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PARTE 2: RELAZIONE FILMATI YOUTUBE
CITOLOGIA 12 – MICROSCOPIO
Per osservare e analizzare le cellule, è indispensabile utilizzare un microscopio, poiché sono
incredibilmente minuscole, hanno una misura dell'ordine dei micron e quindi sono invisibili a occhio
nudo. Esistono due categorie principali di microscopi utilizzati nel campo della citologia: microscopi
ottici e microscopi elettronici.
Utilizzando una sofisticata disposizione di lenti e un flusso di fotoni emessi da una sorgente luminosa,
il microscopio ottico è in grado di ingrandire il campione fino a un massimo di circa 2000 volte.
Mantiene un ottimo livello di chiarezza fino a 200 nm. Le immagini risultanti presentano tonalità
vibranti che dipendono dalla colorazione specifica utilizzata durante il processo di preparazione del
vetrino. Grazie alla sua efficacia, il microscopio ottico è ampiamente utilizzato nell'esame di vari tipi
di tessuti.
Utilizzando un fascio di elettroni, il microscopio elettronico ha la capacità di amplificare gli oggetti di
un fattore di 200.000, pur mantenendo un impressionante potere di risoluzione di 0,1 nm. Esistono
due diversi tipi di microscopi elettronici: a trasmissione (TEM), che cattura immagini bidimensionali,
e a scansione (SEM), che cattura immagini tridimensionali. Mentre le immagini prodotte dal
microscopio elettronico sono tipicamente monocromatiche, il SEM ha la capacità di introdurre il
colore per le ricostruzioni generate al computer.
Istologia 01 – NOZIONI DI MICROSCOPIA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Studiare tessuti e cellule ad occhio nudo è un compito impossibile a causa della risoluzione limitata
dell'occhio umano, che è di soli 0,2 mm. Per superare questa limitazione diventa fondamentale l’uso
del microscopio. Sono disponibili diversi tipi di microscopia per questo scopo, tra cui la microscopia
ottica, a contrasto di fase, a fluorescenza, confocale, elettronica, a forza atomica, in campo oscuro e
a luce polarizzata.
Lo studio dei tessuti, noto come istologia, utilizza il microscopio ottico. Questo microscopio è
costituito da due componenti principali: una parte meccanica e una parte ottica. All'interno della
parte ottica ci sono gli oculari, la lente dell'obiettivo e il condensatore.
L'ingrandimento iniziale e l'osservazione sono resi possibili dagli oculari, costituiti da lenti. Inoltre, in
un microscopio ottico, in genere sono presenti 3-4 obiettivi. L'ingrandimento complessivo si ottiene
moltiplicando il potere di ingrandimento degli oculari con quello dell'obiettivo. Sotto il tavolo di
preparazione, dove è posizionato il vetrino, è posizionato il condensatore. Il suo scopo è quello di
condensare la luce emessa dalla sorgente luminosa della lampada.
Per esaminare correttamente un campione, è necessario effettuare una preparazione. Ciò include
una serie di passaggi, tra cui fissazione, rimozione della disidratazione, inclusione, sezionamento e
colorazione.
Durante la fase di fissazione l'obiettivo è quello di immobilizzare e salvaguardare tutti gli elementi del
campione che verrà sottoposto ad esame. Ciò può essere ottenuto tramite mezzi chimici, come
l’utilizzo di alcol o aldeidi, o tramite metodi fisici, come l’utilizzo di azoto liquido. Nei casi in cui viene
utilizzata la fissazione fisica, il campione procederà direttamente alla fase di sezionamento,
bypassando le fasi di essiccamento, pulizia e inclusione.
Per avviare la fase di disidratazione, il campione viene immerso in soluzioni di alcol etilico di varia
intensità. Questo passaggio rimuove efficacemente l'umidità dal campione, creando spazio per la
successiva aggiunta di paraffina e rendendo il tessuto più compatto, semplificando così il processo di
taglio.
La fase iniziale del processo prevede la disidratazione del campione, dopodiché viene immerso in
xilene per ottenere la trasparenza. Questo solvente dissolve efficacemente l'etanolo e solubilizza i
lipidi. Nella fase successiva il campione viene immerso in una sostanza dalla consistenza adeguata al
taglio. Questa sostanza può essere liquida ad alte temperature o solida a basse temperature.
Tipicamente, paraffina fusa e resina epossidica sono le sostanze impiegate durante la fase di
inclusione.
La fase di sezionamento è fondamentale per ottenere sezioni visibili al microscopio dello s pessore
adeguato. La procedura varia a seconda della natura del campione.
Per preparare il campione istologico per la fissazione chimica, è necessario tagliarlo con cura per
ottenere uno spessore ottimale di 3-10 µm. Questo processo di taglio viene eseguito utilizzando un
meccanismo automatico in un microtomo.
Per preparare le fette alla colorazione, queste subiscono un processo di immersione in xilene per
eliminare la paraffina e vengono successivamente reidratate utilizzando una serie di concentrazioni
decrescenti di alcol etilico. Infine, il campione viene immerso in acqua distillata. La fase di
reidratazione è fondamentale per il processo di colorazione, poiché i coloranti utilizzati sono idrofili.
Per il sezionamento viene utilizzato un microtomo criostato. Le sezioni risultanti vengono quindi
posizionate con cura su vetrini preraffreddati e lasciate raggiungere la temperatura ambiente prima
di iniziare la colorazione.
La capacità di discernere e separare due punti è nota come potere risolutivo. All’aumentare della
risoluzione del microscopio, aumenta anche l’ingrandimento, migliorando la nostra acuità visiva.
