Domande microbiologia industriale

Domande microbiologia industriale

Elementi principali di un processo microbiologico industriale

Un processo microbiologico industriale può essere rappresentato da un’equazione: S + x P; dove S rappresenta il substrato, ovvero gli ingredienti del terreno colturale, X è il microrganismo, la freccia rappresenta il processo produttivo e P il prodotto che si vuole ottenere. Il microrganismo può essere una popolazione mista, o una coltura pura selezionata oppure geneticamente modificato; in questo ultimo caso in campo alimentare ci sono numerose restrizioni in quanto i microrganismi devono appartenere ai GRAS, ovvero devono essere sicuri dal punto di vista della salute dell’uomo e non presentare caratteristiche di patogenicità.

L’azienda può provvedere a isolare i microrganismi da un habitat naturale oppure può rivolgersi a delle società che collezionano microrganismi, ovvero le collezioni ufficiali. Quando si deve fare una ricerca in un laboratorio è facile ottenere la coltura desiderata da parte delle collezioni pagando un prezzo simbolico; quando invece si ha un’azienda, questa ricava dal processo un profitto quindi è necessario fare una contrattazione con la società e spesso inoltre ci sono dei problemi di dogana. Le aziende preferiscono quindi prendere i microrganismi da un habitat naturale.

Il substrato ha un ruolo fondamentale nell’efficienza del processo fermentativo in quanto rappresenta il 40% dei costi totali, la quantità di substrato utilizzata è sempre enorme quindi la formulazione degli ingredienti deve essere fatta con cura; il substrato deve essere economico ma funzionale, ovvero deve permettere la crescita dei microrganismi. Bisogna quindi tener conto del costo, della disponibilità, della possibilità di stoccaggio, conservazione, deve essere sterilizzabile e non deve presentare problemi di tossicità o infiammabilità.

Il prodotto ottenuto deve essere conveniente dal punto di vista economico e competitivo altrimenti non ha senso avviare il processo produttivo; i prodotti ottenuti possono essere la biomassa e i metaboliti primari, ovvero essenziali per la vita del microrganismo, e si hanno nella fase di crescita quindi il processo deve essere fermato all’inizio della fase di decelerazione in quanto andare più avanti non ha senso: il fermentatore viene scaricato e si ricomincia il processo produttivo. I metaboliti secondari sono invece prodotti nella fase stazionaria quando le cellule vive equivalgono quelle morte e prendono avvio altre vie metaboliche; per ottenerli è quindi necessario allungare il processo produttivo fino alla fase stazionaria.

Ci sono poi i prodotti complessi in cui non è possibile fare una distinzione tra substrato e prodotto, il microrganismo non è separabile in quanto tutto è stato modificato e prende una forma diversa (yogurt); infine vi sono i prodotti da DNA ricombinante che sono molto importanti in campo farmaceutico.

Forme di resa

L’efficienza di un processo microbiologico industriale può essere rappresentata con due forme di espressione. La prima è la resa di conversione, ovvero il rapporto tra i grammi di prodotto ottenuto rispetto ai grammi di substrato consumato; si indica con Y: Y = P/S. I due termini hanno la stessa unità di misura quindi il numero ottenuto è adimensionale, non presenta unità di misura e varia da 0 a 1. La resa di conversione rappresenta la capacità del microrganismo di convertire il substrato in prodotto. Se si moltiplica il valore ottenuto per 100 può essere espresso in percentuale; Y rappresenta l’efficienza del processo produttivo considerando il substrato utilizzato: se Y=0 il substrato non viene convertito in prodotto e questo significa che il substrato utilizzato è sbagliato; quando invece Y=1 tutto il substrato viene convertito in prodotto e quindi la resa è del 100%, ovvero quella massima possibile.

Generalmente per le biomasse si ha una resa pari a 0,5, ovvero il 50% del substrato viene convertito in biomassa. La resa di fermentazione è invece un parametro impiantistico e si esprime come i grammi di prodotto ottenuto rispetto al litro di coltura utilizzata; l’unità di misura è quindi g/L o mg/L. Per le biomasse in genere si ha una resa di fermentazione pari a 20-40 g/L, ad eccezione del lievito da pane dove è pari a 60 g/L con Y = 0,5.

