Dalla cromatografia

R R R R c

coinvolge proprio il flusso.

COSTANTE O COEFFICIENTE DI DISTRIBUZIONE

C C

M S

K = C /C

c S M

K dipende dalla natura delle fasi stazionaria e mobile e dalla temperatura,

c grandezza termodinamica

Quando parliamo di cromatografia su colonna è fondamentale parlare del coefficiente

di distribuzione. Per ciascun analita la costante di distribuzione che dipende appunto

dal singolo analita e dalle condizioni cromatografiche indica il rapporto tra la

concentrazione dell’analita nella fase stazionaria e quella nella fase mobile. quindi

diversi composti hanno diversa affinità per fase mobile e stazionaria e avranno anche

diverso coefficiente. Se vogliamo che 2 analiti diversi siano separati devono avere

coefficienti diversi. FATTORE DI RITENZIONE O DI CAPACITA’ (k) 164

Questo parametro è dato dal rapporto tra le moli dell’analita nella fase stazionaria e le

moli dell’analita nella fase mobile. importante parametro perché è correlato con il

coefficiente di distribuzione perché le moli dell’analita nella fase stazionaria sono

rappresentate dalla concentrazione dell’analita nella fase stazionaria per il volume

della fase stazionaria. Stessa cosa vale per la fase mobile. allora il fattore di capacità

sarà k = n /n

S M

k= C V /C V

S S M M

k= V /V X K

S M C

k non dipende solo da fattori termodinamici, ma anche dai volumi delle fasi presenti

nella colonna

k caratteristico di una data sostanza in una determinata colonna

Se si indica V /V =beta rapporto di fase. Il rapporto tra i due volumi si esprime come

M S

beta e il coefficiente di distribuzione per ciascun analita si può quindi ricavare da

.

questa formula: K =beta k.

C

k tiene conto del parametro V ed è un parametro facile da misurare

S

Infatti si può dimostrare che : k= t’ / t

R M

Il fattore di capacità è importante perché è fortemente correlato con il coefficiente di

distribuzione ma anche perché è facilmente misurabile perché il tempo di ritenzione e

il tempo morto li possiamo facilmente misurare dal cromatogramma.

k>1 k<10-15 165

in questa immagine possiamo osservare la separazione di A,B,C,D,E,F che sono

composti diversi che hanno un tempo di ritenzione diverso e vediamo S e cioè un picco

che corrisponde al solvente. Questo solvente molto comunemente i nostri analiti in

miscela viene iniettata in testa alla colonna e spesso in soluzione e cioè utilizzando un

solvente. Quest’ultimo è il componente più rappresentato all’interno della miscela ed è

anche quello meno ritenuto e quindi eluisce per primo. Sulla base di quello che è il

tempo di ritenzione dei diversi analiti e il tempo morto è possibile calcolare il tempo di

ritenzione corretto di ciascun analita e quindi anche il fattore di capacità di ciascun

analita. Ci sono delle indicazioni che ci dicono che valori deve avere k piccolo e cioè si

considerano valori accettabili quando sono maggiori di 1 ma non superano 15. Questi

sono numeri puri perché il rapporto è tra minuti/minuti o secondi/secondi. Dovrebbe

avere questi valori perché nel caso di A ad esempio vediamo che il suo fattore di

capacità = 0,4 che corrisponde ad un composto troppo poco ritenuto dalla fase

stazionaria e troppo velocemente eluito dalla fase mobile tant’è vero che non è bene

separato dal solvente stesso e quindi non può essere integrato per essere quantificato.

Non possiamo determinare l’area di A. Gli altri composti sono invece bene separati tra

di loro ma vediamo che all’aumentare della ritenzione e che quindi eluiscono più tardi

il picco diventa più largo e addirittura per il composto F abbiamo un picco talmente

largo che si perde quasi sulla linea di base e anche esso risulta difficile da integrare.

SELETTIVITA’

viene espressa dal cosiddetto fattore di separazione o ritenzione relativa

alfa= t’ /t’

R2 R1

ed anche alfa= k /k = K / K

2 1 c2 c1

alfa dipende dal tipo di interazioni delle sostanze con le due fasi

alfa, come Kc, non dipende dalle caratteristiche costruttive del sistema

(geometria della colonna, qualità dell’impaccamento, spessore della fase

stazionaria,..)

Buona separazione cromatografica, alfa>1, consigliabile alfa>1.2

Però la qualità di una separazione cromatografica non dipende solo dalla

selettività del sistema: due picchi, pur essendo ben distanziati, possono

essere larghi e sovrapporsi.

È importante la selettività del sistema cromatografico. Quando un sistema è selettivo

analiti diversi vengono eluiti in tempi diversi per avere la separazione di questi picchi.

Per calcolarla chiamiamo in gioco 2 analiti diversi e cioè l’analita 2 che ha un tempo di

ritenzione maggiore rispetto all’analita1. Alfa tiene conto proprio di soli 2 analiti e

anche questo è un parametro facilemente misurabile perché dobbiamo conoscere i

tempi di ritenzione dei 2 analiti.

