Spiegazione tecnica PCR

Come funziona una reazione di PCR

Si devono effettuare tre passaggi (la denaturazione, l'annealing ed estensione). Nella denaturazione si formano le eliche a singolo filamento di DNA stampo. Nell'annealing, l'elica forma un dimero con il primer. Di solito, tutte e tre le fasi si fanno a temperature diverse. Se le ultime due fasi avvengono a temperature simili, si uniscono e invece di fare tre passaggi se ne fanno due.

Dopo l'ultimo ciclo di amplificazione (denaturazione, annealing, estensione), si continua a mantenere la temperatura al valore ottimale per la DNA polimerasi (fase di estensione) per avere la completa amplificazione, sintesi di tutte le eliche che si sono prodotte nei vari passaggi di amplificazione. Questo per avere molecole a doppio filamento della stessa dimensione che è l'obiettivo centrale del processo di reazione della PCR.

Quindi, una reazione di PCR funziona ripetendo in modo ciclico una serie di passaggi che sono: denaturazione iniziale, annealing e estensione.

eliminare anche vari contaminanti prima di fare quelle serie ripetute di denaturazione, annealing e estensione e alla fine dell'ultimo ciclo di denaturazione si prolunga la fase di estensione per un certo tempo in modo tale da avere la sintesi completa dell'elica complementare di tutti i diversi frammenti).

Es se si lavora con enzimi come la Q5 dopo 30 cicli si avrà il 98,8% di molecole con dimensione e sequenza corretta; Se invece si usa la classica TAQ DNA polimerasi si avrà solo il 4,7% di prodotti di amplificazione che avranno la sequenza originale corretta, dove il 95% di molecole avrà la dimensione corretta ma non avrà la stessa sequenza della molecola iniziale, questo perché i due enzimi hanno una % di errore molto diversa tra di loro.

Nella selezione dell'enzima si può anche considerare altri parametri collegati per esempio al tipo di reazione che si vuole portare avanti uno dove si usa all'inizio una molecola di DNA, una

molecola di RNA da trascrivere, per poi essere amplificata, si deve fare una reazione quantitativa, e costruire una libreria di amplificazioni perché si sta sequenziando un genoma. I fattori che possono influenzare la PCR: Tenendo in considerazione che sono diversi, i fattori che possono influenzare l'enzima sono la possibilità di ottimizzare il processo es inibitori, cosa succede se il primer ha delle regioni invertite, e cosa mettere nel tampone di reazione per cercare di limitare alcune di queste sostanze. I principali fattori e soluzioni: tra le soluzioni per esempio c'è quella di purificare il DNA allontanando sostanze che possono interferire con la reazione enzimatica. Come allestire una reazione di PCR: Scelta dell'enzima, dei primers, calcolare la temperatura di annealing (in modo corretto per amplificare in modo corretto il protocollo di amplificazione) avere un'idea precisa del contenuto di GC (una scarsa o parziale denaturazione può dare scarsa resa).

amplificazione) e usare delle corrette procedure digestione dei campioni( es assemblare le reazioni in ghiaccioe trasferire questa reazione assemblata, nel termociclatoregià settato alla temperatura di denaturazione).Di solito la scelta dei primer avviene con l'utilizzo sisoftware specifici. Un punto importante nel 5 video è che latemperatura di annealing, dipende da più parametri oltrealla temperatura di Mealting dei primer sono anche lacomposizione del tampone usato per la reazione diamplificazione e anche il tipo di enzima usato per lareazione di amplificazione. Nella parte terminale del videosi segnalava due scenari uno nel quale si usava n enzima Aun altro dove si usava un enzima B, e la temperatura diannealing, era diversa nei due contesti.Le caratteristiche dei primers per la PCR sono: circondare ilsegmento di interesse (inizio e fine), avere una temperaturadi mealting comparabile ( massimo più o meno 3° didifferenza), avere una

composizione in G+C simile, non avere regioni di complementarietà (che non danno dimeri primers). La temperatura di melting si calcola in base alla tipologia di enzima scelto, la concentrazione e la sequenza dei primers. Tra i tipi di PCR c'è né una che quantifica il prodotto che si ottiene, la quale dà una misura di quante copie, della