Report tecnico scientifico Microbiologia applicata

Figura 7. Piastra NA coltivata con P. putida mediante isolamento in coltura pura

3.3 Risultati isolamento in coltura pura di un microrganismo di suolo

Figura 8. Piastra NA con coltura pura Figura 9. Piastra RB con coltura pura

Come per l’analisi precedente, anche in questo caso, è possibile notare l’assenza di

contaminanti (altre specie) nelle piastre di NA (figura 8.) e RB (figura 9.), indice della

buona riuscita della prova. La piastra di NA presenta anche delle colonie singole ben

distinguibili nella porzione di striscio più blando, a differenza della piastra di RB che

presenta una crescita piuttosto confluente e densa.

3.4 Risultati della caratterizzazione fenotipica di un isolato di P. putida

3.4.1 Valutazione attività amilasica

Figura 10. Piastra Agar Amido per la valutazione dell’attività amilasica

Dopo il periodo di incubazione è possibile constatare che P. putida è sicuramente in

grado di crescere su AA (figura 10.) ed è amilasi positiva, in quanto il Lugol rimane

della sua colorazione giallastra e non vira alla colorazione bluastra, sintomo della

degradazione dell’amido da parte del microrganismo.

3.4.2 Valutazione attività proteolitica

Figura 11. Piastra Agar Latte per la valutazione dell’attività proteolitica

Dopo il periodo di incubazione è possibile constatare che P. putida è in grado di

crescere su Agar Latte (figura 11.) ed ha anche attività proteolitica, non molto marcata,

in quanto è possibile notare un illimpidimento attorno alle colonie.

3.4.3 Valutazione attività catalasica

Figura 12. Piastra AL per la valutazione dell’attività catalasica

Il test della catalasi per P. putida è risultato positivo, in quanto, a seguito dell’aggiunta

di acqua ossigenata sulla piastra Agar Latte, è avvenuta la reazione di degradazione

dell’acqua ossigenata, con la produzione di ossigeno e acqua (formazione di bolle in

superficie, figura 12.).

Il risultato era prevedibile in quanto P. putida è un isolato ambientale aerobio. La

tabella 4. sintetizza i risultati della caratterizzazione fenotipica.

Tabella 4: risultati finali della caratterizzazione fenotipica di P. putida

Attività amilasica Attività proteolitica Attività catalasica

Pseudomonas putida + + o - +

3.5 Risultati prova di fermentazione di un isolato di suolo

Figura 13. Tubi dopo l’inoculo e l’eventuale fermentazione

Nel campione di terra sono presenti moltissimi batteri; risulta difficile prevedere che

caratteristiche possa avere l’isolato selezionato.

Di seguito sono riportati i risultati ottenuti dalla prova di fermentazione (figura 13.):

• Controllo negativo (-): il terreno presenta un leggero intorbidimento, il che

indica che c’è stata una crescita del microrganismo; non si riscontra nessun

viraggio di colore del terreno.

• Tubo galattosio (GA): il terreno presenta intorbidimento, sintomo di crescita

del microrganismo; inoltre è evidente un viraggio di colore verso un

arancione scuro, che indica l’avvenuta acidificazione (produzione di acidi).

• Tubo lattosio (L): il terreno risulta intorbidito, ma non si nota viraggio di

colore dovuto ad acidificazione.

• Tubo glucosio (G): il terreno presenta intorbidimento, ad indicare l’avvenuta

crescita microbica ed una acidificazione più marcata rispetto a quella

avvenuta nel terreno contenente galattosio.

Tabella 5: risultati prova di fermentazione di un isolato di suolo

Controllo - GA 1% p/v L 1% p/v G 1% p/v

Crescita + + + +

Acidificazione - + - +

In virtù dei risultati ottenuti (tabella 5.) non è possibile constatare che la crescita del

microrganismo sia avvenuta grazie alle fonti di carbonio presenti, in quanto si è

riscontrato intorbidimento anche nel controllo negativo (senza fonti di C). A livello

qualitativo, infatti, la crescita pare la medesima in tutti tubi; per capire in quale è

avvenuta la maggiore crescita si possono utilizzare metodi come la citometria a

flusso o le diluizioni e piastramento. Si può dire però che il microrganismo isolato è

in grado di fermentare fonti di carbonio come galattosio e soprattutto glucosio

(viraggio più marcato).

3.6 Risultati della colorazione di Gram – Pseudomonas putida

Figura 14. Visualizzazione al microscopio ottico P. putida (Gram -)

Pseudomonas putida assume una colorazione rosa/fucsia (visibile in figura 14.)

dovuta alla tipologia di parete tipica dei Gram –; è possibile notare la morfologia a

bastoncello di P. putida.

MICROBIOLOGIA INDUSTRIALE, prof.ssa Rollini

1. Introduzione

Il laboratorio con la prof.ssa Rollini ha permesso di comprendere i processi

dell’allestimento in beuta di colture di microrganismi rilevanti nel settore alimentare.

Per l’attività sono stati assegnati, ad ogni studente, tre microrganismi, da inoculare in

differenti terreni.

