Domande e Risposte fermentazioni industriali

Equazione di Monod e crescita della biomassa

Se consideriamo l'equazione di Monod e dato che u è funzione della concentrazione del substrato in teoria è possibile fissare dei valori definiti di crescita di u in funzione di S soprattutto fra 0 e Umax variando S. I parametri coinvolti sono i seguenti:

• V: volume costante (L, m³)
• F: flusso costante (L/h, m³/h)
• S: conc. iniziale S limitante
• 0S: conc. S residuo

Parametro caratterizzante la coltura continua è la velocità di diluizione D data da F/V. La velocità di diluizione viene misurata in ore^-1 quindi si definisce come il numero di cambiamenti di volume nell'unità di tempo mentre 1/D rappresenta il numero di residenza o tempo medio di residenza della coltura nel bioreattore espresso con t (holding time). La variazione di biomassa nel tempo viene misurata con dx/dt = crescita μx - output Dx/dt. Se non c'è variazione di biomassa il sistema ha raggiunto lo stato stazionario la variazione di substrato dx/dt = 0.

nel tempo si misura dS = input - output - S utilizzato [sviluppo] - S utilizzato [prodotto]dt. S viene considerato esclusivamente per lo sviluppo e non per la formazione di prodotto. Se non si ha variazione di substrato nel tempo avremo lo stato stazionario (dX/dT=0) che significa μxDS - DS - = 0. Yx S xS - S = (x = Y S - S0) Y0. Se togliamo D e u diventa poi visto che D e u sono collegati, u si modifica agendo su D e visto che il volume (V) è costante si agisce sul flusso (F). F = Vflusso (F) in stato stazionario. U viene controllata da D, variabile sperimentale ed è fondamentale determinarla per gestire la coltura continua. Agendo sul flusso (F) riducendolo progressivamente si ottengono corrispondenti riduzioni alla velocità di diluizione D fino a flusso nullo come in coltura batch x(x) concentrazione biomassa stazionaria alla steady state del substrato S (S). D crit (velocità di diluizione critica) -1. Mentre se aumenta il flusso...

aumenta D fino a raggiungere un D critico dove corrisponde anche a umax

Se D> Umax il sistema diventa instabile ( wash-out) dove le cellule vengono dilavate all’ esterno delfermentatore prima che abbiano il tempo di riprodursi sarà necessario quindi trovare un equilibrio nell’ottenere un alta velocità senza raggiungere il wash-out.

Tuttavia non è impossibile gestire la coltura incondizioni di D>Umax a patto tuttavia di prevedere un sistema che ricicla le cellule utilizzate in cui èprevisto un sistema di separazione come una centrifuga per ottenere due flussi ( uscita e riciclato).

Unesempio di applicazione è la coltura fed-bach utilizzato in casi di inibizione di substrato ( aggiunto infunzione della velocità di consumo di s) e prodotto ( effetto dluizione).

La coltura viene continuamentealimentata senza uscita di brodocoltura, il feed è costituito da un singolo nutrilita di cui è assente il terrenooppure da

terreno colturale completo ( di solito è la soluzione che si fa in fed batch). L' unica limitazione vera e propria è dovuta dal volume del reattore. Si adatta bene alla produzione di metaboliti non associati allo sviluppo microbico rispetto alla coltura batch e continua a patto di avere alte concentrazioni cellulari a cui seguirà una fase biosintetica. Tenendo conto che la biomassa deve essere vitale ossigeno in eccesso e presenza di un substrato limitante e gli altri invece presenti in eccesso, Viene interrotta per calo di produzione ( perdita vitalità della biomassa) oppure max volume del reattore raggiunto. Viene condotta con feed diluito ( V variabile) o con V costante quindi feed concentrato. Questa tipologia permette di ottenere biomassa e metaboliti secondari e di controllare le condizioni di flusso e feed tuttavia le contaminazioni sono probabili ( meno che in continua e selezione di mutanti basso produttori) in continua invece avremo efficienza

produttività e qualità costante ma contaminazioni frequenti poco versatili

Esistono varie tipologie ed applicazioni: Il chemostato dove la coltura presenta il substrato mai in eccesso quindi la concentrazione di S limitante influenza la velocità di crescita e il turbidostato dove gli elementi del terreno sono in eccesso (micro cresce a u max) lasciando la torbidità sono applicate nel settore delle alghe.

Cheomostato: Viene effettuata modificando l'impianto per la coltura batch la coltura viene gestita sfruttando l'impiego di due pompe una che porta il terreno nel reattore e la seconda all'uscita dal reattore per poi essere prelevata, oppure si possono utilizzare dei sistemi di controllo di livello (sistema di troppo pieno) assieme all'azione di una pompa

