Domande e risposte microbiologia industriale e genetica

Batch

Il fermentatore è vuoto e lo carico con il terreno colturale e lo inoculo con il microrganismo. Il microrganismo è quindi inoculato all'interno del bioreattore che contiene un volume fisso e definito di terreno colturale. A questo punto imposto i parametri ottimali per la fermentazione. Aggiunte e prelievi importanti non vengono fatti durante il processo ma sono fatti alla fine della coltura. I prelievi fatti sono minimi e servono per fare dei controlli. Il V = V. è la coltura più facile da allestire. Il microrganismo cresce a spese del substrato infatti iniziale finale le curve sono analoghe e opposte. (es. birra)

Feed batch

Il fermentatore è pulito e vuoto, carico una minima quantità di terreno colturale, inoculo il microrganismo e faccio partire il processo con i parametri ottimali. Quando il microrganismo entra nella fase esponenziale inizio a aggiungere altro substrato senza fare prelievi. Quindi il volume della coltura aumenterà.

Nel tempo. Raggiunta la massima capienza la coltura viene scaricata. La coltura viene definita aperta in ingresso e chiusa in uscita. Faccio aggiunte nel tempo per i microrganismi che subiscono l'effetto di inibizione nel tempo come per esempio cerevisie con l'effetto crab tree. Il volume finale sarà maggiore di quello iniziale mantenendo la concentrazione del substrato sempre bassa (V <V ). Lo sviluppo avviene a spese dei nutrienti (S) con formazione di iniziale finale biomassa (X) superiori rispetto alla coltura batch in funzione di una maggior quantità di nutrienti introdotti.

Coltura continua

Si parte da un fermentatore pulito e vuoto, aggiungo volume che mi serve, inoculo, faccio partire processo iniziale la fase di latenza. Quando il microrganismo entra nella fase esponenziale apro due valvole contemporaneamente:

• Valvola ingresso del terreno colturale
• Valvola uscita del terreno colturale

Così facendo si instaura un sistema dinamico in cui il

microrganismo cresce e viene allontanato subito. Questo viene chiamato stato stazionario dove viene mantenuta costante la concentrazione del reattore. Va avanti per mesi come la produzione del quorn se riusciamo a istaurare condizioni stabili. Il volume è costante anche se il sistema è dinamico. Viene definita coltura aperta in ingresso e in uscita. (V = V) iniziale finale 9 Federico Tagliabue 18.

Caratteristiche di un antischiuma ideale. All'interno del fermentatore si formano delle bolle che portano alla formazione di schiuma. Essa non deve superare determinati livelli, per cui devo inserire degli agenti antischiuma per provocare la dispersione immediata della schiuma.

Quello ideale deve:

• Avere rapida e buona dispersione nella coltura: disperdersi rapidamente abbattendo schiuma nel minor tempo possibile
• Avere buona attività anche a bassa concentrazione e attività prolungata nel tempo
• Non tossico (né per noi né per lievito)

membrane cellulari• Velocità di crescita dei microrganismi• Produzione di metaboliti• Attività enzimatica• Stabilità dei prodotti formati• Sterilità del processo.La temperatura può essere controllata utilizzando diversi sistemi:• Scambiatori di calore• Serpentine di raffreddamento• Bagni termostatici• Termostati elettronici• Sistemi di riscaldamento e raffreddamento automatici• Controllo della temperatura tramite computer.Il sistema di controllo della temperatura deve essere in grado di mantenere la temperatura desiderata in modo stabile e preciso durante tutto il processo di fermentazione.

membrane cellulari• Viscosità della brodocoltura.

La temperatura tende a salire durante il processo, e posso tenerla controllata con:

• Camicia esterna
• Serpentina interna
• Scambiatore a piastre

La temperatura tende a salire a causa di:

• Reazioni esotermiche del metabolismo microbico
• Trasformazione dell’energia meccanica dell’agitatore in calore.

20. Differenza tra resa di conversione e resa di fermentazione.

Esistono 2 diverse forme di resa: resa di conversione e resa di fermentazione.

Resa di fermentazione = è più un dato industriale, è quanti grammi di prodotto (peso secco) ottengo da un litro di brodocoltura liquido. Si esprime in g/L. -1 -1 Per le biomasse microbiche varia da 20 a 40 g L (massimo 60 g L per la produzione di lievito)-1

Resa di fermentazione = g L

Resa di conversione (Y) = esprime l’efficienza di conversione da substrato a prodotto ossia esprime i grammi di prodotto formato rispetto ai grammi di substrato consumato.

