le funzioni

‎origine ‎limiti:

‎danni al fegato ‎possibili complicazione nel sito di prelievo

‎fallimento tessuto/organo

‎rischio trasmissione patogeni ‎limite ‎infezione

‎xenogenica

‎utilizzo temporaneo prima del trapianto ‎3. sostituzione con protesi ‎limiti ‎durata limitata

‎ADULTE

‎proliferazione controllata ‎modesta biocompatibilità

‎vantaggi:

‎no problemi etici ‎soluzione permanente

‎GENERALITA' ‎4. ing. tissutale ‎vantaggi

‎proliferazione limitata ‎no terapie supplementari

‎no differenziamento ‎svantaggi: ‎NO controllo continuo dei parametri

‎CELLULE

‎difficili da prelevare ‎STATICA ‎operatori x cambiare il terreno di coltura

‎es. sangue ‎facili da isolare ‎difficoltà a mantenere la sterilità

‎cellule coltivate sullo scaffold ‎condizioni di coltura

‎quantità "illimitata" ‎vantaggi: ‎bioreattori

‎bassa immunogenicità ‎nutrienti

‎miglior trasporto di

‎DINAMICA

‎proliferazione incontrollata ‎prodotti di scarto

‎STAMINALI

‎differenziazione incontrollata ‎svantaggi: ‎IN VITRO ‎sterilità garantità

‎problemi etici x le ESC ‎applicazione stimoli meccanici

‎INGEGNERIA

‎mancanza di marcatori x individuarle precisamente ‎limiti: ‎formazione tessuto

‎TISSUTALE ‎APPROCCI ‎impianto tessuto

‎diversa per ogni tessuto ‎scaffold impiantato nell'organismo

‎supporto strutturale ‎IN VIVO ‎cellule migrano e lo colonizzano

‎mima ECM

‎contribuire alle proprietà meccaniche del tessuto ‎formazione tessuto che sostituisce lo scaffold

‎fornire molecole bioattive ‎funzioni

‎riserva fattori di crescita ‎rilasciati

‎SCAFFOLD ‎CHIMICI

‎fornire spazio per il rimodellamento del tessuto ‎immobilizzati

‎scaffold preformati ‎continuo apporto di nutrienti, ossigeno e GF

‎SEGNALI

‎ECM decellularizzata ‎continua rimozione metaboliti

‎4 approcci

‎foglietti cellulari ‎stimolazione fisica e meccanica delle cellule

‎incapsulazione in idrogel ‎mantenimento condizioni fisiologiche

‎MECCANICI ‎BIOREATTORI ‎mantenimento sterilità

‎monitoraggio costante

‎facilitare distribuzione cellulare uniforme ‎no citotossico ‎in vitro e in vivo

‎adesione

‎supporto 3D ‎proliferazione

‎differenziamento ‎intrinseca del materiale

‎fornire stabilità meccanica e di forma ‎proprietà meccaniche ≈ tessuto ‎derivante dal processo di lavorazione

‎pori interconnessi ‎nutrienti

‎poroso ‎vascolarizzazione ‎x trasporto ‎sostanze di scarto

‎cicli di congelamento-scongelamento ‎garantisce l'integrazione del nuovo tessuto con l'ospite

‎1. lisi membrana cellulare ‎consente

‎trattamenti fisici ‎formazione nuovo tessuto

‎soluzioni ipo-ipertoniche ‎rimozione componenti immunogeniche ‎rimodellamento

‎metodo enzimatico ‎trattamento con tripsina/EDTA ‎2. rottura connessioni cellula-cellula e cellula-matrice ‎mantiene integrità meccanica

‎detergenti ‎3. rimozione componenti nucleari e citoplasmatici ‎v degradazione ≈ v rigenerazione tessuto ‎evita danni ai tessuti circostanti

‎stesso tessuto ‎proprietà

‎funzioni omologhe ‎composizione chimica

‎es. vasi decellularizzati -> protesi vascolari ‎dipende da: ‎peso molecolare

‎tessuti diversi ‎non omologhe ‎cristallinità

‎utilizzata per

‎es. sottomucosa intestinale -> protesi vascolari o tendini o pelle ‎biodegradabilità controllata ‎temperatura

‎vasi e valvole ‎ECM DECELLULARIZZATA ‎ambiente ‎pH

‎nervi ‎esempi tessuti ingegnerizzati ‎è influenzata da ‎carichi meccanici

‎tendini e legamenti ‎metabolismo

‎meccaniche ‎metabolizzati

‎biologiche ‎conserva proprietà ECM naturale ‎prodotti che ne derivano: ‎espulsi

‎geometria ‎vantaggi ‎1° impatto delle cellule con la superficie

‎fattori di crescita intrinseci ‎appropriata chimica superficiale ‎determina la bioattività dello scaffold