Queste due forme di resa sono facilmente calcolabili quando per i prodotti del metabolismo primario e secondario in quanto è facile distinguere il substrato, il prodotto e i litri di coltura utilizzati; quando invece si hanno prodotti complessi non è possibile utilizzarli in quanto non si riesce a distinguere cosa è prodotto e substrato.

Tipi di terreni

Un terreno colturale è un mix di ingredienti che permettono la crescita del microrganismo, l’aumento del numero di cellule e della biomassa, la produzione di ATP e quindi dei composti di interesse. In un terreno colturale sono sempre presenti una fonte di carbonio, una fonte di azoto, Sali inorganici e vitamine in quanto sono indispensabili per lo sviluppo microbico.

In particolare, esistono due tipologie di terreni: i terreni sintetici sono utilizzati principalmente in laboratorio in quanto sono fatti da materie prime pure che quindi sono molto costose e non sarebbero convenienti nel caso di un processo produttivo su scala industriale. Questi terreni sono di semplice standardizzazione in quanto si ha una ricetta che prevede l’aggiunta progressiva dei vari ingredienti e che porta alla formulazione di un terreno sempre uguale e con le stesse caratteristiche; tuttavia, non permettono di avere elevate rese di produzione di biomassa. Questi terreni non hanno problematiche di schiume e sono di facile purificazione.

I terreni complessi sono molto più economici in quanto sono costituiti da materie grezze che possono essere residui agro-alimentari; ad esempio, una fonte di carbonio grezza può essere il siero di latte che contiene lattosio. Tuttavia, c’è un problema di standardizzazione in quanto i lotti conferiti alle aziende non sono sempre uguali nella loro composizione che dipende dalla disponibilità, dalla stagione e dall’alimentazione; per ovviare a questo problema in genere si fa un mix dei vari lotti in modo da ottenere una rappresentazione media. I terreni complessi permettono di avere rese di crescita microbica più elevate in quanto negli ingredienti si possono ritrovare composti aggiuntivi che sono utili allo sviluppo dei microrganismi: ad esempio, nello sciroppo di glucosio sono contenute delle vitamine che permettono di favorire la crescita microbica e di aumentare quindi le rese. I terreni complessi sono di difficile purificazione, la composizione chimica non è facilmente determinabile e presentano sempre problemi di schiuma quindi è obbligatorio l’utilizzo di anti-schiume.

Per entrambi i tipi di terreni bisogna sempre tener conto che la resa di conversione, la resa di fermentazione e la velocità di conversione devono essere massime in modo da ottenere un processo produttivo conveniente dal punto di vista economico; la produzione di prodotti secondari deve essere ridotta e la materia prima deve essere continuamente rifornita.

Fonti di carbonio

La fonte di carbonio è il componente maggiormente presente in un terreno colturale; la classificazione delle fonti può essere fatta tenendo conto diversi parametri. Dal punto di vista dell’origine si hanno le fonti rinnovabili, ovvero di origine naturale come ad esempio la CO₂; le fonti non rinnovabili invece derivano soprattutto dall’industria petrol-chimica e dai gas naturali. Un’altra classificazione prevede la distinzione in base alla struttura chimica: le fonti carboidratiche derivano dagli zuccheri e possono essere in forma pura, ovvero monosaccaridi, disaccaridi, oligosaccaridi (maltodestrine) e polisaccaridi, oppure in forma grezza, come ad esempio il melasso, il corn-molasse, il liscivio solfitico o il siero del latte; le fonti non carboidratiche sono ad esempio gli acidi grassi che sono costituiti da carbonio e idrogeno a lunga catena.