Usiamo il display di uno smartphone come esempio per approfondire l'idea del potere di risoluzione.
Lo schermo è costituito da numerosi pixel e all'interno di ciascun pixel sono presenti tre sottopixel:
rosso, verde e blu. Regolando l'intensità e la combinazione di questi sub-pixel siamo in grado di
percepire un'ampia gamma di colori. Ciò è dovuto al fatto che i nostri occhi non sono in grado di
distinguere ogni singolo sub-pixel. Infatti il potere risolutivo dell'occhio umano è misurato a 0,2mm.
–
Istologia 02 COLORAZIONI ISTOLOGICHE
La fase finale della preparazione del campione, che consente l'osservazione, è il processo
fondamentale. In questo processo si utilizzano tre tecniche di colorazione essenziali: istologica,
istochimica e immunoistochimica.
L'utilizzo della colorazione istologica ci consente di enfatizzare le caratteristiche dei tessuti ed
esaminarne la composizione. Questa tecnica impiega una varietà di coloranti, comprese le opzioni
bicromiche, tricromiche e elettive.
• Il metodo di colorazione noto come Azan-Mallory utilizza una combinazione di azocarminio e
miscela policroma di Mallory, composta da blu di anilina, arancio G e acido ossalico. Questa tecnica
di colorazione produce una colorazione rossa nei nuclei, nella cromatina e negli eritrociti, mentre il
citoplasma appare con una leggera tonalità rosa. Il collagene e le fibre reticolari presentano una
tonalità blu intenso, mentre le mucine e il mucinogeno sono colorati in blu. Le cellule del sangue e le
fibre muscolari, invece, assumono un colore arancione.
• La tecnica con ematossilina-eosina prevede l'utilizzo di due coloranti: l'ematossilina, un colorante
basico che colora le sostanze acidofile, e l'eosina, colorante acido che colora le sostanze basofile.
Questa colorazione fa sì che il nucleo appaia di colore blu-viola, mentre il citoplasma assume una
tonalità rosa-arancio.
• La colorazione Gomori è una colorazione che utilizza un colorante a base di argento per colorare le
fibre reticolari, ottenendo una tonalità nera su uno sfondo grigio-giallo.
• Per la colorazione del tessuto adiposo vengono utilizzate le colorazioni Sudan III, che appare giallo,
e Sudan Black, che appare nero. Queste colorazioni vengono applicate specificamente ai campioni
che sono stati sezionati utilizzando un microtomo criostato, poiché il processo di fissazione fisica
impedisce la dissoluzione dei lipidi.
• La colorazione elettiva nota come colorazione di Nissl viene utilizzata per colorare la regione
tigroidea di Nissl. Questo processo prevede l'uso del blu di toluidina, che conferisce una tonalità blu.
La tecnica di colorazione Golgi-Cajal è utilizzata in modo specifico per il sistema nervoso centrale. Per
eseguire questa colorazione, piccole sezioni fresche del sistema nervoso centrale vengono immerse
in una soluzione bicromica di osmio ad una temperatura di 25°C per un periodo di 1-6 giorni.
Successivamente, le sezioni vengono trattate con una soluzione di nitrato d'argento all'1% in acqua,
che può impiegare fino a tre giorni per reagire. Una volta completato il processo di colorazione, le
sezioni vengono incluse nella paraffina e vengono tagliate fette spesse. Ottenere una colorazione
efficace con questa tecnica può essere impegnativo e spesso presenta difficoltà irrisolvibili. Tuttavia,
quando la colorazione ha esito positivo, si riscontra la presenza di cellule nervose nero intenso su uno
sfondo color tabacco.
• Colorazione con May-Grunwald-Giemsa: utilizzata esclusivamente per campioni di sangue. Il sangue
viene posto su di un vetrino, che viene poi lasciato asciugare all'aria aperta per una durata di 30
minuti. Successivamente il vetrino viene sottoposto alla miscela May-Grunwald, costituita da una
combinazione di blu di metilene ed eosina. Dopo il risciacquo, il vetrino viene colorato con Giemsa,
un composto di blu di metile, eosina, blu A e B, e viola di metilene. Di conseguenza, i globuli rossi
assumono una tonalità rosa-arancio, mentre i nuclei dei leucociti appaiono blu.
La colorazione istochimica può rivelare le proprietà chimiche di un tessuto. Una di queste tecniche di
colorazione è la reazione PAS, che identifica in modo specifico le mucine neutre presenti negli epiteli
secernenti e nelle ghiandole endocrine. Questa reazione prevede l'uso di acido periodico che rilascia
i gruppi aldeici delle mucine, che vengono poi colorate di un colore rosso porpora vivo dal reagente
Shiff.
La procedura abituale per questa reazione prevede l'uso del blu Alcian, noto per la sua capacità di
colorare mucine acide e glicosaminoglicani.
Il processo di colorazione immunoistochimica si basa sull'interazione tra antigeni e anticorpi. Per
facilitare la colorazione gli anticorpi vengono trattati con un cromogeno. Eccitando l'anticorpo con un
laser, il cromogeno diventa visibile, consentendo l’osservazione della reazione.
L'atto di creare una fetta comporta la trasformazione di un oggetto tridimensionale in una
rappresentazione bidimensionale. Queste fette possono assumere diversi orientamenti, tra cui
trasversale, obliquo e longitudinale.
PARTE 3 – ANALISI COMPARATIVA DI DUE VERTEBRATI
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