Biotecnologie genetico-molecolari modulo di fermentazioni industriali (con domande d'esame)

Andamento di X e S in funzione di D

In coltura continua, riducendo progressivamente il flusso (F), si ottengono corrispondenti riduzioni della velocità di diluizione (perché il volume è costante), fino ad arrivare ad un flusso nullo, condizione corrispondente alla coltura batch (sistema chiuso: né entrate, né uscite).

Supponendo di essere in coltura batch, il processo inizia con S emicrorganismo (x): x ha una fase di latenza e quando accelera inizia a consumare S e successivamente inizia la fase esponenziale. Aprendo le valvole di ingresso e uscita, la D inizia a crescere. Il valore zero di D è la coltura batch.

Aumentando progressivamente F, la concentrazione di S che esce aumenta, mentre la concentrazione di x nel bioreattore è stabile inizialmente, e poi inizia a scendere. Inoltre, si hanno incrementi della velocità di diluizione, fino a raggiungere un valore di D critico. Si arriva a un punto in cui il microrganismo fa fatica a crescere.

perché non appena cresce viene dilavato. Questo punto viene definito D critico (D ), ovvero il punto in cui il microrganismo cresce a μ (punto di massima efficienza). Per valori di D > μ il sistema diventa instabile: si raggiunge la condizione di wash-out, ovvero in cui le cellule sono dilavate all'esterno del fermentatore prima che abbiano il tempo di riprodursi. Fra i due estremi vi sono infinite possibili condizioni di equilibrio, ma a fini pratici si cerca di instaurare la condizione che consenta di ottenere un'alta velocità di crescita senza raggiungere il wash-out.

CHEMOSTATO E ATTREZZATURE ACCESSORIE

La coltura in chemostato può essere effettuata modificando opportunamente l'impianto usato per la coltura batch.

GESTIONE MEDIANTE DUE POMPE

La coltura deve avere due flussi uguali e costanti, questo aspetto può essere gestito usando due pompe che lavorano in modo sincrono (alla stessa portata): una aggiunge il

punto di prelievo deve essere posto in una zona di scarsa turbolenza: ad esempio, se si lavora con iltroppo pieno servono delle accortezze, perchè la zona alta presenta molta schiuma.

La scelta del sistema di controllo del volume dipende da diversi fattori:

• Tipo di microrganismo: se miceliare o unicellulare;
• Tipo di fermentazione: aerobia o anaerobia;
• Terreno colturale (solubilità, miscibilità): in particolare la sua formulazione, le paraffine adesempio tendono a galleggiare;
• Dimensioni del fermentatore;
• Grado di accuratezza: 5% variazione accettabile;
• Costi.

1. DISPOSITIVI A TROPPO PIENO

Si tratta di un sistema semplice, poco costoso e di facile installazione. Il volume della coltura dipende dal livello a cui è posto il prelievo: a un certo punto del fermentatore viene saldato un tubo, che può essere interno o esterno.

Per evitare alcune problematiche, tra cui la formazione di schiuma, vengono attuate alcune strategie: il tubo di prelievo è un

dispositivo a T che pescaleggermente sotto il livello di massimo, in modo da non recuperare la parte dicoltura sulla superiore che potrebbe non essere rappresentativa del campione.

Un'altra strategia è il sistema di recupero delle cellule che possono essere riciclate nel bioreattore, nel caso in cui sia necessaria una concentrazione molto elevata di cellule.

Nel caso dei microrganismi filamentosi, c'è il rischio che si attacchino al dispositivo di troppo pieno, intasandolo (causando quindi un blocco del sistema).

Utilizzando invece substrati idrocarburici (quali le paraffine), non miscibili in acqua, galleggiano con rischio di rimozione nel flusso in uscita.

Il problema dei dispositivi a troppo pieno, è che sono fissi: è un problema se l'azienda decide di essere versatile. Può essere utile, quindi, avere un dispositivo a troppo pieno con tubo variabile. È possibile operare a diversi livelli, ma è opportuno fare attenzione alle guarnizioni.

stesso, l'altro da un tubo esterno collegato alla testata del fermentatore. Questo dispositivo si basa sulla deformazione di una membrana posta alla base del reattore. Questa membrana percepisce e si deforma in base al peso della biomassa che cresce. La membrana è posta tra la coltura e una soluzione acquosa che arriva (tramite un tubo) fino a un livello in cui è presente un lettore (i). La variazione è rilevata dalla valvola che invia un segnale che fa aprire il sistema di prelievo posto sulla base del fermentatore. Si ottiene così lo scarico di circa 50 ml fino a riportare il volume al valore iniziale. La membrana tende a perdere l'elasticità e va cambiata frequentemente, perché altrimenti il sistema non funzionerebbe.

