Dal tessuto nervoso alle colture cellulari

‎LABORATORIO

‎1. 2. 3. = wet ‎EN ISO 14644-1

‎dry ‎qtà max di particelle con diametri differenti (0,1 - 5 um) ammesse per m^3 di aria campionata

‎metodi

‎4. si fa asciugare ‎diam > o = 0.5 um

‎1. si mette collagene o matrigel sulla superficie ‎max 3520 particelle/m^3

‎classificazione livello di pulizia

‎strato sottile gelatinoso su cui si semina ‎2. si aspetta che gelifichi ‎gel ‎attraversato da una massa d'aria a 0.45 m/s

‎x differenziamento ‎unidirezionale

‎classe ISO 5

‎ipotermia + sopportata ‎37° ‎creazione flusso laminare sterile ‎no turbolenze

‎controllo preciso temperatura

‎valutazione efficienza di un enzima mitocondriale ‎mantenuto laminare dal piano di lavoro forellinato ‎in microbiologia invece è chiuso VS contaminazioni

‎CAPPE ‎proteggono da contaminazioni:

‎prove x misurare l'influenza di T sullo sviluppo cellulare

‎" qtà di proteine sintetizzate ‎NO setaccio

‎intercettamento ‎adesione alle fibre

‎7.2 ± 0.2 ‎garantita dal filtro assoluto HEPA

‎controllo pH ‎diam > 0.4 um si incastrano

‎acidificazione ‎diam < um ‎occlusione

‎metabolismo produce ioni H+ ↑

‎ velocità flusso

‎acido carbonico/bicarbonato ‎foglio sottile di fibre di vetro ‎intrecciate casualmente ‎trattengono 99.999% di particelle con diam = 0.3 um ‎favorito da:

‎sistema tampone ↓

‎ spazi tra le fibre

‎efficace grazie a CO2 ‎costituito da: ‎spazio tra le fibre > 0.3 um ‎

d

iam < 0.1 um ostacolate da molecole gassose,

‎pCO2 = 5% = pCO2 cellulare ‎telaio in alluminio o legno ‎poi bloccate con intercettamento e occlusione

‎diffusione

‎regolazione precisa CO2 ‎funzioni

↓

‎deve essere subito ristabilita ‎ CO2 quando si apre e chiude l'incubatore ‎densità fibre

↑

‎ pressione osmotica ‎importanti ‎diametro fibre

‎VS evaporazione acqua nei terreni di coltura ‎RH > 98% ‎biologiche

‎piastre a 96 pozzetti sono le più sensibili ‎disidratazione ‎spessore filtro

‎rischio biofilm ‎evitare condensazione ‎mantenimento grado di umidità (RH) ‎protezione prodotto

‎INCUBATORE A CO2

‎evapora con T ‎aria sterile // piano di lavoro

‎garantito da vaschetta con acqua sterile ‎ORIZZONTALE

‎+ agente antimicrobico ‎prefiltri

‎aria esterna aspirata dal basso

‎protezione da contaminazioni ‎filtro HEPA

‎recupero veloce dei parametri impostati ‎prodotto

‎protezione

‎x mantenere RH ‎caratteristiche ‎operatore

‎x limitare consumo di CO2 ‎aria sterile piano di lavoro

‎camera ermeticamente chiusa ⟂

‎VERTICALE

‎x conferire autonomia in caso di blackout ‎reintegrata con aria aspirata frontalmente ‎barriera x operatore

‎30% espulsa

‎stabilità dell'aria VS contaminazioni ‎rischio x ambiente

‎aria aspirata dal basso ‎70% al filtro HEPA

‎aria aspirata frontalmente ‎protezione operatore

‎classe 1 ‎investe il piano di lavoro // ‎no protezione prodotto

‎cappe biologiche con filtrazione a flusso laminare ‎passa da HEPA e viene espulsa fuori ‎protezione ambiente