Il melasso è un sottoprodotto dell’industria saccarifera, deriva dalla produzione del saccarosio che può avvenire a partire da due piante: la barbabietola da zucchero che si trova più nelle zone temperate ed è un tubero in cui è contenuto il saccarosio, oppure la canna da zucchero che è coltivata nelle zone tropicali subequatoriali ed è un arbusto ad alto fusto in cui il saccarosio è contenuto nel fusto. In entrambi i casi, la pianta viene tagliata a fettine sottili e posta in acqua: in questo modo il saccarosio lascia la matrice vegetale e solubilizza; una volta avvenuta la separazione, si ottengono la parte fibrosa che è uno scarto e la parte liquida che verrà eliminata dalle impurità. A questo punto la soluzione viene scaldata in modo da consentire la cristallizzazione del saccarosio grazie a una concentrazione e all’evaporazione dell’acqua; quando non è più conveniente continuare il processo, si ferma e si ottengono i cristalli di saccarosio e una soluzione con il 50% di zucchero che presenta una composizione diversa a seconda del tipo di pianta.

Nel caso della barbabietola da zucchero si ha il 50% di saccarosio e nessuna vitamina, mentre con la canna da zucchero si ottiene una soluzione con il 30-35% di saccarosio e il 20% di zucchero invertito, ovvero si hanno i due monomeri liberi in soluzione e che sono più dolci rispetto al disaccaride. Inoltre, nel caso della canna da zucchero si ha anche la biotina e una serie di vitamine che favoriscono la crescita dei microrganismi e quindi non è necessario aggiungerle in forma pura al terreno, riducendo così notevolmente i costi. Il melasso si identifica come un caramello scuro bruno con il 50% di zucchero; in genere le aziende prevedono sempre a importare una quota di melasso da canna da zucchero in modo da avere una quota di vitamine utili ai microrganismi.

Un altro tipo di melasso è il corn-molasse che deriva dall’estrazione dell’amido dal mais, dove si ha un residuo liquido con il 50% di glucosio e un quantitativo di Sali inorganici che spesso non sono tollerati da alcuni microrganismi quindi il suo utilizzo non è sempre possibile.

C’è poi l’high test molasse che è lo sciroppo di saccarosio, ovvero una soluzione trasparente con l’80% di zuccheri che quindi è più costosa ma necessaria in minor quantità in quanto è molto concentrata.

Altri tipi di fonti di carbonio grezze sono ad esempio il liscivio solfitico che è un sottoprodotto dell’industria della cellulosa nel legname: quando si produce carta si ha un residuo liquido che contiene vari zuccheri esosi, come glucosio, mannosio e galattosio, e zuccheri pentosi, come xilosio e aravinosio; tuttavia, gli zuccheri a 5C non sono utilizzati da molti microrganismi quindi l’utilizzo è limitato. La produzione di lisciviosi ha soprattutto nella Scandinavia e nell’Europa del Nord dove l’industria del legname è molto diffusa.

Un altro ingrediente è l’estratto di malto che deriva dalla maltizzazione dell’orzo, il quale è sottoposto a un processo di tostatura e germinazione; si tratta di una fonte molto utilizzata da lieviti e muffe.

Il siero del latte è un sottoprodotto del processo di caseificazione, è molto diffuso nel nord Italia e il suo smaltimento è un problema: dopo aver ottenuto la cagliata, rimane un siero contenente il 4-5% di lattosio quindi molto diluito; inoltre, lo zucchero è utilizzato da pochissimi microrganismi che devono avere l’enzima in grado di scinderlo nei due monomeri.

Un altro ingrediente è l’amido, ovvero un polimero del glucosio unito con legami alfa-1,4 e che può essere solubile o insolubile in base alla lunghezza della catena e delle ramificazioni; per essere utilizzato come insolubile è necessario inserire nel terreno anche delle amilasi e può derivare dalla patata o dal mais.

La cellulosa è una fonte a bassissimo costo, è un polimero del glucosio unito con legami beta-1,4 e proprio per questo è utilizzato da un numero molto limitato di microrganismi.

Le fonti non-rinnovabili non carboidratiche sono diverse: il più semplice è il metano CH₄, ovvero un gas che per essere inserito nel terreno deve essere sciolto, è di origine fossile e un sottoprodotto dell’industria petrol-chimica; presenta un elevato grado di purezza ma in presenza di ossigeno causa forti esplosioni quindi presenta problemi di sicurezza.