4. LOAD CELL

Questo dispositivo è impiegato per fermentatori di capacità > 30L. Si tratta di un sistema costoso. Funziona pesando il reattore: è presente una piattaforma su cui è montato il fermentatore,

cheviene pesato. Una volta superato il set point, si attiva un sistemadi controllo su una seconda pompa, che scarica l'eccesso dipeso.

ANDAMENTO DI BIOMASSA E SUBSTRATO IN COLTURA CONTINUANella coltura tradizionale, quindi nel reattore, in ogni momento ein ogni punto si ha una concentrazione allo steady state, stabile diprodotto e di substrato.

Nel reattore tubolare, la coltura compie un percorso neltempo: all'inizio dove viene inserito il substrato, si rileva un'alta concentrazione di substrato e bassa.Continuando il percorso, le cellule consumano il substrato e contemporaneamente si forma il prodotto.

Si tratta quindi di un sistema eterogeneo: la concentrazione di S e P varia in base al punto diprelievo.

ALLESTIMENTO CHEMOSTATOLa coltura parte in condizioni batch: quando il microrganismo entra in faseesponenziale, l'alimentazione ha inizio e di conseguenza inizia la colturacontinua. L'inoculo ha una fase di latenza, inizia a svilupparsi e poi entra in

fase esponenziale (μ ). A questo punto si inizia ad attivare il flusso di ingresso e uscita max μ contemporaneamente. La velocità di diluizione D non deve eccedere la max. In termini pratici si raggiunge lo steady state quando le concentrazioni di biomassa, substrato e prodotto rimangono costanti nel tempo. Il sistema è stabile quando il tempo di residenza è maggiore della velocità di diluizione: T > Dr

INCONVENIENTI

INQUINAMENTO E INSTABILITÀ GENETICA

Più la coltura continua è attiva, più vengono diminuiti i tempi morti. L'elevata durata di processo crea uno stress sui microrganismi. L'inquinamento o l'instabilità genetica (il microrganismo degenera, ad esempio perdendo plasmidi o crescendo in modo anormale) possono essere un serio problema per le colture a lungo periodo. Possono presentarsi diversi casi in funzione della velocità di crescita del microrganismo mutato o contaminante (μ ) rispetto al

microrganismo originale o nativo (μ): c n- μ > μ: la popolazione contaminante prende il sopravvento, rubando il nutrimento alc nmicrorganismo nativo (grave a bassa D);- μ = μ: la popolazione contaminante cresce in proporzione costante (poco grave se si hac nbasso livello di mutanti iniziali);- μ < μ: la popolazione contaminante non è in grado di prendere il sopravvento (problemic nsolo in presenza di alto livello di mutazioni iniziali).

INSTABILITÀ PLASMIDICA

Il plasmide è un’ entità autoreplicante non essenziale per la crescita del microrganismo, che può essere introdotto artificialmente nel microrganismo, per cui può esprimere una molecola che naturalmente non produrrebbe (insulina da E. coli). La presenza del plasmide è legata alla sua possibilità di replicarsi ed essere quindi presente anche nella cellula figlia, se questo non avviene le cellule prive di plasmide prendono presto il sopravvento.

• Inserimento nel plasmide del gene che codifica la resistenza ad un certo antibiotico: in un terreno contenente l'antibiotico sopravvivono e si replicano solo le cellule contenenti il plasmide. Inoltre, conservandole nel terreno contenente l'antibiotico, manterranno la loro resistenza;
• Eliminazione del gene (dal genoma) che esprime un componente essenziale per la cellula; il gene è poi introdotto nel plasmide: le cellule contenenti il plasmide si riproducono, quelle prive di plasmide no.

INFLUENZA DI D SU X E S

In coltura continua lo sviluppo della biomassa è limitata dalla sola concentrazione del substrato limitante, mentre gli altri nutrienti sono presenti in eccesso. In funzione dei diversi valori di D si possono configurare diverse possibilità.

1. La velocità di washout della biomassa x è