Nel mio caso i microrganismi presi in analisi sono stati:

Saccharomyces cerevisiae è un lievito caratterizzato dalla possibilità di svolgere un

doppio metabolismo. In condizioni di aerobiosi attua il metabolismo respirativo che

porta alla produzione di biomassa (crescita, senza fermentazione), ottenuta grazie

alla coltura sommersa, in agitazione con frangiflutto, con tappo disteso per favorire il

massimo contatto con aria e con poco glucosio aggiunto al terreno; si sviluppano

torbidità e note aromatiche poco gradevoli dovute ai metaboliti del ciclo di Krebs. In

condizioni di anaerobiosi, ottenute con coltura stazionaria in alto strato, tappo ben

inserito e terreno contenente un maggiore quantitativo di glucosio, si ottiene il

metabolismo fermentativo di questo lievito; si sviluppa sul fondo una patina di

biomassa, in superficie una schiuma e a livello aromatico vengono evocate

sensazioni tipiche dei prodotti fermentati come la birra (avvenuta la fermentazione

alcolica, con produzione di CO ed etanolo). Può essere coltivato anche mediante

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una coltura stazionaria in basso strato, che favorisce il metabolismo respiratorio.

Penicillium crhysogenum è una muffa con struttura ifale sottile ed uno sviluppo

lento; è un microrganismo utilizzato molto nella produzione di formaggi erborinati.

Può essere coltivata con coltura sommersa o con coltura stazionaria in basso strato.

Aspergillus niger è una muffa distinguibile dalla tipica pigmentazione nera dei conidi

ifali su cui sono agganciate le spore. È molto sfruttata per la produzione di acido

citrico o per la produzione di enzimi (amilasi e cellulasi). Può essere coltivata con

coltura sommersa, stazionaria in basso strato o semisolida (con terreno Tn + crusca).

2. Materiali e metodi

2.1 Allestimento di colture liquide in beuta

Per l’allestimento di colture liquide in beuta (contenitore cilindro-conico) si parte

prelevando 5 mL di soluzione fisiologica e depositandola sullo slant (terreno

inclinato sul quale è presente il microrganismo); con la punta della pipetta si può

procedere grattando la superficie dello slant per portare in sospensione il

microrganismo, fino a quando si noterà un certo livello di torbidità della soluzione

fisiologica. A questo punto si può prelevare il microrganismo dallo slant mediante

pipetta da 10 mL con propipetta che permette il rilascio e l’inoculo nella beuta

(chiusa con tappo in garza).

Per Saccharomyces cerevisiae la coltura scelta è di tipo sommerso (aerobia) in

agitazione, con terreno TN + 10 g/L di glucosio e con frangiflutto, una rientranza del

vetro nella beuta che rompe il vortice e favorisce gli scambi di ossigeno per i

microrganismi aerobi. La beuta viene poi chiusa con tappo disteso.

Per Penicillium chrysogenum la coltura scelta è di tipo sommerso (aerobia) in

agitazione, con terreno TN e con frangiflutto. La beuta viene chiusa con tappo

disteso.

Per Aspergillus niger la coltura scelta è di tipo sommerso (aerobia) in agitazione, con

terreno TN e con frangiflutto. La beuta viene chiusa con tappo disteso.

Il terreno TN utilizzato per tutte le colture è un terreno minerale.

Una volta chiuse le beute con frangiflutto sono state incubate a 25°C, agganciate ad

un agitatore con 4 cm di corsa a sinistra e a destra e con 40 colpi/minuto.

3. Risultati e Discussione

3.1 Risultati allestimento di colture liquide in beuta

Figura 15. Beuta TN con Saccharomyces cerevisiae dopo inoculo ed incubazione

Saccharomyces cerevisiae è stato coltivato in coltura sommersa, in agitazione, con

bassa concentrazione di glucosio nel terreno (10 g/L). Questo tipo di coltura (figura

15.) ha favorito il metabolismo respiratorio del lievito dovuto alla grande presenza di

ossigeno; sono quindi avvenute reazioni di glicolisi, ciclo di Krebs e catena di

trasporto degli elettroni. Visivamente si nota l’intorbidimento e a livello aromatico,

molecole volatili meno gradevoli di quelle che si sviluppano per meccanismo

fermentativo. Il microrganismo si è sviluppato ed è cresciuto, senza però fermentare.

Figure 16 e 17. Beuta TN con P. chrysogenum dopo inoculo ed incubazione

P. chrysogenum è stato coltivato in coltura sommersa, in agitazione (figure 16 e 17.).

Si notano dei pallet (anche se in misura minore di A. niger), che sono delle strutture

sferiche all’interno della coltura, costituite da micelio non sporificato, che si creano

in funzione del riavvolgimento delle ife su loro stesse. È evidente in misura

maggiore, la presenza di un micelio lasso in cui le ife si ripiegano poco su loro stesse

e si rompono più facilmente. Come detto in precedenza, questo microrganismo è

sfruttato per la produzione di formaggi erborinati, a crosta fiorita.

Figure 18 e 19. Beuta TN con A. niger dopo inoculo ed incubazione, pallet visibili

A. niger è stato coltivato in coltura sommersa, in agitazione. È ben visibile, ed in

misura maggiore rispetto a quanto successo per P. chrysogenum, la formazione di

pallet (figure 18 e 19.). Si nota anche l’adesione di ife al vetro della beuta che

riescono a sporificare (crescita parietale) e dare la tipica colorazione nera dei conidi

ifali. A. niger è un microrganismo utilizzato nella produzione di acido citrico ed

enzimi.

MICROBIOLOGIA ALIMENTARE, prof. Russo

1. Introduzione

Il laboratorio guidato dal professor Russo ha permesso di fare pratica con le tecniche

di analisi della carica batterica su diversi campioni di prodotti alimentari, come la

carne macinata e i latti fermentati per poter, successivamente, verificare i risultati

ottenuti con la normativa vigente a livello legislativo in modo da valutarne

l’accettabilità e la conformità o come nel caso della carne, stabilire se il campione in

questione era stato oggetto di abusi di temperatura (4h a temperatura ambiente).

2. Materiali e metodi

2.1 Analisi microbiologica su