In altre parole indica quanto il substrato è idoneo per dare il prodotto. È espressa come il rapporto tra il prodotto formato e il substrato che si consuma. È un numero adimensionale, in quanto rappresenta g/g, e varia tra 0 e 1. Se è zero è stato consumato substrato ma non è stato ottenuto il prodotto. Se è uno allora è il massimo dell'efficienza, tutto il substrato è stato trasformato in prodotto. Indica quanto è efficiente il mio processo microbiologico e indica quindi se ho fatto le scelte giuste di ingredienti. Per i substrati crioidratici è 0,5 perché la metà si perde in vie metaboliche. Per i prodotti complessi non riusciamo a calcolarli e quindi non sono applicabili per questa categoria di prodotto. Prodotto formato (g) = Y Substrato consumato (g) - Microbiologia Genetica e DNA: 1. Descrivi le tappe principali del protocollo di estrazione del DNA batterico. Il primo passaggio della maggior parte dei protocolli di estrazione del DNA batterico è la lisi delle cellule batteriche. Questo viene fatto utilizzando un detergente che rompe la membrana cellulare e rilascia il contenuto cellulare, compreso il DNA. Successivamente, si procede con la rimozione delle proteine e degli altri contaminanti presenti nel campione utilizzando enzimi proteolitici e solventi organici. A questo punto, il DNA viene precipitato utilizzando alcool freddo e centrifugato per separarlo dal resto del campione. Infine, il DNA precipitato viene lavato con alcool per rimuovere eventuali residui di contaminanti e quindi viene risospeso in un tampone appropriato per l'analisi successiva.

Una delle procedure analitiche consiste nell'estrazione del DNA totale dalle cellule batteriche in studio e nella sua purificazione mediante separazione dagli altri componenti cellulari.

Esistono numerosi protocolli messi a punto per la lisi cellulare dei diversi tipi di batteri, le fasi generali sono le seguenti:

1. Raccolta e lavaggio delle cellule cresciute in idoneo terreno
2. Risospensione in tampone + saccarosio (6%)
3. Lisi della parete cellulare mediante enzimi litici appropriati (lisozima solitamente), in combinazione con EDTA e un surfactante, come il sodio dodici solfato o SDS. Il processo di aggiunta di un agente litico avviene a pH 7-8, a 37°C per 30 minuti. Successivamente si aggiunge l'agente tensioattivo (SDS al 20%).
4. L'EDTA complessando i cationi bivalenti, destabilizza la membrana esterna dei Gram negativi, inibisce le DNAsiche altrimenti degraderebbero il DNA, mentre l'SDS aiuta a solubilizzare i lipidi di membrana. Se si lavora in condizioni isotoniche

(mediante aggiunta di saccarosio o glucosio al tampone di lisi) si evita lo scoppio dellacellula, indotto dalla rottura dei legami β 1-4 del peptidoglicano ad opera del lisozima; in questo modo si riduce ildanno alla struttura del DNA nativo. -Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilico -Centrifugazione e raccolta surnatante -L'estratto che si ottiene contiene una miscela complessa di DNA, RNA, proteine, lipidi, carboidrati e residuiparietali. Per purificare il DNA è necessario allontanare l'RNA, attraverso l'azione di una ribonucleasi (RNasi) e leproteine, attraverso l'azione di una proteinasi e di successive estrazioni con una miscela di fenolo/alcoolisoamilico o cloroformio. Quando la miscela è agitata, le proteine vengono denaturate e precipitano all'interfase;quindi gli acidi nucleici possono essere recuperati dalla fase acquosa sovrastante. -A questo punto si può procedere alla precipitazione.

selettiva del DNA, con doppio volume di etanolo, per ottenere la concentrazione del DNA. Il precipitato di DNA, raccolto sul fondo della provetta dopo centrifugazione, può poi essere ridisciolto in tampone fino ad ottenere una idonea concentrazione.

2. Descrivi i principi su cui si basa l'elettroforesi in gel di agarosio.

Il DNA in studio viene visualizzato attraverso una corsa elettroforetica i cui principi fondamentali sono:

• una molecola carica posta all'interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di carica opposta (il DNA ha carica netta negativa)
• in un gel costituito da un polimero organico, molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica) migrano con velocità diverse, perché le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie di un gel.

È così possibile visualizzare il DNA facendolo migrare all'interno di un supporto solido (gel) e colorandolo opportunamente.

3.

Descrivi la curva di costruzione e denaturazione termica del DNA batterico. Il DNA possiede una caratteristica di estrema importanza, ossia la capacità di riassociare o dissociare i propri due filamenti che lo compongono in maniera reversibile in determinate condizioni controllate di temperatura. Tale processo, mediato dalla temperatura, viene seguito attraverso la costruzione di una curva, nota come curva di denaturazione termica del DNA.

Come si può osservare il valore di assorbanza aumenta all'aumentare della temperatura: a parità di concentrazione iniziale, l'aumento di assorbanza è da correlare al fenomeno noto come ipercromocità delle basi nucleotidiche, vale a dire che quando le basi nucleotidiche non sono legate a formare il doppio filamento, si ha un aumento di assorbanza perché le singole basi assorbono maggiormente. Questo implica che quando, per effetto della temperatura, si rompono i legami idrogeno che tengono uniti i due filamenti di DNA,

no essere spezzati.