‎= flusso verticale

‎classe 2

‎CONTRO IL RISCHIO BIOLOGICO ‎filtro HEPA in uscita ‎protezione ambiente

‎completamente sigillate ‎x materiale altamente patogeno

‎aria entra attraverso un HEPA ‎protezione prodotto

‎classe 3 ‎esce attraverso uno o due HEPA ‎protezione ambiente

‎operatore usa guanti a manicotto ‎protezione operatore

‎struttura portante, pareti e camera di lavoro ‎acciaio inox ‎facile sterilizzazione

‎vetro

‎caratteristiche costruttive ‎schermo frontale ‎resistente a UV ‎x sterilizzazione

‎rimosso quando si lavora

‎lampada germicida UV

‎> sopravvivenza

‎> proliferazione ‎< specializzazione ‎embrionale

‎potrebbero non esprimere caratteri di interesse

‎es. linea 3T3 (mesodermali di topo) ‎tipo tessuto

‎maggior parte in fase G0

‎non facilmente disgregabile ‎ECM più strutturata

‎meno semplice isolarle dal tessuto ‎adulto

‎conservano le caratteristiche che hanno in vivo

‎durata di vita limitata

‎isolamento complesso ‎problemi: ‎cellule isolate da un espianto

‎contaminazione con altre cellule ‎popolazione eterogenea

‎frammento tissutale in fiasca ‎BREVE TERMINE ‎n° replicazioni ridotto

‎migrazione cellule sulla superficie ‎DURATA ‎vita illimitata con IMMORTALIZZAZIONE

‎1. ‎LUNGO TERMINE ‎tante replicazioni prima di morire

‎coltura secondaria (linea cellulare) ‎confluenza --> trasferimento in una nuova fiasca ‎formazione adesioni focali 

‎eventualmente frammento in una nuova fiasca (se non erano migrate tutte le cellule) ‎appiattite ‎crescono e proliferano

‎procedura da frammento tissutale a cellule

‎trattamento enzimatico tripsina/EDTA ‎adesione ad un substrato ‎cambio di forma

‎1. COLTURA PRIMARIA ‎substrato non idoneo

‎inibitore x bloccare la digestione enzimatica ‎tondeggianti

‎MONOSTRATO ‎porta alla morte

‎centrifuga e risospensione ‎2. ‎ADESIONE ‎inibizione da contatto ‎NO nelle cellule trasformate = mutazione di alcuni geni 

‎CLASSIFICAZIONE

‎controllo vitalità cellulare ‎SOSPENSIONE ‎es. cellule del sangue

‎semina in piastra ‎x popolazioni omogenee

‎tempo di raddoppio lento ‎CLONALI ‎1. diluizione cellule

‎confluenza --> passaggio --> subcoltura (= coltura secondaria = linea cellulare) ‎procedura ‎2. isolamento di 1 cellula

‎maggior velocità di crescità ‎3. creazione colonia

‎senescenza replicativa ‎limite di Hayflick ‎coltivazione cellule di tipo diverso

‎crescita in monostrato ‎CO-COLTURE

‎a vita finita ‎es. osteoblasti + endoteliali ‎x vascolarizzazione

‎inibizione da contatto ‎2. LINEA CELLULARE PRIMARIA

‎forte dipendenza dai fattori di crescita del siero ‎Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-

‎1. gene esogeno che codifica per la subunità catalitica della telomerasi ‎sali inorganici ‎x funzioni cellulari

‎IMMORTALIZZAZIONE ‎colture primarie/linee cellulari mutate

i

‎

nnescano meccanismi di trasformazione simili a quelli ‎[NaCl] <=> pCO2 incubatore

‎che determinano la proliferazione tumorale ‎2. oncogeni derivati da virus tumorali ‎divise in: ‎terreno base ‎glucosio ‎x fabbisogno energetico

‎si ottengono da:

‎es. SV40 ‎EVOLUZIONE LINEA CELLULARE ‎AA essenziali ‎x sintesi proteica

‎tumori ‎vitamine ‎x funzioni cellulari

‎proliferazione incontrollata ‎tampone

‎< substrato-dipendenza ‎vantaggi ‎favorisce adesione

‎< inibizione da contatto ‎caratteristiche ‎continue ‎fornisce nutrienti e fattori di crescita

‎< dipendenza da fattori di crescita del siero ‎verso terreni serum free

‎siero fetale bovino ‎possibili agenti infettivi ‎es. encefalite spongiforme bovina