‎ricellularizzazione non omogenea ‎direttamente ‎si mescolano con il polimero

‎reazioni sistema immunitario se rimozione incompleta delle componenti immunogeniche ‎svantaggi ‎caricate nello scaffold ‎mediante assorbimento

‎non riproducibile ‎compatibili con molecole bioattive ‎tramite microparticelle ‎rilascio controllato

‎creano giunzioni strette ‎es. ligandi o fattori di crescita

‎1. cellule a confluenza

‎epitelio ‎solvent casting / particulate leaching ‎1. soluzione polimerica + sale ‎2. evaporazione solvente ‎3. immersione in acqua -> scioglimento sale ‎4. struttura porosa

‎ok tessuti ad alta densità cellulare

‎endotelio ‎injection moulding / particulate leaching ‎1. polimero fuso + sale nello stampo ‎2. raffreddamento ed estrazione ‎3. scioglimento sale ‎4. struttura porosa con forma desiderata

‎2. produzione ECM ‎gas foaming ‎1. polimero fuso saturo con CO2 ‎2. depressione ‎3. formazione bolle (nuclezione) ‎4. raffreddamento -> blocco bolle

‎processo

‎PNIPAM ‎organizzato

‎piatto di coltura trattato con: ‎fiber meshes / fiber bonding ‎tecnologie di spinning ‎poi fiber bonding per aumentare le proprietà meccaniche

‎chitosano termosensibile ‎CONVENZIONALI ‎non organizzato

‎3. raccolta strato

‎30 micron ↓

‎phase separation ‎1. soluzione polimerica in un solvente appropriato ‎2. T -> separazione di fase liquido-liquido ‎3. congelamento rapido -> sistema solido a due fasi ‎4. liofilizzazione (sublimazione solvente) ‎struttura porosa

‎possiamo sovrapporli ‎FOGLIETTI CELLULARI ↑

‎freeze drying (liofilizzazione) ‎1. soluzione polimerica ‎2. congelamento ‎3. sotto vuoto ‎4. liofilizzazione ‎5. scaffold poroso ‎6. crosslinking x stabilità

‎vascolarizzazione più rapida ‎emulsion freeze-drying ‎1. soluzione polimerica + liquido immiscibile + surfactante ‎2. emulsionare -> emulsione ‎3. congelamento -> emulsione congelata bloccata ‎4. sotto vuoto ‎5. liofilizzazione

‎TECNOLOGIE DI FABBRICAZIONE

‎procedura di raccolta semplice ‎vantaggi ‎specifica forma esterna

‎obiettivo

‎trapianto senza suture ‎predefinita e riproducibile morfologia interna

‎SCAFFOLD PREFORMATI

‎no tessuti con ECM >> cellule ‎modello al PC tradotto in strati

‎svantaggi

‎interventi multipli ‎strati sottili ‎processo ‎dati inviati alla stampante

‎APPROCCI SCAFFOLD ‎NON CONVENZIONALI ‎stampa strato su strato

‎alginato ‎FDM

‎agarosio ‎polimeri naturali ‎esempi: ‎3D printing

‎chitosano ‎materiale biocompatibile ‎stereolitografia

‎PEG ‎polimeri sintetici ‎interazione cellule - materiale ‎1. sospensione cellule in soluzione polimerica ‎biocompatibilità intrinseca

‎PVA ‎elevata bioattività ‎segnali intrinseci ‎es. RGD

‎VANTAGGI

‎favorire adesione e crescita ‎basso potenziale immunogenico

‎impenetrabili alle cellule ‎buone proprietà chimiche superficiali

‎anticorpi ‎impermeabili a molecole grosse ‎difficili da processare

‎x immunoisolamento

‎antigeni ‎scarsa riproducibilità

‎O2 ‎nutrienti ‎SVANTAGGI ‎potenziali reazioni allergiche e infezioni/patologie

‎glucosio ‎scarse proprietà meccaniche

‎permeabili a:

‎metaboliti ‎POLIMERI NATURALI ‎biodegradabilità non controllabile

‎biomolecole secrete dalle cellule incapsulate ‎2. reticolazione polimero ‎proteina principale dei tessuti connettivi

‎procedura

‎1. monomero liquido ‎collagene ‎conferisce resistenza

‎pH ‎favorisce adesione, proliferazione e differenziazione

‎luce ‎2. processo di iniziazione ‎procedura ‎gelatina

‎temperatura ‎dalle alghe

‎3. formazione rete polimerica ‎auto-assemblamento ‎alginato e agarosio ‎x produzione idrogeli

‎ESEMPI

‎esposizione a ioni bivalenti (es Ca) ‎alginato ‎lenta degradazione

‎da pH basso e T bassa ‎collagene ‎esempi ‎x produzione idrogeli<