Il metanolo è invece un liquido quindi è solubile nel terreno, tuttavia è altamente tossico e per ovviare questo problema si può provvedere alla sua aggiunta nel terreno in piccole quantità con un rifornimento in feed; esso causa reazioni fortemente esotermiche che necessitano la presenza di aria. L’etanolo è un liquido, è meno tossico del metanolo, tuttavia è soggetto alla tassa di monopolio quindi il suo costo è importante.

Ci sono poi le paraffine che sono costituite da idrogeno e carbonio, sono di lunghezza variabile e le più utilizzate sono quelle con 12-18 atomi di carbonio; sono sottoprodotti dell’industria petrolifera quindi il loro costo non è fisso, varia in base a quello del petrolio. Sono composti solidi che vengono consumati dai microrganismi e spariscono nella coltura.

Infine, ci sono le fonti rinnovabili non carboidratiche che sono rappresentate dagli oli di origine naturale; questi possono essere vegetali e quindi di soia, lino, girasole, cotone, mais, oppure animali come l’olio di fegato di merluzzo o di lardo, i quali conferiscono un forte aroma al prodotto finale che si andrà ad ottenere.

Fonti di azoto

La fonte di azoto è il secondo ingrediente principale di un terreno colturale; in particolare, si possono avere fonti di azoto inorganiche, ovvero Sali di ammonio, ammoniaca gassosa e idrato di ammonio, o fonti organiche, come urea, amminoacidi e proteine. Per ridurre i costi e non utilizzare materia prime pure si possono utilizzare ingredienti grezzi; il più adoperato è il corn steep liquor, ovvero un residuo che si ottiene prima dell’estrazione dell’amido dal mais: la pannocchia viene tagliata a strisce sottili e posta in acqua a 40-45°C con anidride solforosa. Si aspettano due giorni in modo da permettere la fermentazione da parte dei batteri lattici termofili naturalmente presenti nel vegetale; in seguito si ottiene quindi una soluzione contenente acido lattico e proteine che costituiscono l’acqua di macerazione, la quale venendo concentrata diventa uno sciroppo viscoso molto scuro che ha una composizione variabile in base al vegetale di partenza. È una fonte molto utilizzata ma che è acida quindi bisogna tenere sotto controllo il pH.

Un altro ingrediente possibile sono le farine di semi, in particolare di soia e cotone che si ottengono dall’estrazione dell’olio grazie all’utilizzo di un solvente; i residui di solvente vengono eliminati e si ottiene una farina con il 50% di proteine e priva di grassi in quanto è stata disoleata. Essa presenta un buon livello di amminoacidi e quindi può essere utilizzata come fonte di azoto.

Infine, è possibile utilizzare la borlanda di distilleria, ovvero il residuo che deriva dal processo di distillazione dell’etanolo svolto a partire da una matrice zuccherina che può essere un melasso; a questo viene aggiunto un lievito che opera una fermentazione e produce etanolo. L’etanolo viene recuperato per evaporazione e si ottiene un residuo contenente le cellule di lievito morte con le proteine.

Fattori di crescita di impiego industriale

I fattori di crescita di impiego industriale sono due: le vitamine e i Sali minerali. Le vitamine sono fondamentali per lo sviluppo microbico e per le reazioni metaboliche; esse se inserite come pure nel terreno colturale sono molto costose quindi si cercano ingredienti grezzi che ne contengano una quota significativa e utilizzabile. Un possibile ingrediente è l’estratto di lievito, ovvero cellule di lievito lisate trattate termicamente che sono quindi inattive ma che presentano un buon contenuto di vitamine che quindi possono essere utilizzate come polvere o pasta; le cellule non possono essere utilizzate come fonte di azoto perché sono molto costose ma in piccole quantità possono essere aggiunte al terreno per il contenuto di vitamine.

Un’altra possibilità è rappresentata dall’idrolizzato di caseine che deriva dal settore del latte; si tratta delle proteine del latte che contengono amminoacidi nobili e le vitamine tipiche dell’ambiente del latte. Il composto può essere ottenuto per idrolisi acida o enzimatica: l’idrolizzato acido è poco costoso, ma contiene un elevato contenuto di sale che non è tollerato da tutti i microrganismi; l’idrolizzato enzimatico invece è più caro ma il contenuto di sale è molto minore e quindi trova maggiore impiego.