‎non esprimono più alcuni geni (espressi in vivo) ‎composizione ‎svantaggi ‎problemi etici

‎fibroblasti di topo ‎10 - 20% in volume

‎crescita illimitata ‎3T3 ‎penicillina ‎inibisce sintesi della parete batterica

‎elevata inibizione da contatto ‎antibiotici ‎streptomicina ‎blocca la sintesi proteica

‎da carcinoma della cervice uterina ‎esempi

‎tumorali immortalizzate ‎funghicidi

‎VS accorciamento telomeri ‎telomerasi attiva ‎indicatore pH

‎vita + lunga anche senza terreno di coltura ‎Hela ‎rosso ‎pH 7.2 - 7.4 normale

‎4 copie in più del cromosoma 12 ‎diversa composizione cromosomica ‎+ resistenti delle tumorali

‎x mutazione indotta da papillomavirus ‎rosso fenolo ‎colori ‎arancio-giallo ‎pH acido

‎3 copie in più dei cromosomi 6, 8, 17 ‎viola ‎pH basico

‎"nuova specie" ‎non si mette se vanno fatti test colorimetrici

‎invecchiamento --> tempi di raddoppio più lunghi ‎3 LINEA CELLULARE SECONDARIA ‎4° C

‎no crescita ‎colore ‎rosso

‎mantenimento ‎poi portato a 37° C per l'utilizzo ‎valutare:

‎fase di latenza ‎1. fase lag ‎TERRENI DI COLTURA

‎dopo passaggio ‎chiarezza ‎NO torbido

‎processo di adattamento

‎dipende da quanto sono state congelate ‎dopo congelamento ‎composizione va mantenuta costante ‎scorta di siero x evitare l'utilizzo di diversi lotti

‎COLTURE CELLULARI

‎crescita esponenziale ‎2. fase log ‎dimensioni fiasca

‎nutrienti che scarseggiano ‎CINETICA DI CRESCITA ‎dipende da ‎25% ‎1 ml per 5 cm^2

‎dovuta a ‎3. decelerazione

‎accumulo metaboliti ‎grado di confluenza ‎25 - 40% ‎1,5 ml per 5 cm^2

‎aggiunta terreno

‎plateau ‎> 45 % ‎2 ml per 5 cm^2

‎4. fase stazionaria

‎motivi della decelerazione ‎nessun incremento nella crescita ‎

n

o contatto diretto con cellule

‎accortezza ‎pipettando lateralmente o sulla superficie opposta ‎VS danneggiamento o distacco

‎se non si interviene ‎5. fase di declino ‎ogni 2 - 3 giorni

‎cambio terreno ‎cellule 90% a confluenza ‎passaggio

‎manico di PS ‎scraper (spatola) ‎empirica

‎morbida ‎lama di PE ‎raccolta meccanica ‎li testiamo tutti

‎non adatta a tutte le cellule ‎se ce n'è più di uno ‎crescita

‎dopo vanno testate vitalità e crescita ‎scelta terreno ‎valutiamo ‎espressione proprietà di interesse

‎cellula-cellula ‎enzima che distrugge le connessioni proteiche ‎tipologia di cellule

‎cellula-substrato ‎tripsina ‎ADERENTI ‎dipende da: ‎differenziamento

‎poi rapidamente a +37° con bagnetto ‎conservata a -20° ‎soluzione di tripsina/EDTA ‎funzioni cellulari di interesse ‎proliferazione

‎chelante del calcio ‎EDTA

 ‎ecc.

‎1. si aspira il terreno dalla fiasca

‎inattiva la tripsina ‎x rimozione siero ‎2. 2-3 lavaggi con PBS ‎" enzimatica ‎troppo tempo x confluenza

‎3. si aggiunge la soluzione di tripsina/EDTA e si agita ‎troppo bassa ‎sofferenza

‎4. incubazione 2-5 min a 37° ‎confluenza troppo rapida

‎RACCOLTA CELLULE

‎forma tondeggiante ‎troppo alta

‎5. controllo periodico distaccamento cellule ‎tripsina può