Alfa dipende dalle caratteristiche dei singoli analiti e dal tipo di fasi scelte. 166

La selettività è necessaria ma non sufficiente per la separazione perché anche se 2

sostanze hanno diverso coefficiente di distribuzione diverso fattore di capacità e

quindi alfa maggiore di 1 possono avere dei tempi di ritenzione diversi ma i picchi

possono sovrapporsi. Quando i picchi sono larghi e si sovrappongono la risoluzione è

compromessa e ciò avviene quando il sistema ha una bassa efficienza.

EFFICIENZA: Indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le

particelle di una data specie chimica con la stessa velocità, in modo da

fornire picchi molto stretti.

Il parametro più semplice per esprimere l’efficienza è la larghezza del picco;

tale parametro dipende però anche dal tempo di ritenzione.

a)Buona selettività, ma picchi non

sono separati ma l’efficienza è

scarsa e quindi non c’è risoluzione.

b) Minore selettività, ma i picchi

sono separati ma se l’efficienza è

alta possiamo avere la risoluzione

completa.

Selettività ed efficienza sono entrambe necessarie per una buona risoluzione. Nel caso

a abbiamo una buona selettività perché il tempo di ritenzione è diverso tra i 2 analiti e

quindi abbiamo una completa risoluzione. Nella situazione b vediamo che la selettività

non è sufficiente perché A e B eluiscono con tempi piuttosto simili e quindi quando

raggiungono il rivelatore avremo dei picchi non completamente separati. Eluisce

sempre prima B di A. Dobbiamo però far riferimento all’efficienza del sistema.

Vediamo come si esprime l’efficienza di un sistema 167

Considerando per un picco cromatografico la forma ideale di una gaussiana,

l’efficienza della separazione può essere espressa dal rapporto tra la deviazione

standard della gaussiana ed il tempo di ritenzione:

s =s/t deviazione standard relativa s=sigma!!!!

r R 2 2

poiché si ottengono valori molto piccoli si considera il (rapporto) : N=(t /s) numero

R

dei piatti teorici

Abbiamo capito che l’efficienza di un sistema è dato dalla larghezza del picco e quindi

si esprime attraverso il numero dei piatti teorici. È un numero teorico ma che si può

facilmente ricavare dai picchi cromatografici. Il picco cromatografico può essere

assimilato ad una gaussiana che ha una larghezza alla base. La larghezza di questo

picco può essere misurata anche a metà altezza oppure anche ai punti di inflessione e

cioè i punti di flesso e cioè dove la curva cambia la sua forma e quindi la sua

convessità. La larghezza alla base non si misura considerando l’inizio e la fine del

picco ma tracciando le tangenti al primo punto di flesso e al secondo punto di flesso.

Tangenti che incontrano l’esse x. Questa larghezza alla base indica l’efficienza del

sistema cromatografico e si fa riferimento alla gaussiana perché sappiamo che quando

abbiamo una gaussiana la larghezza del picco alla base corrisponde a 4 volte la

deviazione standard della gaussiana. La larghezza a metà è uguale a 2,3 volte la

deviazione standard e quella al punto di flesso è uguale a 2 volte la deviazione

standard della gaussiana. Maggiore è la deviazione standard e maggiore è la larghezza

della gaussiana e quindi possiamo idealmente riferire il picco cromat. Ad una

gaussiana. La larghezza del picco che può essere ricondotta alla deviazione standard

della gaussiana è stata considerata deviazione standard relativa e cioè relativa al

tempo di ritenzione. Cioè la larghezza del picco è riferibile alla larghezza effettiva del

picco ma anche al tempo di ritenzione dell’analita che eluisce dalla colonna. Per

ciascun picco possiamo misurare questa larghezza. Poiché la larghezza di picchi non è

alta mentre i tempi di ritenzione possono essere alti il rapporto di questa equazione

risultava troppo basso e allora è stato considerato l’inverso di questo rapporto e per

avere dei valori più elevati questo rapporto è stato anche elevato al quadrato.

Abbiamo quindi ottenuto N= NUMERO DEI PIATTI TEORICI= parametro che esprime 168

l’efficienza del sistema che tiene conto della larghezza del picco e anche del tempo di

ritenzione

NUMERO DI PIATTI TEORICI (N)

Plates theory (Martin e Synge, 1941)

2

N=16(t /w ) numero di piatti teorici

R b

Altezza del piatto teorico (H or HETP)

H = altezza del piatto teorico

L = lunghezza della colonna

N = L / H Quando H diminuisce, N ed efficienza aumentano

Il numero di piatti teorici è un numero puro che si misura per ciascun singolo picco e si

misura facilmente perché per un dato picco io conosco il tempo di ritenzione e posso

anche misurare la larghezza alla base. Affinchè il sistema sia efficiente N deve essere

elevato e quindi un elevato numero di piatti teorici corrisponde ad alta efficienza del

sistema cromatografico e ad un picco stretto.

come vediamo dall’immagine sopra possiamo visualizzare tante sezioni della colonna

che corrispondono ai piatti teorici e il piatto teorico è quella minima sezione della

colonna dove avvengono le ripartizioni degli analiti tra la fase stazionaria e la fase

mobile. maggiore è il numero di queste sezioni che sono proprio i piatti maggiore è la

ripartizione e maggiore è la possibilità di avere picchi stretti e alta efficienza. È

importante tenere presente il numero di piatti teorici che è fortemente correlato con

169

l’altezza del piatto teorico. Se l&