Il volume delle coltura deve rimanere costante, sul dispositivo dei gas in uscita è posizionato un condensatore, il vapore acqueo presente nel flusso d'aria in uscita

condensa e di conseguenza l'acqua ricade nel reattore (ecco perché il volume resta costante). Tuttavia, va ricordato che le colture aerobie in condizioni di turbolenza, per effetto dell'agitazione, possono presentare problemi nel mantenere il volume costante. Pertanto, il punto di prelievo della coltura va posto in un punto di scarsa turbolenza. Il controllo del volume dipende da una serie di fattori. Vediamo come funzionano i sistemi di controllo accennati in precedenza: i dispositivi "a troppo pieno" sono dei sistemi semplici, poco costosi e di facile installazione. Il volume della coltura dipende da dove è posto il prelievo, che possono essere sia interni che esterni. Una problematica frequente è la formazione di schiuma, ma questi dispositivi (su cui è posto un congegno a forma di T) minimizzano il fenomeno, oltre che riciclare le cellule nel reattore. Di solito vengono impiegati sistemi che operano a livello variabile. I dispositivi a pompa sono piùcostosi rispetto ai precedenti il punto di prelievo è sotto il livello del liquido il volume del liquido prelevato è uguale al volume del liquido immesso ( vedere funzionamento pompe)I dispositivi a manometro due "braccia" testa del fermentatore ( esterno) e fermentatore stesso, l'aumento della biomassa esercita una pressione sulla membrana ( viene cambiata di frequente perché rischia di perdere elasticità) collegata al braccio esterno, aumenta quindi il livello del liquido nel braccio esterno che funge da manometro la variazione è rilevata dalla valvola che invia un segnale che fa aprire il sistema di prelievo posto sulla base del fermentatore si ottiene così lo scarico di circa 50 mL fino a riportare il volume al valore inizialeI dispositivi load cell usato in fermentatori con >30L molto costoso se basse D sistema stazionario molto instabile e disturbato insensibile all' effetto schiuma, il suo funzionamento prevede che

Quando il peso del sistema supera il set point impostato, parte una pompa che scarica il peso in eccesso.

L'allestimento della coltura chemostato: La coltura in condizioni batch inizia quando il microrganismo entra in fase esponenziale, D<Umax, in stato stazionario Biomassa S e P costanti nel tempo sistema stabile setempo di residenza maggiore della diluizione Tr>D (vedi slide esempio numerico).

Le problematiche principali sono la presenza e quindi inquinamento di mutanti spontanei che cresce in relazione tra velocità di popolazione nativa uN e contaminante uC che se maggiore prenderà il sopravvento, uguale crescono in maniera costante, minore non prenderà il sopravvento.

Un esempio è l'instabilità plasmidica (ricordando che il plasmide è un entità autoreplicante non essenziale per la crescita del microrganismo) prodotta o meno dal microrganismo.

Processi industriali acidi organici

Acido lattico

Acido citrico

ac. citrico

inibisce la PFK- manganese e• + ammonio

rimozione inibizione antagonizza l’inibizione

blocco Occorre bloccare•metabolico l’aconitasi- ferro e - manganese• + rame (compete con• il ferro e il manganese)

Per accumulare acido citrico si devono controllare melasso e acqua e nel terreno colturale gli ioni ferro e manganese vanno mantenuti ai livelli minimi

Acido gluconico

Domande “3 tipologia” miste

Meccanismi di accumulo dei metaboliti microbici

I microrganismi hanno capacità biochimiche molto vaste e questa loro versalità permette di ottenere nuove molecole dai processi fermentativi. Esistono due tipologie di metabolismo: Aerobico e anaerobico. I prodotti finali del metabolismo anaerobico sono spontaneamente accumulati (come acido lattico) mentre nel metabolismo aerobico grazie ad opportune strategie si possono ottenere accumuli di intermedi metabolici come costituenti cellulari sintetizzati in eccesso rispetto alle funzionalità della

cellula all' internoo all' esterno e i metaboliti accumulati all' esterno della cellula. Il metabolismo microbico in ogni caso è costituito da una fase catabolica (di degradazione) e anabolica (biosintesi) queste due fasi servono per produrre energia necessaria ai processi vitali del microrganismo ottenuta dalla trasformazione degradativa dei nutriliti. Ogni reazione è controllata da meccanismi di controllo per regolare il metabolismo del microNel metabolismo aerobico si ha generazione di bassi livelli di energia ATP, il substrato viene utilizzato in larga misura in fase catabolica mentre in fase anabolica si formano limitati livelli di energia. Oltre all' accumulo spontaneo di metaboliti finali) rigenerazione del potere riducente (NADH a NAD) è ottenuta per trasferimento degli elettroni e degli atomi di idrogeno non all' ossigenoma ad altre molecole che vengono ridotte e accumulate come tali (prodotti finali) (ad es. acido piruvico a dare

acido lattico)

Vediamo adesso il metabolismo aerobio, solo una limitata quota del substrato viene utilizzata per il catabolismo, pertanto avremo una fase anabolica molto spinta con produzione maggiore di energia (ATP) rispetto al metabolismo aerobico. Il NADH (potere riducente) è riossidato per trasferimento degli elettroni all'ossigeno, che funge da accettore terminale. I prodotti finali del metabolismo aerobico sono principalmente costituiti da cellule, anidride carbonica e acqua, senza che si abbiano significativi accumuli di intermedi metabolici. Attuando opportune strategie è possibile ottenere dei ceppi in grado di fornire metaboliti non spontaneamente accumulabili, tuttavia è necessaria un'ottima conoscenza dei meccanismi enzimatici dato che sono fondamentali per regolare e modificare il processo fermentativo. L'utilizzo di